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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2011 年第 3 期
轮状病毒 VP7 基因的克隆与表达
柴晓杰 王晓庆 张婷 代靖宇
(大连海洋大学生命科学与技术学院，大连 116023)
摘 要: 应用聚合酶链式反应技术(PCR)扩增轮状病毒 VP7 基因，并将其克隆到 pMD18-T simple 载体上，对重组子
进行 PCR检测和限制性内切酶分析，并测定 DNA全序列。结果显示，克隆片段全长为 981 bp。将轮状病毒 VP7 基因定向
的克隆到原核表达载体 pET-32a启动子下游，构建原核表达载体 pET-32aVP7。将质粒 pET-32aVP7 转化 Transetta表达菌株
进行诱导表达，裂解菌体细胞抽提蛋白质进行 SDS-PAGE。结果表明，轮状病毒壳蛋白 VP7 基因在 Transetta 表达菌株内得到
成功表达。
关键词: 轮状病毒 PCR 克隆 表达
Cloning and Expression of Rotavirus Gene VP7
Chai Xiaojie Wang Xiaoqing Zhang Ting Dai Jingyu
(School of Life Science and Technology，Dalian Ocean University，Dalian 116023)
Abstract: Rotavirus gene VP7 was obtained by PCR techinque and cloned into pMD18-T simple． The recombinant clone was de-
tected by PCR technique and analysed by the restriction enzyme． A full length of cDNA gene was sequenced． The results showed that the
length of the clone sequence was 981 bp． Rotavirus gene VP7 was cloned into promoter downstream of expression vector pET-32a in ori-
entation． A expression vector pET-32aVP7 was constructed． The expression of gene VP7 was induced by 1 mmol /L IPTG in Transetta
cells． The lysate of E． coli cells was analyzed by electrophoresis and staining of polyacrylamide gel by coomassie brilliant blue R-250
showed a VP7 band of molecular weight 57 kD．
Key words: Rrotavirus PCR Clone Expression
收稿日期:2010-09-06
基金项目:辽宁省教育厅项目(2008T023)
作者简介:柴晓杰，女，博士，教授，研究方向:植物基因工程;E-mail:cxj63@ 126． com
轮状病毒(rotavirus，RV)属于呼肠病毒科，轮状
病毒属，无囊膜，为 20 面体，带有 3 层结构的衣壳蛋
白。外衣壳由 780 个 VP7 和 60 个 VP4 二聚体构成
的纤突(sprike)组成，内衣壳由 260 个 VP6 三聚体
组成，里面芯髓由 VP1、VP2 、VP3 和 11 个双链 RNA
片段及与其结合的非结构蛋白(NSP1-NSP6)组
成［1 － 3］。外层衣壳 VP7 和 VP4 是其两种主要的中
和性抗原，在诱导免疫保护中具有重要作用［4］。在
动物模型中抗 VP4 和抗 VP7 抗体可分别独立地抵
御轮状病毒感染。轮状病毒主要感染成熟的小肠绒
毛上皮细胞，可引起新生儿发烧、呕吐和腹泻，严重
的可导致脱水和体液紊乱。通常认为这种感染主要
发生在小肠中，最近有资料显示，患儿也伴有抗原血
症和病毒血症［5 － 9］。轮状病毒感染可导致儿童及多
种幼龄畜禽腹泻，给社会带来了巨大损失，引起了人
们的普遍关注和高度重视。由于目前世界上对轮状
病毒感染没有有效治疗药物，使用疫苗预防成为唯
一手段［10］。为此，拟克隆轮状病毒 VP7 基因实现原
核表达，为进一步利用盐藻作为生物反应器生产疫
苗奠定了基础。
1 材料与方法
1． 1 材料
1． 1． 1 菌种和质粒 pET32a 表达载体，Transetta
菌株由姜玉声博士惠赠。pMD18-T simple vector
购自 TaKaRa 公司，质粒 pBI121VP7 由本实验室
构建。
1． 1． 2 培养基 LB培养基。
1． 1． 3 酶及生化试剂 Taq 酶及限制性内切酶、溶
2011 年第 3 期 柴晓杰等:轮状病毒 VP7 基因的克隆与表达
菌酶、T4 DNA 连接酶、DNA Marker DL2000 购自
TaKaRa公司，其他试剂均为国产分析纯产品。
1． 1． 4 引物 PCR引物由 TaKaRa公司合成。
1． 2 方法
1． 2． 1 PCR 扩增 人工合成引物为:P1:5 CG-
GCGGAATTCATGTATGGTATTGAAT-3(下划线为
EcoR I 酶切位点) ;P2:5 CCGTCGACCTATACTC-
TATAATAAAACGC-3(下划线为 Sal I酶切位点) ;
在 50 μL的反应体系中，dNTP 4． 0 μL，引物各 50
pmol /L，模板 DNA 0． 1 μg，Taq 酶 0． 5 μL(2． 5
U) ，10 × Buffer 5． 0 μL，MgCl2 4． 0 μL，以 ddH2O补
足 50 μL 。PCR 扩增程序:94℃ 预变性 5 min;
94℃变性 30 s，55℃复性 30 s，72℃延伸 2 min，30
个循环;72℃延伸 10 min。
1． 2． 2 PCR 产物的克隆、鉴定及序列分析 将
PCR产物回收后，按 3∶ 1 比例与克隆载体 pMD18-T
simple vector 连接。将连接产物转入大肠杆菌
DH5α，并在附加 100 μg /mL的氨苄青霉素的 LB 固
体培养基上选择培养。挑取白斑用碱裂解法提取质
粒 DNA，用限制性内切酶酶切鉴定，得到重组克隆
