全 文 ：研究报告
生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2011年第 5期
产葡萄糖酸荧光假单胞菌的分离鉴定及解磷作用
彭帅 韩晓日 马晓颖 韩梅
(沈阳农业大学土地与环境学院,沈阳 110161)
摘 要 : 从番茄根际土壤中分离到 1株解磷荧光假单胞菌 LAD6,并对其进行了形态特征、生理生化鉴定及 16S rDNA同
源性序列分析。高效毛细管电泳仪 (H PCE)分析结果显示, LAD6能够产生葡萄糖酸。对 LAD6的解磷能力的测定结果表明,
培养液中的磷溶解量的变化与菌株 LAD6的生长和生理代谢的变化相关 ,其最大磷溶解量达到了 245 g /mL。
关键词: 荧光假单胞菌 鉴定 葡萄糖酸 解磷
Isolation and Identification ofGluconicacid Producing
Pseudomonas f luorescens and Phosphate D issolution
Peng Shuai H an X iaori M a X iaoying H anM e i
(College of Land and Environm ent Science, Shenyang Agricultural University, Shenyang 110161)
Abstrac:t Bacter ia l stra in LAD6 was iso la ted from toma to rh izosphe re so il and identified by the charac teristics of mo rpho logy,
physio logy and biochem istry tests and the com par ison of 16S rDNA sequence. LAD6 can excre te g lucon icacid ana lys is byH PCE. The P
so lub iliz ing of LAD6 w as stud ied. The result show ed that the change of the Pso lub iliz ing con tent was corre la ted w ith the grow th andm e
tabo lism of LAD6, and its highest Pso lubilizing con tent w as 24. 5 g /mL.
Key words: P seudomonas f luorescens Identifica tion G luconicac id Phosphate d isso lution
收稿日期: 20101112
基金项目:国家产业技术体系花生专项 ( nycytx19) ,辽宁绿丰农业技术开发中心合作项目 ( 413020611030106450802)
作者简介:彭帅,男,硕士研究生,研究方向:微生物资源开发; Em ai:l sharpd avis@ 163. com
通讯作者:韩梅,女,副教授,研究方向:微生物制剂的研制和开发; Em ai:l hanm ei1126@ 126. com
磷是植物的重要营养元素之一, 其营养功能主
要体现在参与植物体内多种化合物的合成和代谢过
程,增强植物体的抗逆性等方面。我国有 74%的耕
地土壤缺磷,土壤中 95%以上的磷为无效形式, 植
物很难直接吸收利用 [ 1]。土壤中大部分磷元素主
要成分是难溶性的磷酸钙盐,难以被植物直接吸收
利用, 而土壤中的许多微生物的分泌物能以不同的
方式溶解土壤中的难溶性的磷酸盐, 这些微生物通
常被称为解磷微生物 ( phosphateso lub ilizing m icroor
ganisms, PSM s)。一般认为, 解磷微生物溶解土壤中
的矿物磷酸盐的机理主要有以下几种观点: ( 1)分
泌有机酸溶解磷。A gn iho tri[ 2]的研究表明, 解磷微
生物分泌的有机酸是溶磷的主要原因, 并且所分泌
的有机酸种类比数量对溶磷的影响更大, 主要是草
酸和柠檬酸起作用。 ( 2)通过摄取 NH+4 的过程中,
释放出质子, 从而引起磷酸盐溶解 [ 3]。 ( 3)微生物
对钙离子的吸收使磷酸根离子进入土壤溶液。
荧光假单胞菌 (P seudomonas f luorescens)是一类
重要的植物根际促生细菌 ( plant grow th promoting
rh izobacteria, PGPR) ,它不仅可以分泌多种抗菌代谢
物抵抗各种植物病原菌的侵害, 还可以直接促进植
物生长,例如, 分泌植物激素和提供植物所需的养
分, 尤其是为植物提供磷元素。 deW erra等 [ 4]在研
究中发现生防细菌代表菌株 P seudomonads f luores
cens CHA 0时发现其可以分泌葡萄糖酸溶解土壤中
的矿物磷酸盐。荧光假单胞菌和其它根际细菌产生
葡萄糖酸是通过其细胞周质空间中的葡萄糖脱氢酶
( G cd)催化葡萄糖转化成为葡萄糖酸 [ 5, 6] (图 1 )。
在大多数产生葡萄糖酸革兰氏阴性细菌中的葡萄糖
