全 文 ：收稿日期:2007-05-08
基金项目:科技型中小企业技术创新基金(06c26213201075)
作者简介:王雪(1983-),女,在读硕士,从事氯霉素免疫分析方法研究;E-mail:snowvonwang@hotmail.com
通讯作者:金坚(1960-),Tel:13706196319,E-mail:jinjian31@126.com
氯霉素(chloramphenicol,CAP)是对革兰氏阳性、阴性细菌均有抑制作用的广谱抗生素,1947年首次从
链丝菌的培养液中提取而得到的抗生素。因 CAP效高价廉,在医学和畜牧业中广为应用。但 CAP有毒害作
用,最严重的是引起再生障碍性贫血和其他恶性血液病[1]。1994年,欧盟开始禁止 CAP在畜产品中的使用,
欧盟规定 CAP残留不得检出。目前,欧盟、美国及日本等许多国家对 CAP的要求较以往更严格,目前允许
的最大残留量为 0.1ppb。1999年 9月 13日中华人民共和国农业部发布了动物性食品中兽药最高残留限量
的通知,规定了 CAP在所有食品动物的可食用组织中不得检出。虽然各个国家对 CAP的残留作了严格规
定,但是 CAP在畜产品的残留仍时有发生,这就要求建立一种高灵敏的检测方法。
测定食品中 CAP含量的高效液相色谱分析方法和气相色谱等仪器分析方法、微生物法和比色法的样
品前处理及测定过程操作繁琐,费用高,不适于大量样品筛查和在基层推广使用[2~5]。而免疫分析方法具有
灵敏度高、特异性强和样品前处理相对简单等优点,适于现场监控和大量样品筛查,也可以直接应用于生
产实践[6]。为了建立免疫分析方法,首先必须制备出效价高特异性强的抗体。CAP是小分子物质(分子量
323.13),本身不具有诱导产生抗体的能力。为此,必须设法先将小分子 CAP与载体蛋白质偶联制备成全抗
原,这是免疫分析的关键所在。
1 材料与方法
1.1 仪器与试剂
CAP购于上海生工,BSA为 sigma公司产品,OVA购于上海西宝生物,超纯水由本室采用 Barnstead公
氯霉素全抗原的合成及鉴定
王雪 1 黄飚 1,2 金坚 1 屠蔷 1
(1江南大学医药学院,无锡 214122;2江苏省原子医学研究所,无锡 214063)
摘 要: 为建立氯霉素的免疫分析方法,采用混合酸酐法和重氮化法,将半抗原氯霉素(CAP)与载体牛血清白蛋
白(BSA)及卵清蛋白(OVA)偶联制备免疫抗原CAP-BSA和包被抗原CAP-OVA。以紫外扫描确定偶联率,并用酶联免疫
(ELISA)的方法鉴定,确定偶联成功。经过比较,混合酸酐法优于重氮化法。
关键词: 氯霉素 免疫原 合成 混合酸酐法 重氮化法
SynthesisandIdentificationofChloramphenicolImmunogen
WangXue1 HuangBiao1,2 JinJian1 TuQiang1
(1SchoolofMedicine,JiangnanUniversity,Wuxi214122;2JiangsuInstituteofNuclearMedicine,Wuxi214063)
Abstract: InordortoestablishtheimmunoasaymethodofChloramphenicol(CAP),CAPwascoupledwith
carierproteinbovineserum albumin(BSA)andOvalbumin(OVA)topreparecompleteantigenCAP-BSAandCAP-OVA
bymixedanhydride(MA)reactionanddiazotizationreaction.Highperformanceliquidchromatography-Massepectrum
(HPLC-MS)wasusedtoidentifychloramphenicolsuccinate(CAP-HS).UV andELISA wereusedtoidentifythe
antigen.Comparedwithdiazotizationreaction,themixedanhydride(MA)reactionarebeter.
