全 文 ：生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN·研究报告· 2008年第 6期
收稿日期：2008-04-30
基金项目：国家自然科学基金资助项目（30371099），辽宁省自然科学基金资助项目（20052139）
作者简介：陈秋实（1981-），硕士学位，研究方向：水产养殖繁育；E-mail：qiushi-01@163.com
通讯作者：李霞，教授，E-mail：lx@dlfu.edu.cn
海参具有超强的再生能力，在自切排脏后，当环境条件适合时能很快再生出各种新的功能完善的内脏
器官。 研究海参的再生，不仅对水产养殖业具有重要的实践指导意义，而且为寻找及研制各种有应用价值
的促进再生的生物物质和设计更理想的促进再生的人工基质提供有价值的线索，为研究高等动物（尤其是
人类）的细胞分化、组织修复的确切机制和再生修复潜能的激发等相关问题奠定了理论基础。另外，研究海
参的再生也为研究组织、器官的发生提供了一个独特的动物模型。
迄今为止， 国内有关海参再生的报道仅局限于关于海参具有再生能力的特征性描述， 对其再生的方
式、过程、机制等还未做过进一步的研究 [1]。 国外学者对海参内脏器官和神经系统的再生以及海参被横切
后的再生进行了研究 [2~5]，研究方法主要涉及到了肉眼观察、组织切片观察和单克隆抗体等多种实验技术，
但分子水平上的研究明显落后于其它物种。关于刺参再生机理的分子水平上的研究，国内外至今尚未见报
道。 仅就刺参表皮再生中的基因表达做以初步探讨，为进一步在分子水平上揭示其再生机制提供线索。
1 材料和方法
1.1 材料
实验所用刺参为 1~2 龄个体，体重为 60~90g，体长（麻醉状态下）为 15~22cm。 取自大连龙王塘海域，
为自然生长的个体。 刺参采回后在我院重点开放实验室水槽内暂养，饲养用水为砂滤海水，每天 4/5 换水
利用差异显示法研究刺参表皮再生相关基因
陈秋实 李霞 段晶晶 周伯文
（大连水产学院 农业部海水增养殖学与生物技术重点开放实验室，大连 116023）
摘 要： 应用mRNA差异显示法对刺参（Apostichopus japonicus）正常表皮组织和手术后再生的表皮组织的基因
的差异表达进行了分析。利用经本实验室摸索改进的mRNA差异显示体系，获得了若干差异片段，将其测序结果在
GenBank数据库中比对发现，其中一个差异片段与CD151基因具有较高的同源性，并且采用RT-PCR的方法对差异片
段进行了验证。进一步分析表明，该基因可能与表皮的再生密切相关。
关键词： 刺参 表皮再生 mRNA差异显示
Studies on Genes of Cuticle Regeneration Using Differential
Display Method in Apostichopus japonicus
Chen Qiushi Li Xia Duan Jingjing Zhou Bowen
（Key Laboratory of Mariculture and Biotechnology，Agriculture Ministry，Dalian Fisheries University，Dalian 116023）
Abstract： Differential display reverse transcript polymerase chain reaction（DDRT-PCR）was applied to study gene
expression in normal cuticle and regeneration cuticle of the sea cucumbers（Apostichopus japonicus）. mRNA differ nti l
display system was improved and several differential expression cDNAs were obtained using this method. Blast results
from GeneBank showed that one of these fragments was highly homologous with partial sequence ofCD151 gene，and it
was also proved by RT-PCR. Sequence analysis showed that the gene may relate to regeneration.
Key words： Sea cucumber Cuticle regeneration mRNA differential display
2008年第 6期
量，盐度为 30~32，水温为 17℃~19℃，投喂人工配合饲料。
1.2 取样处理
用手术刀切掉刺参体壁表皮，分别于手术后 48h、72h 取样，作为 48h 和 72h 试验组（记作 48T 和 72T）；
同时取未手术正常生长的刺参表皮为对照组（分别记为 48C 和 72C）。 取样前用 0.45μm 滤膜过滤的海水清
洗刺参体表，且所有使用器具均经灭 RNA 酶处理。 取样表皮组织约 1cm2，重 50~100mg，取下后迅速投入液
氮中冻存。
1.3 总 RNA 的提取和反转录
由于刺参体壁组织富含胶原蛋白、多糖以及色素，所以总 RNA 的提取方法在 TRIzol 试剂（Invitrogen 公
司）抽提指南的基础上加以改进 [6]。 采用样品在液氮中研磨并用 TRIzol 匀浆后再进行抽提；对 TRIzol 一步
法提取的总 RNA 进行 DNaseⅠ消化和酚氯仿抽提，用 2.5mol/L 醋酸钾沉淀，并加入适量糖原（10mg/ml）与
RNA 共沉淀。 取 2μlRNA 在紫外分光光度计上检测其质量及浓度，再取 2μl 在非变性琼脂糖胶上电泳检测
其完整性。 反转录遵照反转录试剂盒（TaKaRa 公司）说明操作，锚定引物（Sangon 公司）为 T7-oligo（dT）14。
1.4 PCR 扩增
对各组 cDNA 样品分别用 12 种 3 端锚定引物和 20 种 5 端随机引物组合进行扩增，对各再生阶段的
试验组和对照组分别进行比较（引物序列见表 1）。