脱氢酶还需要 PQQ ( pyrro loqu inoline qu inone)作为
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酶的辅助因子 [ 7]。
本研究从一株番茄根际土壤分离得到 1株解磷
荧光假单胞菌 LAD6, 并对其进行生理生化鉴定和
16S rDNA序列分析。此外本研究还对 LAD6产葡
萄糖酸情况进行分析, 测定葡萄糖酸和 LAD6溶磷
能力。
Gcd.葡萄糖脱氢酶; G lk.葡萄糖激酶; Gnuk.葡萄糖酸激酶; Zw .f葡萄糖 6磷酸脱氢酶
图 1 荧光假单胞菌周质空间和细胞内葡萄糖的分解代谢
1 材料与方法
11 试验材料
111 培养基 KB培养基: 蛋白胨 20 g, 甘油 10
mL, K 2HPO4 15 g, M gSO4 7H 2 O 15 g, 蒸馏水
1 000 mL,琼脂粉 20 g, pH70。
无机磷液体培养基: 葡萄糖 10 g, ( NH4 ) 2 SO4
05 g, N aC l 03 g, KC l 03 g, FeSO 4 7H 2O 03 g,
M gSO4 7H 2 O 03 g, M nSO 4 4H 2 O 003 g,
Ca3 ( PO 4 ) 2 100 g, 蒸馏水 1 000mL, pH 70- 75。
无机磷固体培养基: 无机磷液体培养基中加入
20 g琼脂粉。
112 试剂及仪器 Taq DNA聚合酶、dNTPs m ix
ture分子生物学试剂购自宝生物工程 (大连 )有限公
司, EZ10柱式细菌基因组 DNA抽提试剂盒购自上
海生工。其他试剂为国产或进口分析纯; 高效毛细
管电泳仪 (HPCE ) , PCR仪, 离心机, 数显水浴恒温
振荡器等。
12 试验方法
121 解磷荧光假单胞菌的分离 方法参考文献
[ 8]。轻轻拔出番茄苗,抖落根上附着土, 将苗自根
茎处剪断, 称取根 10 g置于盛有 50 mL 灭菌的
02%的水琼脂的 150 mL的三角瓶中, 置于 28 ,
160 r/m in摇床中振荡 10m in,最后得到根际土壤悬
浮液。稀释法稀释后涂于 K ing S MB培养基平板
上, 将平板置于 28 培养 48 h后,菌落长出后,用紫
外分析仪在紫外光下 ( = 256 nm )挑取能产生黄
绿色荧光的菌落转接至富集培养基平板上, 纯化
后转移至营养琼脂试管斜面, 置于 4 冰箱中保存
备用。
将分离得到的菌株点接到无机磷固体培养基
固体平板上, 28 培养 3 d, 观察溶磷圈的产
生情况。
122 荧光假单胞菌的鉴定 常规鉴定:依照文献
[ 9]对荧光假单胞菌属的鉴定方法对其进行常规鉴
定。 16S rDNA序列分析: 用于扩增供试菌株 16S
rDNA的 PCR引物为通用引物 fD1和 rP:
正向引物 fD1: 5AGAGTTTGATCCTGGCTCAG
3; 反向引物 rP: 5ACGGCTACCTTGTTACGACTT3
(由上海生工合成 )。模板 DNA运用 EZ10柱式细
菌基因组 DNA抽提试剂盒提取。PCR扩增在 50 L
反应体系中进行。扩增程序: 94 变性 5 m in后进
行 35个循环 ( 94 1m in, 55 1 m in, 72 1m in),
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然后 72 充分延伸 10 m in,最后 4 保存。取 5 L
的 PCR产物在 1%琼脂糖凝胶上进行电泳检查。确
定有 1 500 bp左右产物之后, 将 PCR产物纯化后送
交由上海生工生物技术服务有限公司测序。最后将
测序得到的结果在 NCB I上使用 B last程序进行同
源性比对分析, 将序列提交到 GenBank, 并用
M ega41软件构件系统发育树。
123 葡萄糖酸的 HPCE检测 挑取 LAD6菌落接
种到 20mL无机磷液体培养基 (不含 Ca3 ( PO4 ) 2 ),摇
床 28 , 180 r /m in培养 48 h后, 用注射器吸取培养
液通过 022 m滤膜过滤。取过滤培养液 2 mL与
等体积乙酸乙酯混合萃取,除去上层的乙酸乙酯,再
次将培养液通过 022 m滤膜过滤, 最后将得到的
液体用 HPCE检测。
124 LAD6解磷能力测定 挑取产葡萄糖酸的
荧光假单胞菌菌株接种到 50mL K ing SMB液体培
养基中, 28 , 180 r /m in培养 24 h后, 培养液在可
见光分光光度计 = 600 nm处用无菌生理盐水调节
吸光值为 05后作为种子液。吸取 1 mL种子液接
种到无机磷液体培养基中, 28 , 180 r/m in摇菌培
养 7 d,运用钼锑抗比色法每 24 h测定培养液上清
中的可溶磷含量,并用络合滴定法测定培养上清中
Ca
2+含量, 以不接种的培养基为空白, 两者之差为
磷溶解量和钙溶解量, 同时运用浊度法绘制 LAD6
的生长曲线。
将 1 mL浓度为 5%的葡萄糖酸加入到无机磷
液体培养培养基中, 28 , 180 r/m in处理 7 d,每 24
h测定培养液上清中的可溶磷含量和 Ca2+含量,以
