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研究报告

生物技术通报
BIOTECHNOLOGY
BULLETIN 2010年第 12期
葡萄球菌 A蛋白基因的克隆及其 IgG受体区
新型表达载体的构建
张益谋 1
邱海霞 2
稽慧珍3
( 1广东公安边防总队深圳医院,深圳 518029; 2解放军总医院,北京 100853; 3空军总医院,北京 100142 )


摘
要:
旨在克隆 SPA基因并将该基因的 IgG结合区亚克隆至毕赤酵母表达载体中。以金黄色葡萄球菌 CowanI菌株
基因组为模板, 对葡萄球菌 A蛋白 ( SPA )基因全长序列进行 PCR扩增, 再将 PCR产物克隆入 pMD18
T质粒, 将 DNA测序所
得的结果用 B lastn软件进行在线同源比对, 经鉴定为 SPA基因序列后, 在线对其进行功能区域 ( IgG
Fc受体区 )的预测, 将该
区域亚克隆入表达载体 pP ICZaA。结果显示, 从 Cow anI菌株中成功地扩增到 SPA基因, 与 NCBI中公布的序列同源性高达
97% , 同时构建了 IgG
Fc受体区新型的表达载体
关键词:
金黄色葡萄球菌
蛋白质 A
克隆
酵母表达载体
Cloning of Protein A Gene from Staphylococcus aureus and Constructing
a New Expression Vectors of the Domain of IgG
Fc Receptor
Zhang Y mi ou
1
Q iu H aixia2
J iH uizhen3
(
1
Guangdong FrontierH osp ital, Shenzhen 518029;
2
Chinese PLA GeneralH osp ital, Beijing 100853;
3
A irforce GeneralH osp ital of PLA, B eijing 100142)


Abstrac:t
It was to construct the express ion vector of the IgG receptor. The prote in A gene ofS taphy lococcu s aureus Cow anI strain
( SPA ) w as amp lified by polym erase cha in reaction in th is study. The am plified fragm en tw as c loned into the pMD18
T vector and se

quenced, and the a im sequence of SPA w as analyzed by b lastn search, the function dom ains o f wh ich w as predicted by the sm art so ft
and sunc loned into the expression vector o f pP ICZaA. Result showed tha t the am plified sequence is high hom ologous to the sequence of
the prote in A from theNCBI and the dom a in of IgG
Fc recep to r from the am plified sequence was obta ined. There fore, SPA gene is am

p lified from the Cow anI stra in, and expression vector of the dom a in of IgG
Fc recepto rw as constructed successfu lly.
Key words:
S taphylococcus aureus
P rote in A
C lon ing
Yeast expression vector
收稿日期: 2010
09
06
基金项目:校科研启动基金 ( 09JDG057)
作者简介:张益谋,男,副主任医师,主要从事儿童发育方面的研究; E
m ai:l tn ixh@ 163
com