(5~3)

(5~3)
A1 ACGACTCACTATAGGGCTTTTTTTTTTTTGA RP6 ACAATTTCACACAGGATACAACGAGG
A2 ACGACTCACTATAGGGCTTTTTTTTTTTTGC RP7 ACAATTTCACACAGGATGGATTGGTC
A3 ACGACTCACTATAGGGCTTTTTTTTTTTTGG RP8 ACAATTTCACACAGGATGGTAAAGGG
A4 ACGACTCACTATAGGGCTTTTTTTTTTTTGG RP9 ACAATTTCACACAGGATAAGCCTAGC
A5 ACGACTCACTATAGGGCTTTTTTTTTTTTCA RP10 ACAATTTCACACAGGAGATCTCAGAC
A6 ACGACTCACTATAGGGCTTTTTTTTTTTTCC RP11 ACAATTTCACACAGGAACGCTAGTGT
A7 ACGACTCACTATAGGGCTTTTTTTTTTTTCG RP12 ACAATTTCACACAGGAGGTACTAAGG
A8 ACGACTCACTATAGGGCTTTTTTTTTTTTCT RP13 ACAATTTCACACAGGAGTTGCACCAT
A9 ACGACTCACTATAGGGCTTTTTTTTTTTTAA RP14 ACAATTTCACACAGGATCCATGACTC
A10 ACGACTCACTATAGGGCTTTTTTTTTTTTAC RP15 ACAATTTCACACAGGACTTTCTACCC
A11 ACGACTCACTATAGGGCTTTTTTTTTTTTAG RP16 ACAATTTCACACAGGATCGGTCATAG
A12 ACGACTCACTATAGGGCTTTTTTTTTTTTAT RP17 ACAATTTCACACAGGACTGCTAGGTA
RP1 ACAATTTCACACAGGACGACTCCAAG RP18 ACAATTTCACACAGGATGATGCTACC
RP2 ACAATTTCACACAGGAGCTAGCATGG RP19 ACAATTTCACACAGGATTTTGGCTCC
RP3 ACAATTTCACACAGGAGACCATTGCA RP20 ACAATTTCACACAGGATCGATACAGG
RP4 ACAATTTCACACAGGAGCTAGCAGAC T7 GTAATACGACTCACTATAGGGC
RP5 ACAATTTCACACAGGAATGGTCGTCT M13 AGCGGATAACAATTTCACACAGGA
T7-oligodT 14 5-ACGACTCACTATAGGGCTTTTTTTTTTTTTT-3

