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生物技术通报
B IO TECHNOLO GY　BULL ETIN 2009年第 9期
发酵产氢菌株的筛选及影响因素研究
霍丹群 1 　武琳琳 1 　廖强 2 　王永忠 2 　侯长军 1 　田鑫 2
(1 重庆大学生物工程学院 ,重庆 400044; 2 重庆大学动力工程学院工程热物理研究所 ,重庆 400044)
　　摘 　要 : 　采用双层平板法从污泥池中筛选出一株产氢较高的发酵菌株 ,经生理生化鉴定表明 ,分离菌株初步鉴定为消
化链球菌属 ( Peptostreptococcus)。研究静态培养条件下葡萄糖、pH、温度及和酵母膏对菌株产氢的影响及不同发酵时间段的产
氢情况。结果表明 ,在葡萄糖浓度 20. 0 g/L, pH 7. 0,温度 37 ℃和酵母膏 2. 0 g/L时 ,产氢量达 21. 07 mmol/L,为初始培养条
件下的 4. 14倍。同时 ,在 24～36 h时间段产氢率达到最高 ,为 0. 44 mmol/ (L·h) ,并且在 60 h时产氢量达到最大累计产氢量
的 89. 2%。
关键词 : 　产氢 　静态培养 　发酵菌株 　产氢率
Selection of Fermentative Hydrogen Producing
Bacter ium and Its Influenc ing Factors
Huo Danqun1 　W u L inlin1 　L iao Q iang2 　W ang Yongzhong2 　Hou Changjun1 　Tian Xin2
(1B ioengineering Departm ent, Chongqing University, Chongqing 400044; 2 College of Power Engineering, Chongqing Univercity, Chongqing 400044)
　　Abs trac t: 　U sing double2layer p late method, a strain of higher hydrogen p roducing fermentation bacteria was isolated from sludge
tank. The isolated strain of bacteria was initially classified as Peptostreptococcus by biochem ical methods. The effects of carbon source
glucose, pH, temperature and nitrogen yeast extractea on hydrogen p roduction of the strain and hydrogen p roduction of different condi2
tion in static state culture with low cost substrate was studied. The result showed that when glucose concentration is 20 g/L, pH is 7. 0,
the temp rature is 37℃ and yeast extracted is 2 g/L, hydrogen p roduction reaches maximum 21. 07 mmol/L , and hydrogen p roduction
enhances 4. 14 times. Study also found that hydrogen p roduction rate reaches the highest of 0. 44 mmol/ (L·h) between 24 h and 36 h
at different time phases, and the hydrogen p roduction has reached 89. 2% of total hydrogen p rodction at 60 h.
Key wo rds: 　Hydrogen p roduction　Static state　Fermentation bacteria　Hydrogen p roduction rate
收稿日期 : 2009204207
基金项目 :国家自然科学基金重点项目 (90510020) ,国家自然科学基金项目 (20876183) ,重庆市自然科学基金 (2009BA6022)