随着后基因组时代的到来,蛋白质的结构和功
能已成为研究的重点 [ 1] , 因此有必要建立一套快速
的高通量蛋白质纯化体系。研究发现, 一些病原微
生物能产生与 IgG的 Fc区域结合的蛋白质和多肽,
其中研究最多的是金黄色葡萄球菌来源的 SPA和
SPG
[ 2, 3 ]
, 利用它们特异性结合 IgG的特性,在体外
对 SPA进行一些化学修饰做成层析柱,期望可以研
发出高效、廉价、稳定性较好的新型柱子, 从而对不
同来源的血清中快速分离纯化出 IgG, 提高 IgG纯
化的程度、减少 IgG下游纯化的成本,不仅可以在生
物工程中产生巨大的经济效益, 也可以为其它新型
柱子的研究开发提供有益的借鉴。
SPA是金黄色葡萄球菌细胞壁上的一种锚定蛋
白, 能够与免疫球蛋白 G ( IgG )的 Fc段相结合;该蛋
白为一种单体活性蛋白,由 450个氨基酸组成,分子
量为 42 kD, 等电点为 5
56。 SPA可以分成两个区
域: 免疫球蛋白结合区域和一个所谓的 X区域, X
区域在 SPA与细胞壁附着方面起重要作用,而免疫
球蛋白结合区域又分为多个亚区域 ( E、D、A、B、C ),
除此之外蛋白质 A前体还有一个信号肽 [ 4- 7 ]。
生物技术通报 B iotechnology
Bulletin 2010年第 12期
本研究针对 GenBank中已注册的序列 ( G I:
46690), 利用 Prem ier5
0软件对其进行引物设计,
从 Cow anI菌种中扩增 SPA全长序列, 通过在线软
件 B lastn对测序拼接后的序列进行同源序列的搜
索,并且对鉴定后的序列进行功能区的预测,将 IgG
受体区克隆到毕赤酵母表达载体中, 以期得到大量
活性高、产量高的功能片段为 SPA的下游开发提供
充足的材料。
1
材料与方法
1
1
菌种
金黄色葡萄球菌 Cow anI购自中国普通微生物
菌种保藏管理中心, E. coli DH5
和 Top10F为中山
大学生物医药中心保存。其中 E. coli DH 5
用于
pMD18
T与 SPA基因全长序列连接产物的扩增和
保种, Top10F用于毕赤酵母表达载体 pPICZaA与
IgG受体区连接后的扩增和保种, X
33野生型酵母
用于 pPICZaA 与 IgG受体区连接产物的表达宿
主菌。
1
2
酶和生化试剂
E coR I、Xba I、Sac I限制性内切酶和 T4DNA连
接酶、LA Taq DNA聚合酶、均为 TaKaR a公司产品,
P fu Taq DNA聚合酶为上海申能博彩生物科技有限
公司产品,氨苄青霉素为 Sigma公司产品、Zeoc in为
Inv itrogen公司产品。
细菌基因组提取试剂盒、胶回收试剂盒为
B ioFlux公司产品;质粒抽提试剂盒为 Om iga公司产
品; pMD18
T试剂盒、DNAM arker均为 TaK aRa公司
产品。
1
3
引物设计
根据 GenBank中公布的序列 ( G I: 46690) , 利用
Prem ier5
0软件设计一对引物扩增 SPA基因全长序
列,将扩增后的序列与 T载体连接进行测序, 对鉴
定后的拼接序列通过在线软件进行功能区域 IgG受
体区预测,针对毕赤酵母表达载体 pPICZaA多克隆
位点, 设计另外一对扩增 IgG受体区的引物。
第一对引物的序列: 上游引物 P1: 5