表 1 引物序列
25μl PCR 反应体系为：10× PCR Buffer2.5μl，Taq 酶 1U，dNTP（各 2.5mM）2μl，MgCl2（25mM）1.5μl，锚定
引物 （10μmol/L）2.5μl，随机引物 （10 μmol/L）2.5μl，高纯水 11.75μl，cDNA2μl。 反应条件 ：95℃ 2min；94℃
15s，49℃ 30s，72℃ 90s（4 个循环）；94℃ 15s，60℃ 30s，72℃ 90s（36 个循环）；72℃延伸 5min，4℃保温。
1.5 聚丙烯酰胺凝胶电泳与银染
取 2μl PCR 产物， 在 8%的非变性聚丙烯酰胺凝胶 200V 恒压电泳。 电泳结束后取下凝胶， 用 0.1%
AgNO3 染色 7~10min，将染色液倒出，加入显色液，当凝胶上的条带隐约可见时将显色液倒掉，并立即用蒸
馏水冲洗 2 次，利用回染作用将带显现清晰，用数码相机或扫描仪记录实验结果。
1.6 差异片段的回收及重扩增
陈秋实等：利用差异显示法研究刺参表皮再生相关基因 125
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2008年第 6期
用煮沸法从测序胶的泳道中将具有明显差异的条带依次回收。 取回收液作为模板，用 M13 引物和 T7
引物（表 1）进行重扩增，循环条件与初次 PCR 完全相同，用 1.5%琼脂糖凝胶电泳检测确认。
1.7 差异片段测序、分析
将已确定的扩增产物送上海生工生物工程技术服务有限公司进行测序，测序引物为扩增片段上的 T7
序列和 M13 序列。 利用 BLAST 软件将测序结果与 nr 数据库中序列进行同源性比较分析。
1.8 RT-PCR 和测序验证
针对测序和比对结果，对差异片段进行 RT-PCR，并测序验证。 引物为 F1：5′-AATGGAAGCGAACTGGA
T-3′，R1：5′-ATGGTAACTCTATTGTGGC-3′。 内参 actin 序列为实验室前期工作确定，F：5′-CTCGTCGTATTCC
TGCTT-3′，R：5′-TGGTATCGCTGACCGTAT-3′。 以总 RNA 为模板进行 RT-PCR 反应，PCR 产物经琼脂糖凝胶
电泳分析，通过 BANDSCAN 软件对条带灰度进行计算，Excel 进行统计分析。
2 结果和分析
2.1 刺参表皮再生中的差异显示分析
通过对比各组差异显示结果发现，部分引物 PCR 结果存在明显差异，共获得差异条带 133 条（图 1）。


图 1 mRNA 差异显示结果
M:100bp marker；1:48C；2:48T；3:72C；4:72T
2.2 差异片段的同源性与碱基序列分析
对回收片段进行测序，并采用 Blastx 和 Blastn 2 种算法在 Blast 数据库中比对。 比对结果表明，其中一
个序列与 CD151 蛋白相似性较高（图 2），将其命名为 wr（body wall regeneration related）（表 2）。