pMDVP7，其中插入约 1 kb 的目的基因。序列测定
由大连 TaKaRa公司完成。
1． 2． 3 表达载体 pETVP7的构建 将含有目的基因
的重组质粒(pMDVP7)和 pET32a 经 EcoR I 和 Sal I
酶切，T4连接酶连接，得到重组质粒 pETVP7。转化
大肠杆菌 DH5α，在含 100 μg /mL 的氨苄青霉素的
LB固体培养基上筛选重组子。提取阳性克隆的质
粒，经 PCR检测和酶切鉴定，得到重组克隆。
1． 2． 4 融合蛋白的诱导表达 表达载体 pETVP7
转化 Transetta 感受态细胞。挑取单菌落，于 LB 液
体培养基(含 50 μg /mL 氨苄青霉素)中过夜培养;
取 100 μL菌液培养至 OD600为 0． 6，加入终浓度为 1
mmol /L的 IPTG，诱导融合蛋白的表达，同时做空白
对照。诱导培养 5 h、7 h，收集菌体细胞并裂解抽提
蛋白质，进行 SDS-PAGE。
2 结果与分析
2． 1 PCR扩增产物的克隆及筛选
PCR扩增产物在 1． 0%琼脂糖凝胶上电泳，得
到约 1 kb，特异性强，单一的扩增带，结果(图 1)与
预期一致。扩增产物回收后与载体连接转化到大肠
杆菌 DH5α中，筛选出 8 个阳性克隆，经 PCR 检测
和酶切鉴定，得到一条约 1 kb 的插入片段(图 2) ，
说明该目的基因插入在载体上，其片段大小与预期
一致。
M． DNA Marker DL2000;1 － 4． PCR 扩增产物;5．水作为
对照
图 1 PCR产物的电泳分析
M． DNA Marker DL2000;1，2． BamH I + Hind Ⅲ双酶切产物
图 2 重组克隆的酶切鉴定
2． 2 DNA序列分析
经过DNA全自动测序仪，测定得到的序列为981
bp的目的片段(图 3) ，与已发表的人源 97 SH19 外
壳蛋白基因(GenBank 登录号:AF260949. 1)序列的
开放阅读框比对，有 7 个碱基的差异，同源性达到
99． 29 %。
2． 3 表达载体 pETVP7 的构建
将筛选出的 5 个重组克隆，进一步酶切鉴定，电
泳图谱(图 4)表明酶切片段大小与理伦值一致。说
明目的基因的插入位置和方向都正确。
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2． 4 融合蛋白的诱导表达
从聚丙烯酰胺凝胶电泳结果来看，在 Marker 的
66． 4 kD下面有一条表达增强的条带，根据其迁移
率计算分子量，其大小为 57 kD(图 5) ，该结果与预
期大小一致。
1atgtatggta ttgaatatac cacaattcta atctttctga tatcaatcat tctactcaac tatatattaa aatcagtgac ccgaataatg
91gactacatta tatatagatt tttgttgatt tctgtagcat tatttgcctt aactaaagct cagaactatg gacttaatat accaataaca
181 ggatcaatgg atactgtata ttccaactct actcaagaag gagtatttct aacatccaca ttatgtttgt attatccaac
261 tgaagcaagc actcaaatca gtgatggtga atggaaagac tcattatcac aaatgtttct tacaaaaggt tggccaacag
341gatcaatcta ttttaaagag tactcaaata ttgttgattt ttccgttgac ccacaattat attgtgatta cagcttagta ctaatgaagt
431atgatcaaaa tcttgaatta gatatgtcag aattagctg atttgatattg aatgaatggt tatgtaatcc aatggatata acattatatt
521attatcaaca atcgggagaa tcaaataagt ggatatcaat gggatcatca tgtactgtga aagtgtgtcc actgaataca
601 caaacgttag gaataggttg tcaaacaacg aatgtagatt catttgaaac agttgctgag aatgaaaaat tagttatagt
681 ggatgtcgtt gatgggataa atcataaaat aaatttgaca actacgacat gtactattcg aaattgtaag aagttaggtc
761caagagagaa tgtggctgta atacaagttg gtggctctaa tgtgttagac ataacagcgg atccaacgac taatccacaa
841 attgagagaa tgatgagagt gaattggaaa agatggtggc aagtattcta tactatagta gattatatta atcagattgt
921acaggtaatg tccaaaagat caagatcatt aaattctgct gcgttttatt atagagtata g
图 3 目的片段的核苷酸序列
M． DNA Marker DL15000;1，2． EcoR I + Sal I双酶切产物
图 4 阳性克隆酶切鉴定
3 结论
根据已发表的序列设计 1 对引物，采用优化的
PCR体系扩增出轮状病毒 VP7 基因，序列测定结果
表明，该基因片段全长 981 bp，与人源 VP7 基因序
列同源性为 99． 29%。
将目的基因插入到原核表达载体 pET-32a 启动
子下游，成功地构建了原核表达载体，将表达载体
pET-32aVP7 转化 Transetta表达菌株进行诱导表达，
结果 VP7 基因获得了成功表达。由于在大肠杆菌
中表达全长序列的 VP7 基因有一定困难［11］，因此选
择了 Transetta菌株作为表达宿主，主要是因为该菌
株 lac 透性酶突变，可以控制表达水平，并提供了稀
有密码子 tRNA，对目的蛋白的表达更为有利。
1． IPTG诱导 5 h后细胞裂解物;2． IPTG诱导 7 h后细胞裂
解物;3．阴性对照;M． Protein Marker
图 5 VP7 蛋白的诱导表达
本研究将克隆的轮状病毒 VP7 基因成功地实
现了原核表达，为进一步利用盐藻作为生物反应器
生产疫苗奠定了基础。
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