全 文 ：
研究报告

生物技术通报
BIOTECHNOLOGY
BULLETIN 2010年第 12期
花椰菜温敏型雄性不育系的 RAPD标记
胡立敏
陶兴林
侯栋
朱惠霞
张东琴
(甘肃省农业科学院蔬菜研究所,兰州 730070)


摘
要:
选取温敏花椰菜不育系 GS
19与 GS
31杂交组合的 F2高可育和高不育单株构建基因池,利用 100对随机引物
对其进行 RAPD标记。同时, 采用正交设计对其反应体系及扩增条件进行优化。试验结果表明, 在 25
L反应体系中含
dNTPs 0. 625 mmo l/L, 引物 0. 5
mo l/L, DNA模板 60 ng, Taq酶 1. 5 U,超纯水 14. 9
L; 反应条件为 94
预变性 4 m in,然后进
行 94
变性 30 s, 36
退火 45 s, 72
延伸 90 s, 35个循环后, 再 72
延伸 7 m in, 花椰菜 RAPD扩增效果较好。P21
1800为花
椰菜温敏雄性不育基因的连锁标记。
关键词:
花椰菜
温敏雄性不育基因
RAPD
分子标记
Cauliflower Thermo
sensitiveM ale Sterile Gene RAPDM arker
Hu Lmi in
Tao X inglin
H ou Dong
ZhuH uix ia
Zhang Dongqin
( Vegetable Research Instiute, Gansu A cademy of A gricultural Sciences, Lanzhou 730070)


Abstrac:t
F2 population der ived from F1 hybrid deve loped from the cross GS
19 /GS
31, was used in th is study to build two gene
pools. It has been the use o f o rthogona l design sy stem and optim ization o f PAPD
PCR am plification cond itions. And adopted by 100 pa irs
o f random prim ers to m arker two gene poo ls. The resu lts show ed that th is system was 25
L to tal volum e conta ined 60 ng temp late
DNA, 0. 625 mm o l/L dNTPs, 0. 5
m ol/L random pr im er, 1. 5 U Taq ploym erase. A fte r pre
denaturing at 94
fo r 4m in form in, under
the cond ition o f denaturing at 94
for 30 s, annea ling a t 36
for 45 s, ex tension a t 72
for 90 s, amp lify fo r 35 cyc les, and ex tens ion
at 72
fo r7 m in at last, the resu lt o f am plication w as good fo rRAPD research in heat. P21
1800 can be the linked m arke r of cauliflow

e r therm o
sensitivem a le ster ile gene.
Key words:
Cau liflow er
Therm o
sensitiv em a le ster ile gene
RAPD
Molecu la rm arker
收稿日期: 2010
04
27
基金项目:甘肃省农业生物技术研究与应用开发项目 ( GNSW
2007
20 )
作者简介:胡立敏,女,副研究员,研究方向:蔬菜育种; E
m a i:l hu lim in1128@ 126. com
通讯作者:侯栋,男,副研究员,研究方向:蔬菜育种; E
ma i:l houdong215@ 163. com
分子标记技术以其简单、快捷、实用等优势而成
为植物遗传育种领域研究的有力工具之一。RAPD
是 1990年建立起来的一种分子标记技术 [ 1] ,具有简
单、快速、费用低、不需预知研究对象的基因组序列
等优点,是目前众多分子标记技术中应用最广的技
术,主要应用于个体和品系鉴定 [ 2, 3]、基因定位 [ 4, 5 ]、
构建遗传图谱 [ 6, 7]、遗传多样性检测 [ 8, 9]及标记辅助
选择等研究领域。但 RAPD分析有自身的缺点,由
于技术是以 PCR反应为基础的, 反应体系的细微变
化就可能会影响到扩增结果的重复性。一般可通过
提高模板质量、控制浓度和 Mg2+浓度、保持反应体
系和扩增体系的一致性来提高结果的可靠性。
温敏雄性不育花椰菜的发现将杂交育种简化为
两系法,可极大地降低杂交花椰菜种子生产成本。
目前对温敏不育基因所知甚少, 如果能在分子水平
对其有深入了解, 不仅对阐明雄性不育机理有重要
理论意义,而且为农作物杂种优势利用带来新的突
破。RAPD技术对花椰菜基因分析和基因分离是十
分有用的分子标记 [ 10, 11 ] ,但至今未找到花椰菜温敏
雄性不育基因的分子标记。一旦找到了这种标记,
就可以进行该基因的定位和分离, 进而通过生物技
术方法创造出许多优良新型温敏不育系,这对花椰
菜育种将会产生巨大的影响。为此, 本试验采用正
交优化设计的方法, 对影响花椰菜 RAPD扩增效果
2010年第 12期