Keywords: ChloramphenicolImmunogen SynthesisMixedanhydride(MA) Diazotization
生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN·研究报告· 2008年第1期
生物技术通报Biotechnology Buletin 2008年第1期
司的超纯水器(D7033)制备,96孔微孔板,Nunc公司产品,紫外吸收测定仪 DU-650为 BACKMAN公司产
品,质谱分析仪 WATERSPlatformZMD4000,酶标检测仪 Bio-RAD,Model450,氯霉素多克隆抗体由江南大
学提供。
1.2 CAP-BSA和 CAP-OVA的合成
1.2.1 混合酸酐法[6] (1)氯霉素半琥珀酸酯(CAP-HS)的制备:将 CAP、琥珀酸酐、丙酮及吡啶混合,搅拌
溶解,60℃回流反应 2h,于旋转蒸发器中浓缩,得淡黄色粘稠液体。用乙酸乙酯洗出,加 1MHCl分层,取有
机相,再用 10%的 NaHCO3转溶后,用浓盐酸调 pH至 2,用酸乙酯萃取,取有机相旋转蒸发器浓缩,得淡黄
色粘稠固体,取样做 LC/MC。
(2)称取 CAP-HS21.7mg溶于 DMF3ml中,4℃预冷 10min,加入三丁胺,混匀;并加入氯甲酸异丁酯,
4℃搅拌 20min。称取 71mgBSA溶于 50%的 DMF10ml中,4℃预冷。用 1MNaOH调 BSA的 pH至 8。将上
CA-HS液迅速加入 BSA中,4℃搅拌反应 4h。所得产物以 0.05MpH7.4的 PBS透析 3d。合成流程,见图 1。
CAP-OVA的合成方法相同。
1.2.2 重氮化法[7] 称取 CAP0.5g,加入 15mlHCl,加 Fe粉 80mg于 65℃反应 40min。取还原 CAP21.5mg,
加入 0.5MNaNO2135μl,4℃避光反应 40min,以 N,N-二甲基苯胺检测重氮化是否成功。称取 BSA45mg,溶
于 5mlpH9.6的碳酸盐缓冲液中,4℃搅拌过夜。所得产物以 0.05MpH7.4的 PBS透析 3d。合成流程,见
图 2。
1.3 CAP半抗原和全抗原的鉴定
1.3.1 CAP-HS的鉴定 CAP的相对分子量是 323.15,CAP-HS的相对分子量是 423.13,采用液质联用
(LC/MS)的检测方法,液相色谱(LiquidChromatography,LC)条件:分析柱为 C-18柱,流动相为乙腈-0.1%甲
酸,梯度洗脱。
1.3.2 偶联物的紫外鉴定[8] CAP标准溶液浓度 10μg/ml,以考马斯亮蓝法测定偶联物的蛋白浓度,配制
浓度为 250μg/mlCAP-BSA溶液和 BSA溶液,250μg/mlCAP-OVA溶液和 OVA溶液 200~400nm紫外扫描,
并计算偶联率。
1.3.3 酶联免疫(ELISA)鉴定 将 CAP-OVA以 1μg/ml包被 96孔板,加入 CAP的标准品 0ng/ml、100ng/
ml,同时加入 CAP多克隆抗体,37℃孵育 1h,洗涤 3遍,加入辣根过氧化酶标记的羊抗兔二抗,37℃孵育
30min,洗 3遍,加入显色液 A和 B,暗处孵育 15min,加终止液,酶标仪 405nm测定。
图 2 重氮化法合成路线图图 1 混合酸酐法合成路线图
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2008年第1期
2 结果与讨论
2.1 CAP-HS的鉴定
图 3是 CAP的质谱图,图 4是 CAP-HS的液相色谱图,由图 4可见,在 10.84min为主要出峰,图 5是
CAP-HS的质谱图,
结合图4,可以看到
CAP-HS的偶联成
功,产率较高。
2.2 反应条件的
选择
混合酸酐法虽
然所需试剂较多,
操作较复杂,但是
反应的条件较为宽
松。重氮化法对实
验条件的控制要求
较高,如还原剂的
选择,锌粉和锡粒
效果不好,可能是
由于锌粉颗粒容易
氧化,铁粉的还原
效果较好,但是较
难分离;还原反应
的温度对反应也有影响,以 60~70℃为宜,反应不同的条件下反应差别较大;重氮化反应是一个受多因素
控制的反应,酸应过量,亚硝酸钠过量对下一步偶合反应不利,重氯化反应一般在 0~5℃进行,这是因为大
部分重氮盐在低温下较稳定,在较高温度下重氮盐分解速度加快的结果,所以采用这种方法合成抗原的成
功率较低。
2.3 偶联物的紫外鉴定(表 1)
表 1 各种方法合成抗原的偶联比
图 6 反应条件选择
王雪等:氯霉素全抗原的合成及鉴定 179
生物技术通报Biotechnology Buletin 2008年第1期
(上接第165页)
!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!
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2.4 ELISA鉴定
采用间接竞争 ELISA方法鉴定,结果表明,采用混合酸酐法合成的全抗原抑制明显,说明全抗原的合
成是成功的;采用重氮化法合成的抗原,无明显抑制。结果见表 2。
由紫外计算偶联率和 ELISA鉴定的结果综合分析可以看出,重氮化法合成的全抗原,经紫外鉴定偶联
率较高,但是在 ELISA鉴定中抑制并不明显,说明紫外鉴定的方法只能大概反映抗原合成的情况,不能作
为抗原合成的惟一鉴定方法。
该研究表明,以混合酸酐法合成的氯霉素全抗原成功率高,方法切实可行,并且优于重氮化法。所得抗
原已经免疫兔子制备多克隆抗体,其他研究在进一步进行当中。
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表 2 ELISA鉴定结果
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