图 2 wr 特异片段的核苷酸序列

 /bp    Score E GenBank
Wr 510 A7RP6-1 CD151  70.9 2e-11 BAD96906.1

表 2 wr 序列分析和同源性比对结果
2.3 RT-PCR 和测序验证
针对测序和比对结果对 wr 进行 RT-PCR 和测序验证 ，RT-PCR 扩增引物为 F1/R1， 扩增片段大小为
350bp（图 3）。
通过对电泳条带的灰度分析，在不同再生时间组中所验证基因的表达有明显差异，并且经测序分析得
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出扩增片段与原序列基本一致， 从而证明实验所
得片段非假阳性，结果可靠。
3 讨论
3.1 海参再生基因的研究
有关海参再生的研究报道， 国内主要是关于
海参具有再生能力的特征性描述，如郑法新等 [7]曾
报道刺参吐脏再生的组织学研究，李霞 [8]报道了刺
参体壁再生的细胞学过程。
国外学者对海参消化管、肌肉、水咽球、居维尔氏小管和肠内神经系统的再生以及海参被横切后的再
生进行了研究 [2~5]，分子水平的研究不多。 Mendez[9]在海参基因组 DNA 文库中发现 9 个 Hox-型再生基因序
列，由于 Hox 基因在结构和功能上都有很高的保守性，认为可能在海参肠的再生中起作用。 Santiago[10]在海
参肠组织 cDNA 文库中获得 971bp 的 cDNA，经过核苷酸序列和氨基酸序列测定，发现与高等脊椎动物相
比有高度保守性，为血清淀粉样 A（SAA）蛋白的同源蛋白 ，在海参肠再生过程中表达量明显高于正常组
织，其确切功能不清楚，可能参与肠形态发生和伤口愈合等。 Suarez-Castillo[11]在海参肠再生组织 cDNA 文库
中发现室管膜相关基因（EpenHg），该基因在肠的再生过程中大量表达，可能与肠内神经系统的再生有关。
本试验发现的表达 CD151 基因，丰富了海参再生基因的研究内容。
3.2 CD151 与刺参表皮再生
CD151 是 TM4SF 家族中与整合素作用最为密切的分子 ，TM4SF （transmember 4 super family， 亦称
tetraspanins）家族通过与整合素（integrin）紧密结合，在血管内皮细胞增殖、迁移及体外血管生成中起着重要
作用 [12]。 大量体外研究已经证实，CD151 通过与整合素的特异性结合，以 integrin-CD151-PKC 复合体模式完
成信号由胞外向胞内的传递 [13]，从而启动内皮细胞的黏附、迁移和血管的形成，CD151 在此过程中发挥跨
膜连接器的作用。 在 Matrigel 模型（模拟体外血管生成三维环境）研究中发现 CD151 具有明显促进血管内
皮细胞网格状及血管形成的能力，在血管生成及重塑中起关键作用；如果 CD151 作用，则体外血管形成明
显受抑 [14]。王丽等 [15]进一步证明 CD151 在体内也具有明显的促血管生成作用。目前已证实 CD151 具有正向
调控细胞迁移、黏附、铺展、组织形成、肿瘤转移和血小板聚集等功能，其信号传导途径主要是磷脂酰肌醇
4 激酶（PI4K）通路 [16]和 PKC 通路 [17]。 且有关专家认为，CD151 将为缺血性疾病的血管再生治疗提供新的靶
点 [18]。
刺参表皮损伤后，从组织学上讲，其修复过程为上皮细胞的增殖、迁移和分化，最终形成上皮组织，达
到修复受损上皮的目的， 此过程与血管内皮生成的组织学过程非常相似。 刺参表皮再生过程中 CD151 等
tetraspanins 家族基因大量表达，这不仅验证了 CD151 在组织损伤/修复反应过程扮演着重要角色 ，同时也
进一步说明 CD151 不仅在大鼠、 人等哺乳动物的血管内皮生成中起重要作用， 而且在棘皮动物的表皮再
生过程中也极有可能具有类似的功能。 说明血管内皮组织的形成和刺参表皮的再生过程不仅在组织学上
有着类似的生成过程，而且在分子水平上也存在着相同的依据，为进一步系统的理解皮肤再生过程提供又
一有力证据。
3.3 mRNA 差异显示体系的优化
本试验主要从总 RNA 提取和引物设计 2 个方面对差异显示方法进行了优化，结果证明优化的方法效
果更好。 首先，由于刺参体壁组织富含胶原蛋白、多糖以及色素，所以提取总 RNA 时在 TRIzol 一步提取法
的基础上加以改进。 其次，在引物设计方面，参考了王夏的方法，在锚定引物 5 端加一段 T7 启动子序列，
在随机引物 5 端加一段 M13（-48）反向序列，这 2 种来源于原核生物的引物尽可能的降低了真核 mRNA
序列中非特异性扩增的机会 [19]。 而且，T7 启动子序列可以为 cDNA 片段的直接测序等后续试验提供方便。
图 3 CD151、actin 的 RT-PCR 结果和灰度分析
A:CD151、actin 在 3 个试验组中的 PCR 扩增结果 ；B: CD151 扩增
产物的灰度分析
陈秋实等：利用差异显示法研究刺参表皮再生相关基因
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2008年第 6期
（上接第 127页）
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