胡立敏等:花椰菜温敏型雄性不育系的 RAPD标记
的一系列重要因子, dNTPs、引物浓度、DNA及 Taq
酶用量进行 PCR扩增和电泳检测,筛选出各组分的
最佳浓度配比;设定不同的 PCR退火温度进行 PCR
扩增, 寻找花椰菜温敏雄性不育材料适宜的扩增条
件,建立最适合的 RAPD的反应体系,进一步对花椰
菜温敏不育基因进行标记, 找出与温敏不育基因连
锁的分子标记。
1
材料与方法
1. 1
供试材料
由本课题自主选育的花椰菜温敏型雄性不育系
和可育系。种子播于温室,采用常规大田管理,取幼
嫩真叶作为试验材料。试验时间为 2007年 8月至
2009年 3月,试验地点为甘肃省农业科学院蔬菜研
究所。
1. 2
试验试剂和仪器
2% CTAB提取液; Taq酶 ( 5 U /
L)、dNTPs( 2. 5
mmo l /L)等试剂购自于赛百盛公司; 引物 (北京奥科
生物技术有限公司 )。试验仪器 S igma
15超速冷冻
离心机 (德国 Sigma公司 ); 凝胶成像系统 (北京君
仪公司 ) ; M ycycle PCR仪 (美国伯乐公司 )等。
1. 3
基因组 DNA提取
采用改良后的 CTAB 法提取花椰菜基因
组 DNA。
1. 4
RAPD分析方法
1. 4. 1
群体构建
选取温敏花椰菜不育系 GS
19
与 GS
31杂交组合的 F2高可育和高不育单株各 10
株构建基因池,进行 RAPD分析 (表 1)。
表 1
供试材料 RAPD
PCR 体系的因素及水平
水平 dNTPs(
L) Prim er(
L ) DNA (
L) Taq(
L )
1 1. 5 1. 0 1. 5 0. 5
2 2. 0 1. 5 2. 0 0. 6
3 2. 5 2. 0 2. 5 0. 7
4 3. 0 2. 5 3. 0 0. 8
1. 4. 2
体系构建
PCR反应体系总体积为 25
L,
以 10
bu ffer 2. 5
L, 2. 5mmol /L dNTPs 2
L,引物
0
3
mo l/L, Taq酶 1. 0 U为依托, 通过调整底物
DNA的浓度进行体系优化 (表 2)。
表 2
RAPD
PCR反应体系的正交设计
处理 dNTPs(
L ) Prim er(
L) DNA(
L) Ta q(
L)
1 1 1 1 1
2 1 2 2 2
3 1 3 3 3
4 1 4 4 4
5 2 1 1 1
6 2 2 2 2
7 2 3 3 3
8 2 4 4 4
9 3 1 1 1
10 3 2 2 2
11 3 3 3 3
12 3 4 4 4
13 4 1 1 1
14 4 2 2 2
15 4 3 3 3
16 4 4 4 4
1. 4. 3
条件构建
以传统的扩增条件 (模板 DNA
变性, 94
变性 1 m in; 引物与模板结合, 36
退火
1m in; 引物沿模板延伸, 72
延伸 2 m in; 45个循
环 )为基础,通过对变性、退火及延伸的温度和时间
的变化来找出适应温敏花椰菜的最佳扩增条件。
1. 4. 4
凝胶制备
配制 1. 5%琼脂糖凝胶,灌胶后
插入梳子,聚合 20m in后电泳,经 EB染色在北京君
仪生产的凝胶成像仪扫描照相。
2
结果与分析
2. 1
PCR反应体系最佳配比的筛选
图 1结果显示, 25
L体系中各组分经过 3次
重复试验均有扩增产物产生。而第 9个组合扩增出
的谱带清晰, 则确定 25
L反应体系中含 dNTPs
0
625 mmo l/L,引物 0. 5
mo l/L, DNA模板 60 ng,
Taq酶 1. 5U,超纯水 14. 9
L为花椰菜基因组 DNA
的 RAPD
PCR反应的最佳优化体系。
2. 2
退火温度对扩增效果的影响
通过对花椰菜 RAPD
PCR不同的退火温度进
行试验,扩增结果 (图 2)表明,从 35 - 41
都能扩
增出比较清晰的条带,但从特异性方面来看,只有退
火温度 36
时才能得到稳定、清晰的特异性谱带,
即花椰菜 RAPD
PCR的最佳退火温度为 36
。
119
生物技术通报 B iotechnology
Bulletin 2010年第 12期
图 1
RAPD
PCR反应正交设计图谱