GCG

GAATTCACTTTACAAATACATACAGG
3
, 下游引物
P2: 5

GCTCTAGAAGCTAATAACGCTGCACCT
3
。
第二对引物的序列: 上游引物 P1: 5

TAGAAT

TCGGTGGCGTAACACCTG
3
(下划线为引入的
E coR I的酶切位点 ), 下游引物 P2: 5

GCTCTA

GATTCATTTAACTTTTTAGCTTCG
3
(下划线为引
入的 X ba I的酶切位点 )。
1
4
金黄色葡萄球菌细胞总 DNA的提取
将 Cow anI菌种干粉按照说明,用灭菌蒸馏水使
其充分溶解后保存在 1
5 mL的 Eppendorff管中。
取 40
L Cow anI菌液接种于 5mL的 BPY液体培养
基, 30
过夜培养 12- 16 h后离心收集菌体, 然后
按照 B ioFlux公司的细菌基因组提取试剂盒方法提
取金黄色葡萄球菌细胞总 DNA。
1
5
SPA基因及其功能区域的 PCR扩增
1
5
1
SPA基因的全长序列 PCR扩增
以金黄色
葡萄球菌细胞总 DNA为模板, 用设计的第一对特异
性引物扩增 SPA基因全长序列 (包括信号肽序列 )。
反应体系: dNTP 1
6
L, LA Taq缓冲液 2
L, LA
Taq酶 0
25
L, 20
mo l的上下游引物各 0
2
L,
模板 1
L, 补加 DDW 至 20
L。PCR反应程序:
94
预变性 4 m in, 然后进入循环: 94
变性 40 s,
50
退火 40 s, 72
延伸 90 s,经过 30个循环后, 再
72
延伸 8 m in后结束反应。
1
5
2
SPA基因功能区域 ( IgG
Fc受体区 )的 PCR
扩增
以 pMD18
T与 SPA基因产物的克隆为模板,
用设计的第二对特异性引物扩增 IgG
Fc受体区。
反应体系: dNTP 1
6
L, P fu Taq缓冲液 2
L, P fu
Taq酶 0
25
L, 20
mo l的上下游引物各 0
2
L,
模板 1
L, 补加 DDW 至 20
L。PCR反应程序:
94
预变性 4 m in, 然后进入循环: 94
变性 40 s,
48
退火 40 s, 72
延伸 50 s,经过 30个循环后, 再
72
延伸 8 m in后结束反应。
1
6
SPA基因 PCR产物的克隆及 SPA基因测序
分析
采用 B ioFlux公司的胶回收试剂盒纯化 SPA基
因产物,将纯化的 SPA基因产物与 pMD18
T直接连
接 (载体末端带有 T载体, PCR产物末端带有 A碱
基 ) ,采用氯化钙法制备大肠杆菌 DH5
感受态细
胞, 然后进行连接反应、转化、阳性克隆菌株的筛选
及酶切鉴定。
将筛选的阳性克隆菌株质粒 pMD18
T
SPA送
上海英俊生物技术公司对克隆片段 SPA基因测序,
并对拼接后的测序结果进行在线同源性分析, 以此
202
2010年第 12期


张益谋等:葡萄球菌 A蛋白基因的克隆及其 IgG受体区新型表达载体的构建
鉴定所克隆的片段为 SPA基因。
1
7
IgG
Fc受体区表达载体的构建及鉴定
用 E coR I、Xba I对 SPA基因 IgG受体区 PCR
扩增产物进行双酶切后与经过同样内切酶双酶切后
的毕赤酵母表达载体 pPICZaA连接 (图 1) , 并将重
组质粒转入 Top10F感受态细胞中。
挑选出转化平板上的阳性菌落, 并通过 PCR扩
增进行克隆的初步筛选。然后再利用 Om ega公司
的质粒抽提试剂盒提取阳性菌的质粒进行双酶切分
析,进一步确定表达载体是否构建成功。
图 1
表达载体 pPICZaA
IgG受体区的构建
2
结果与分析
2
1
SPA基因的 PCR扩增
金黄色葡萄球菌 SPA基因 PCR扩增的电泳结
果如图 2所示。
1. DNA M ark er; 2.空白对照; 3. PCR扩增产物
图 2
SPA基因的 PCR产物电泳结果
从图 2可以看出, 空白对照的扩增产物中除引
物二聚体外未见任何扩增条带,而由目的基因扩增
得到一条大小为 1 500 bp的条带,与推论的相符,表
明从金黄色葡萄球菌基因组中扩增到 SPA基因。
2
2
SPA基因 PCR产物的克隆
将 PCR扩增的 SPA基因产物, 直接与 pMD18
T
( 2 692 bp)载体连接,然后转化 E. co li DH 5
感受态
细胞,涂布在添加有氨苄青霉素抗性的平板上, 于
37
的恒温培养箱中过夜培养,次日挑取克隆摇菌,
直接取菌液为模板做 PCR,同时提取其质粒做 Sac I
和 E coR I双酶切鉴定,结果见图 3。
1. DNA M arker; 2.空白对照; 3.菌落 PCR;
4. Sac I+ E coR I酶切产物; 5. DNA M arker
图 3
pMD18
T
SPA的 PCR和双酶切鉴定