作者简介 :霍丹群 ( 19652) ,女 ,博士 ,教授 ,研究方向 : 微生物资源开发 ; Tel: 023265112673, E2mail: huodq@ cqu. edu. cn　　随着世界经济的高速发展和化石能源燃料的日益枯竭 ,新能源以及生物能源的需求日趋强烈 ,而氢能作为一种高能量的清洁新能源 ,其研究日益受到人们的关注。氢气的传统生产方法很多 ,包括水电解法、水煤气转化法、甲烷裂化法等 ,但由于这些方法需要消耗大量的电力或矿物资源 ,生产成本普遍很高 [ 1～4 ]。生物产氢法因其可再生 ,无污染和降解废物等优点 ,逐渐受到人们的重视。生物产氢主要分为光合产氢和发酵产氢两种 ,而发酵产氢的产率较高 ,无需光照 ,规模大 ,原料广 ,如可生物降解的农业有机废料等及兼性厌氧菌易于保存和运输 ,具备 广阔的研究前景 [ 5～10 ]。生物制氢技术研究在我国发展较晚 ,但进展迅速。其中任南琪等 1990 年开始开展生物制氢技术的研究 ,于 1994年提出了以厌氧活性污泥为氢气原料的有机废水发酵法制氢技术 [ 9 ] ,利用碳水化合物为原料的发酵法生物制氢技术。在此基础上 ,他们先后又发现了产氢能力很高的乙醇发酵类型 ,发明了连续流生物制氢技术反应器等。林明 [ 11, 12 ]从生物制氢反应器的厌氧活性污泥中分离到一株高效产氢菌株 B49,最大产氢速率为 32. 28 mmol/ ( g·h)。因此菌种产氢量的大小成为筛选的重点及必要。本研究从高产菌种选育出发 ,并对筛选菌种进
生物技术通报 B iotechnology　B u lle tin 2009年第 9期
行了初步关键因素的研究。在重庆啤酒厂废水污泥
池中选育出一种发酵产氢菌株 ,并对其进行生理生
化的初步鉴定。研究了葡萄糖、pH、温度、酵母膏 4
种因素在静态培养条件下对菌株产氢的影响。同时
比较在发酵过程不同反应时间段的产氢情况 ,以获
得最适发酵时间 ,为日后发酵产氢过程机理研究、高
效产氢过程控制及工业化生产提供一定的依据。
1　材料与方法
111　试验菌种及材料
1. 1. 1　菌种 　采自重庆啤酒厂污泥废液池中。
1. 1. 2　培养基 　葡萄糖 10. 0 g /L ,酵母膏 1. 0 g/
L , K2 HPO4 1. 0 g/L, NaCl 3. 0 g/L ,MgSO4·7H2 O 0. 1
g/L , FeSO4·7H2 O 0. 1 g /L , CaCl2·H2O 0. 01 g/L ,
pH值为 5. 5。
1. 1. 3　仪器 　恒温水浴锅、气相色谱仪 ( SC23000,
重庆川仪九厂 )、精密电子天平、高压灭菌锅、Ecos
can2pH6型 pH酸度计 (新加坡 )。
112　产氢菌筛选方法及生理生化的鉴定
采集点选择在菌种资源比较丰富的啤酒厂废液
池中 ,取 10 m l废液转入以氩气填充的液体培养基
中 ,在 30℃的培养箱中黑暗条件下富集培养 3 d。
继续培养两次 ,经过多次培养达到富集目的。
采用平板稀释分离法分离纯化菌种 ,采用双层
培养法达到隔离空气的目的。在培养基中挑选生长
迅速且有气泡产生的菌落 ,转接入多个培养基中进
行纯化。反复多次 ,直到观察细菌菌落形态大小颜
色等基本一样且利用显微镜观察形态一致。转接入
液体培养基中培养 3 d左右 ,进行产氢量测定。从
中挑选出优良产氢菌株。
生理生化鉴定 首先观察菌株在培养基中的生
长状态 ,再通过菌落观察和载片培养 ,根据菌株的生
理及生化特征 ,并参照伯杰氏菌种鉴定手册 ,确定菌
株的种属 [ 13, 14 ]。
113　底物及环境条件对产氢量的影响
11311　碳源葡萄糖的影响 　在发酵培养基中分别
加入葡萄糖浓度为 5, 10, 15, 20和 25 g /L的液态培
养基 ,分别接入菌液 ,充氩气静态培养 , 48 h后测定
产氢量。
11312　pH对产氢量的影响 　接入菌液分别到 pH
为 3, 4, 5, 6, 7, 8和 9的液态培养基中 ,填充氩气静
态培养 , 48 h后测其产氢量。
11313　温度对产氢量的影响 　接入菌液到 7个液
态培养基 ,充氩气排空气后 ,分别在 20℃, 25℃,
28℃, 31℃, 34℃, 37℃和 40℃条件下 ,培养 48 h测
产氢量。
11314　酵母膏加入量对产氢量的影响 　分别接入
菌液到酵母膏浓度为 0. 5, 1. 0, 2. 0, 3. 0和 4. 0 g/L
的液态培养基中 ,充氩气后静态培养 48 h后测产
氢量。
11315　不同发酵时间段产氢研究 　接入菌液到液
态培养基中进行静态培养 ,在 24 h时开始抽取瓶中
气体进行测量 ,每隔 12 h测量 1次 ,然后充氩气
5 m in排净瓶内气体。
114　分析方法
氢气浓度测量采用气相色谱法 [ 15 ] ,色谱柱填料
为苯乙烯高分子多孔小球 ,柱长 2 m ,载气为氩气 ,
流速为 25 m l/m in,采用 TCD检测器 ,电流 80 mA,
柱箱温度 55℃,气化室和检测室温度各为 100℃。
2　结果与讨论
211　菌种的初步鉴定
形态学观察及生理生化鉴定发现 :发酵细菌圆
形 ,边缘整齐 ,颜色为白色 ,不透明 ,光滑 ,有光泽。
革兰氏染色 ( + ) ,厌氧或兼性厌氧 ,最适温度 35 -
37℃,糖发酵试验表明细菌降解葡萄糖 ,产酸 ,产气 ;
甲基红试验 (M. R. 试验 ) ,乙酰甲醛醇 (V. P. 试验 ) ,
产氨试验检测均为阳性。根据伯杰氏菌种鉴定手册
初步鉴定菌种为消化链球菌属 ( Peptostreptococcus)。
212　初始葡萄糖浓度对产氢量的影响
为了研究产氢细菌葡萄糖影响 ,分别选取了葡
萄浓度 5, 10, 15, 20及 25 g/L的培养基 (其他培养
基成分不变 ) ,接种量 10% ,温度为 30℃, pH5. 0,静
态培养 48 h。结果如图 1,显示在静态培养条件下 ,