M. M arker
; 1- 8. 35
, 35. 3
, 36
,
37. 1
, 38. 5
, 39. 7
, 40. 4
, 41

图 2
花椰菜 RAPD
PCR反应的退火温度的扩增图谱
2. 3
F2分离群体的 RAPD分析
在供试的 100对引物中,扩增产物一般在 4- 9
条谱带之间,分子量 0. 3- 2. 0 kb,大部分引物在不
育群体与可育群体间没有多态性, 只有 P21引物在
不育群体和可育群体间找到了多态性 (图 3) , 多次
重复试验表明,用 P21作引物扩增到的多态性具有
良好的重复性。从图 3可以看出, 温敏不育混合群
体的扩增产物中都出现了 1条分子量 1 800 bp的片
段,而可育系混合群体没有这条谱带。
2. 4
F2分离群体中各个体的 RAPD分析
用引物对 GS
19、GS
31及 F2不育和可育个体
进行 RAPD分析。结果表明, 引物 P21在温敏雄性
不育系 GS
19及 F2代不育个体中都能扩增出 1 800
bp这一特征带, 如箭头所示 (图 4)。而在 GS
31及
F2代可育个体中则没有这一特征带, 且重复性也很
好,可以作为温敏不育基因的连锁标记。因此,按扩
增引物统一命名的规定,可将引物 P21扩增出的多
态性产物定名为 P21
1800, 作为花椰菜温敏雄性不
育基因的连锁标记。
3
讨论
3. 1
RAPD扩增条件及反应体系的优化
RAPD方法因快速、有效而被广泛应用,但是不
同的作物对 RAPD扩增的条件及扩增反应的体系也
不尽相同。因此, 进行试验时要对其进行优化, 以找
出最佳的条件和反应体系。RAPD反应体系中, 底物
DNA浓度、Mg2+浓度、Taq酶量及引物和 dNTP的量
都会对反应的特异性和扩增效率有所影响 [ 13]。宋丽
120
2010年第 12期




胡立敏等:花椰菜温敏型雄性不育系的 RAPD标记
娜等 [ 13]进行 PAPD标记的扩增反应总体积为 25
L,
包括 10
bu ffer 2. 5
L, 2. 5 mmol /L M gC l2 2. 5
L,
1
0mmol /L dNTPs 2. 5
L, 0. 1
mol/L引物 1. 5
L,
15 ng /
L的 DNA模板 4
L, Taq聚合酶 1 U。PCR
循环设置: 94
变性 1m in, 36
退火 1m in, 72
延伸
2m in,共 40个循环,然后 72
延伸 7m in, 但是,我们
在扩增过程中发现,测定和配制 DNA时由于误差而
导致底物 DNA浓度不能达到优化体系的要求, 因
此,确定底物在反应体系的加入量对于找出适宜的
反应体系至关重要。 RAPD扩增反应条件与常规
PCR基本一致, 但这个反应程序所需时间长, 不利
于大量样品的分析,而且对不同试验材料效果不同。
因此, 我们把变性时间缩短为 30 s,结合时间缩短为
45 s,延伸时间缩短为 90 s, 35个循环作为本试验的
最佳反应条件。大大地缩短扩增时间, 且不会影响
扩增质量,有利于提高仪器的利用率。
3. 2
RAPD标记在花椰菜种质资源与性状基因连
锁标记分析中的应用
利用分子标记技术对花椰菜种质资源进行遗传
多样性分析,绘制主要品种的数字化核酸指纹,可为
新品种特异性检验和种质资源利用提供重要依据。
Hu与 Quiros[ 14]利用 4个随机引物产生的标记条带
成功鉴别出 12个花椰菜品种。孙德岭等 [ 15]利用
AFLP技术对花椰菜及近缘类群遗传关系进行研
究,结果表明青花菜与紫花菜亲缘关系较近,花椰菜
与其它类群亲缘关系较远; M arino等 [ 16]对巴西商业
杂交种制种用 81个品系进行遗传多样性的酸性磷
酸酶分析, 利用 APS
1与 B1位点标记可成功鉴别
一些配制的杂交组合; 利用 RAPD对花椰菜品种进
行了遗传多样性分析,并根据多态性条带建立了 25
个品种指纹图谱;对来自不同国家的 12个花椰菜的
品种进行了 RAPD和 ISSR分析,发现在印尼的 8个
品种间均存在一个特殊标记,能与其它 4个品种完
全区分 [ 17]。在花椰菜遗传标记方面, 已开展了与黑
腐病抗性、自交不亲和性、花色 ( O r基因 )、花球形状
( CAL基因 ) 等重要农艺性状紧密连锁的 AFLP、
RAPD与 SCAR标记分析。张峰等 [ 18]利用抗、感黑
腐病的近等基因系材料, 得到一个与抗性基因紧密
连锁的 AFLP 标记 ( 400 bp) ,经 Southern杂交及测
序、同源性检测发现其与位于拟南芥 5号染色体的
黑腐病抗性基因 ( rxc2)附近 BAC克隆 F7N22部分
序列有 75%的同源性。黄聪丽等 [ 19]应用 RAPD分
析方法得到自交不亲和性相关 DNA差异片段; L i
等 [ 20]发现 O r基因是花椰菜中一个不常见的类胡萝
卜素突变基因,诱导植株不同组织中高水平

胡萝
卜素的积累,使之形成橙色。但是在花椰菜温敏雄
性不育基因的标记方面没有报道, 因此本试验以本
课题发现的温敏雄性不育系为材料, 进行 RAPD分
子标记,找到了与花椰菜温敏雄性不育基因的连锁
标记 P211800, 为两系法花椰菜杂交育种奠定了
基础。
参 考 文 献
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