不接种的培养基为空白, 两者之差磷溶解量和钙溶
解量。
2 结果与分析
21 解磷荧光假单胞菌的分离
KB培养基是荧光假单胞菌的选择性培养基,
荧光假单胞菌在 KB培养基表现出良好的生长优
势。培养 48 h后得到 1株菌落较大,生长较好,产
生黄绿色荧光的菌株 LAD6。将菌株点接到无机磷
固体培养基固体平板上, 28 培养 3 d后发现在平
板上出现明显的溶磷圈 (图 2)。
图 2 菌株 LAD6的溶磷效果
22 荧光假单胞菌的鉴定
对 LAD6进行了常规的鉴定, LAD6革兰氏染色呈
阴性,能够产生荧光色素,其中接触酶、氧化酶、柠檬酸
盐、明胶液化和吲哚试验呈阳性,水解淀粉和吲哚试验
呈阴性 (表 1),结果与荧光假单胞菌的特征相同。
表 1 LAD6菌株的生理生化特征
特征 结果
菌落颜色 淡黄色
菌体形态 杆状
革兰氏染色 -
荧光色素 +
接触酶 +
氧化酶 +
柠檬酸盐 +
水解淀粉 -
明胶液化 +
VP试验 -
吲哚试验 +
4 +
41 -
+ .阳性; - .阴性
对菌株 LAD6的 16S rDNA序列测定,扩增出大
小约为 15 kb的条带。由上海生工生物技术服务
有限公司对菌株 LAD6进行测序, 所获得的片段大
小为 1 448 bp,通过 NCBI数据库 BLAST软件进行
对比,结合生理生化特征确定 LAD6为荧光假单胞
菌将序列提交到 GenBank, 获得的 序列号为
HQ141340。图 3为 LAD6的系统发育树。
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生物技术通报 B iotechnology Bulletin 2011年第 5期
图 3 基于 16S rDNA构建的菌株 LAD6的系统发育树
23 葡萄糖酸的 HPCE检测
如图 4所示,经处理的菌株 LAD6培养液在4m in
时出现 1个峰,这与葡萄糖酸标准样品出峰时间一
致,由此可以判断菌株 LAD6可以产生葡萄糖酸。
24 LAD6溶磷能力测定
磷溶解量测定的结果 (图 5)表明, 随着培养时
间的推移, LAD6的磷溶解量在培养前 5 d显著增
多, 在接种后的第 5天磷溶解量达到最大值 245
g /mL。但在第 6天发现磷溶解量为 164 g /mL,
并逐渐随培养时间的增加有减少的趋势。接种 5%
葡萄糖酸的培养基中磷溶解量始终保持在 52
g /mL。
图 4 葡萄糖酸的 HPCE(A )和 LAD6培养液 HPCE的图谱 ( B)
图 5 LAD6磷溶解量随时间的变化趋势
钙溶解量测定的结果 (图 6)表明, 随着培养时
间的推移, LAD6的钙溶解量逐渐的增多, 前 3 d钙
溶解量增加很少, 3- 5 d变化较快,在第 5天后,钙溶
解量增加趋势变的缓慢。第 6、7天培养液中的钙溶
解量分别为 124 g /mL、136 g /mL。接种 5%葡萄
糖酸的培养基中钙溶解量始终保持在 15 g /mL。
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图 6 LAD6钙溶解量随时间的变化趋势
结合菌株 LAD6的生长曲线和培养液中磷溶解
量与钙溶解量的变化规律可以看出, 在一定时间内
LAD6大量的生长繁殖, 磷溶解量和钙溶解量均不
断增加,表现出相似的变化规律。但随着时间推移,
磷逐渐被细菌生长代谢所消耗, 同时细菌生长进
入了衰退期, 故培养液中的磷溶解量下降; 而培养
液中 Ca2 +溶解量随磷酸钙的溶解而不断增加, 虽
然培养后期 Ca2+溶解量上升趋势缓慢, 但由于细
菌消耗的 Ca2+微少, 故 Ca2+溶解量并没有发生明
显下降。
3 讨论
荧光假单胞菌是一类广泛分布于土壤中的革兰
氏阴性细菌,是植物根际微生物类群之一, 是一种植
物根际促生细菌。本研究分离鉴定了一株解磷荧光
假单胞菌 LAD6,并对其产葡萄糖酸情况进行了 HPCE
分析,发现该菌可以产生葡萄糖酸。对 LAD6溶磷能力
测定表明,该菌株最大磷溶解量达到了 245 g /mL。
文献 [ 10, 11]关于解磷菌解磷能力的研究结果
表明, 培养液中的磷含量与细菌的生长繁殖及其生
理需要有关,在一定时间内,培养基中的营养能够满
足解磷菌的生长,解磷菌大量的繁殖,磷溶解量不断
增加, 而到培养后期有限的磷元素逐渐被消耗,磷溶
解量逐渐减少, 这与 LAD6解磷能力的研究结果相
似。磷是微生物生长所需无机盐中的大量元素 (生
长浓度在 10- 3 - 10- 4 mo l/L ) ,而钙是微生物生长所
需无机盐中的微量元素 (生长浓度在 10- 6 - 10- 8
mo l/L )
[ 12]
,因此在本研究发现 LAD6培养液中的
Ca
2+溶解量并没有由于细菌的消耗发生下降。
荧光假单胞菌还是一类重要的生防菌株, 因此
继续研究荧光假单胞菌 LAD6的生防作用对于其实
际应用和理论研究都有着重要的价值。
参 考 文 献
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(责任编辑 马鑫 )
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