从图 3可以看出,空白对照没有扩增到特异性
条带,而直接取平板上的克隆培养的菌液为模板时,
扩增结果显示出一条特异性很好的条带 (泳道 3),
其位置与预期的一致。提取该菌液中的质粒做双酶
切进行鉴定, 由于选用了 T载体上的酶切位点, 故
双酶切后的目的片段上带有少许 T载体上的碱基,
因此显示双酶切后的插入片段比相应的 PCR扩增
产物大小略大一些 (泳道 4), 而双酶切后的 T载体
片段位置也与预期的一致, 初步证明了阳性克隆质
粒 pMD18
T
SPA构建成功。
2
3
SPA基因测序分析和 IgG受体区的预测
阳性克隆质粒 pMD18
T
SPA测序后的拼接序
列总长为 1 541 bp,通过在线软件 B lastn对其进行
同源序列搜索, GenBank + EMBL+ DDBJ三个数据
库中共找到 940条蛋白质 A的编码序列, 这些序列
与拼接序列具有不同程度的同源性, 其中来源于
MSSA476菌株 ( GI: 49243355)的基因组序列中, SPA
编码序列中的 nr 98729- nr 99743与拼接序列中的
前 1 020 bp同源性为 98%, nr 98256- nr 99580与
拼接序列中的 1 217- 1 541 bp同源性为 99%,而拼
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生物技术通报 B iotechnology
Bulletin 2010年第 12期
接序列中 1 020- 1 217 bp与 nr 99580- nr 98729没
有显示任何同源性; 而来源于 USA300菌株中 ( G I:
87125858)的基因组序列中, SPA编码序列中的 nr
128709- nr 129723与拼接序列前 1 020 bp同源性
为 97%, nr 128188- nr 128511与 1 218- 1 541 bp同
源性为 97%, nr 128511- nr 128709与拼接序列 1 020
- 1 218 bp也没有显示有同源性, NCBI上目前还没
有 Cow anI的 SPA基因序列, 推测这段序列为该物
种 SPA基因所特有的。除此之外, 搜索结果中还显
示 COL ( G I: 57284222)、MRSA252 ( G I: 49240382)、
NCTC8325( GI: 87201381 )等菌株的基因组中 SPA
编码序列与拼接序列的同源程度不同, 而这些同源
序列都是 SPA前体的编码序列,由此说明从 Cow anI
菌种中成功地克隆到 SPA基因序列。
通过在线软件 http: / / smar.t embl
heide lberg. de/
对鉴定后的序列进行功能区域的预测, 结果发现在
其相应的氨基酸序列中, N端是典型的 YS IRK信号
肽,而其后一段序列是 IgG
Fc受体区, 大约有 550
bp左右的碱基。
2
4
IgG
Fc受体区的 PCR扩增
针对毕赤酵母表达载体 pPICZaA的多克隆位
点, 通过 Prem ier5
0软件设计 IgG
Fc受体区的特
异性引物, 对构建好的 pMD18
T
SPA质粒直接进
行 PCR扩增, 所得的 PCR产物电泳结果如图 4
所示。
从图 4可以看出, 泳道 2显示有一条特异性很
强的条带, 其位置大概在 550 bp (理论值为 553
bp) ,与预期的一致,初步认为从构建好的 pMD18
T