葡萄糖浓度对菌株产氢量影响明显。这可能是由于
当糖浓度过高时 ,会导致渗透压增高及细菌内部有
机酸含量的增加 ,影响了细菌酶的活性 ,对菌株生长
不利 ;当糖浓度过低时 ,不能满足菌株代谢所需能
量。其中在低于 10 g/L, 产氢量较低。当高于
10 g/L时 ,产氢率呈现出明显增长。而在当葡萄糖
浓度为 20 g/L时 ,产氢量达到最高值为 5. 1 mmol/
L。在高于 20 g /L时 ,产氢率则快速下降。显示出
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2009年第 9期 霍丹群等 :发酵产氢菌株的筛选及影响因素研究
葡萄糖的初始浓度为 20 g/L时适宜菌株发酵产氢。
图 1　葡萄糖浓度对产氢量的影响
图 2　pH对产氢量的影响
213　pH对产氢量的影响
配置葡萄糖浓度为 20 g /L的培养基 (其他培
养基成分不变 ) ,接种量 10% ,温度 30℃,在不同
pH条件下静态培养 48 h,试验结果见图 2。显示
pH对产氢量的影响较为明显。pH值的往往影响
细胞内的 NAD + /NADH平衡及其他生长环境。而
在较低 pH 值条件下 ,则有可能使与产氢有关的产
氢酶失活 ,从而影响产氢量。在 pH较高时 ,则可
能出现放氢机制。细菌在 pH < 7条件下 ,产氢量
偏低。随着 pH增加 ,产氢逐渐提高。在 pH值达
到 6～7时 , 24 h产氢量较高 ,而在 pH = 7时 ,产氢
量达最高的 4. 02 mmol/L;但是在 pH > 7时 ,产氢
量明显下降 ,显示出发酵产氢不适于初始碱性
环境。
214　温度对产氢量的影响
配置葡萄糖浓度为 20 g/L的培养基 (其他培养
基成分不变 ) ,接种量 10% , pH7. 0,在不同温度条件
下静态培养 48 h,结果如图 3。
图 3表明温度在低于 30℃以下时 ,产氢量明显
偏低 ,温度在 25～30℃范围内对产氢量的增长影响
也较小。在高于 30℃时 ,产氢率提高明显 ,其中在
34～40℃时 ,产氢量普遍较高 ,接近最高产氢量。在
37℃左右时 ,产氢量则达到最高的 8. 0 mmol/L ,显
示出适宜温度有利于细菌生长及产氢量的提高。高
于 37℃时 ,产氢量则不断下降 ,这是由于温度过高
导致酶的失活 ,从而限制氢气的产生。研究表明细
菌可以在一个较宽的温度范围内发酵产氢。这对生
物发酵产氢的工业化温度控制有较好的利用。
图 3　温度对产氢量的影响
215　酵母膏对产氢量的影响
配置葡萄糖浓度为 20 g/L的培养基 (其他培养
基成分不变 ) ,接种量为 10% ,温度 37℃, pH7. 0,加
入不同酵母膏的量静态培养 48 h (图 4)。试验结果
表明酵母膏在低浓度下时 ,细菌产氢量较低 ,随着酵
母膏浓度的提高产氢量增长迅速。酵母膏浓度为
2. 0 g/L时 ,产氢量达到最高的 21. 1 mmol/L ,在高
于 2. 0 g/L时 ,产氢量下降明显 ,显示抑制作用较
大。以往研究较少研究酵母膏浓度影响 ,然而结
果发现酵母膏浓度对产氢量影响较为明显 ,这可
能是由于酵母膏中含有多种细菌生长多种组成成
分、生长因子及微量元素 ,从而影响细菌的生长和
产氢量。
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图 4　酵母膏浓度对产氢量的影响
216　不同发酵时间段产氢研究
配置葡萄糖浓度为 20 g/L的培养基 (其他培养
基成分不变 ) ,接种量 10% ,温度 37℃, pH7. 0,静态
培养条件下从 24 h开始每隔 12 h测一次产氢量 ,试
验结果如图 5。显示在不同时间阶段产氢率明显不
同 ,在前 24 h时 ,平均产氢率约为 0. 24 mmol/ (L·
h) ,在 24～36 h产氢量增长明显 ,达到最高的 0. 44
mmol/ (L·h)。在 36 h以后 ,产氢率呈现下降趋势 ,
而在 48 h时产氢速率降低 ,但是仍维持较高水平。
而在 60 h后产氢则基本趋于停滞 ,产氢率很低。因
此 ,最适培养发酵时间应为 60 h,此时的产氢总量占
到最大累计产氢量的 89. 2% ,从经济角度以及节约
发酵时间来说 ,达到最适发酵时间。
图 5　不同时间段产氢情况
3　总结
本研究从废液池中筛选分离得到的菌株 ,初步
鉴定属于消化链球菌属 ( Peptostreptococcus)。在不
同条件下的优化显示 ,最优培养产氢条件 :葡萄糖浓
度为 20 g /L; pH 为 7. 0;温度 37℃;酵母膏浓度为
2. 0 g/L,此时 48 h的产氢量达到 21. 07 mmol/L ,产
氢量为初始条件下的 4. 14倍。表明此菌种产氢量
较高 ,适合作为产氢菌种的机理研究及应用。从产
氢最适时间研究出发 ,研究发现在 24～36 h时间段
产氢率达到最高 ,为 0. 44 mmol/ (L·h) ;在 60 h时
产氢量达到最大 ,为累计产氢量的 89. 2%。表明发
酵反应时间达到 60 h,产氢过程基本完成。
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