SPA中克隆到 IgG受体区。
2
5
IgG
Fc受体区新型表达载体的鉴定
用 E coR I和 Xba I双酶切 IgG
Fc受体区,插入
到载体质粒 pPICZaA的 E coR I和 Xba I的切口上,
构建表达载体 pPICZaA
( IgG
Fc)受体区。
2
5
1
PCR鉴定
从抗性平板上挑取菌落接种在
含有 Zeocin抗性的 LB低盐培养基中, 直接以菌液
为模板做 PCR鉴定,结果如图 5所示。从图 5可以
看出,以未连接目的片段的 pPICZaA质粒模板作为
空白对照时,没有显示出任何带 (泳道 2), 而以转化
有重组质粒的菌液为模板时, 扩增到目标片段 (泳
道 3- 5) ,初步说明已有 3株 Top10F [ pPICZaA
( IgG
受体区 ) ]表达质粒构建成功。
2
5
2
重组质粒的双酶切鉴定
将 PCR鉴定为阳
性的克隆菌株接种在含有 Zeocin抗性的 LB低盐培
养基中, 37
148 r /m in振荡培养 12 h,采用 Omega
质粒抽提试剂盒提取质粒,然后对其质粒进行 Xba I
和 E coR I双酶切。
1. DNA M ark er; 2.扩增产物 PCR
图 4
IgG受体区的 PCR
产物电泳结果
1. DNA M ark er; 2.空白对照;
3- 5.阳性克隆
图 5
重组质粒 pPICZaA
( IgG

Fc受体区 )的 PCR鉴定
1. DNA M arker 15000; 2. pPICZaA
( IgG
Fc受体区 ) /
X ba I+ E coR I; 3. pPICZaA
( IgG
Fc受体区 ) /EcoR
I; 4. pPICZaA / E coR I; 5. DNA M arker 2000
图 6
重组质粒 pPICZaA
( IgG
Fc受体区 )
和空载质粒 pPICZaA的酶切鉴定


从图 6可以看出, 重组质粒 pPICZaA
( IgG
Fc
受体区 )切出的 553 bp左右的 DNA片段,与插入的
片段大小吻合,切出的大片段与 EcoR I单酶切后的
空载 pPICZaA处于同一水平位置, 与预期的一致;
而重组质粒 pPICZaA
( IgG
Fc受体区 )用 E coR I单
酶切后, 所得产物比泳道 2和泳道 4中的 pPICZaA
空载线形片段要大, 这些结果与预期的一致, 表明
IgG受体区新型表达载体的构建成功。
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2010年第 12期


张益谋等:葡萄球菌 A蛋白基因的克隆及其 IgG受体区新型表达载体的构建
3
结论
本研究利用 NCB I上公布的序列设计引物, 成
功地从 Cow anI菌种中克隆到该基因,该基因序列与
现有报道的 SPA基因高度同源, 但中间有一段序列
为 Cow anI菌种所特有, 为在 SPA基因水平上进行
金黄色葡萄球菌种内的鉴定工作提供了可能, 可以
作为葡萄球菌在分子进化方面提供一个判定的指
标,同时为蛋白质 A结构和功能的研究提供了新的
材料, 也为该基因的设计、改造奠定了基础。
由于 SPA具有与 IgG恒定区结合的特性, 这为
该蛋白质的利用开发提供了研究的理论基础。目
前,尽管国外已有不同菌株来源的 SPA基因克隆成
功, 并进行了该蛋白在原核表达系统中的研
究 [ 2, 8 ] ,但由于其表达产物多以包涵体形式存在,
变性复性非常繁琐, 得率极低, 不易于形成天然构
象,因此不利于开展其在体外与 IgG恒定区结合能
力的研究,也不能保证对其进行一些化学修饰制成
柱子的材料来源。利用 sm art在线软件分析其功能
区域, 将 IgG受体区克隆出来并成功地构建到毕赤
酵母表达载体 pPICZaA中,这对于 SPA基因或该基
因来源的功能肽在其表达方面是一个新的探索。
本研究所建立的表达系统是一种分泌型表达系
统,表达效率较高,其分泌外源蛋白的能力可达所有
分泌蛋白的 90%以上,且酵母可多拷贝表达, 表达
量是大肠杆菌的 100倍以上;其表达的蛋白几乎不
含内毒素,表达出来的蛋白质易于纯化。本研究构
建的工程菌 X
33
pPICZaA
( IgG受体区 )为实现生
物反应器大量、高效生产该功能短肽提供了优良的
菌种,为其下游的开发利用奠定了物质基础。
参 考 文 献
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