全 文 ：生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN·研究报告· 2008年第 6期
收稿日期：2008-06-05
基金项目：国家 973 计划“秸秆资源生态高值化关键过程的基础研究”（2004CB719704），国家农业科技成果转化资金项目“青贮饲料微生物
添加剂技术成果转化”（2006GB2G400336）， 新疆自治区高技术研究与发展计划项目 “微生物青黄贮菌剂的分子改良及应用”
（200511107）
作者简介：山其木格（1979-），女（蒙古族），新疆人，在读硕士，研究方向：发酵工程；E-mail：sqmg0309@163.com
通讯作者：王炜（1965-），男，湖北人，研究员，研究方向：微生物工程；E-mail：whangwei0718@126.com
畜禽饲料生产的规模化、现代化造成饲料供应紧张，使得人畜争粮问题日趋突出，所以如何提高饲料
资源利用率是当前饲料营养界的一个重要课题。 饲料农作物细胞壁中存在较高浓度的 β-葡聚糖。 作为一
种抗营养因子，β-葡聚糖以不同机制对动物产生抗营养作用，使食糜具有很高的粘度，阻碍肠道消化液与
食糜的混合，影响营养物质特别是蛋白质和脂肪的消化吸收，降低饲料的利用率，严重制约了大麦在饲料
工业中营养价值的发挥。 一些微生物能产生 β-葡聚糖酶，主要为芽孢杆菌和一些瘤胃微生物及少数真菌。
细菌所产的 β-1，3-1，4-葡聚糖酶对动物饲料工业具有十分重要的应用价值 [4，5]。 在饲料中合理添加含有 β-
地衣芽孢杆菌WS-6 β-葡聚糖酶基因的克隆及表达
山其木格 1，2 包慧芳 1 王炜 1，3 杨红兰 1，2 胡爽 1，2
（1新疆农业科学院微生物研究所，乌鲁木齐 830091；2石河子大学农业技术重点实验室，石河子 832003；
3新疆特殊环境微生物工程技术研究中心，乌鲁木齐 830091）
摘 要： β-葡聚糖是植物细胞壁中结构性非淀粉多糖，存在于各种饲料农作物中[1]。作为一种抗营养因子，β-葡
聚糖使食糜具有很高的粘度，阻碍肠道消化液与食糜的混合，影响营养物质特别是蛋白质和脂肪的消化吸收，降低饲料
的利用率。地衣芽孢杆菌分泌的β-葡聚糖酶可分解β-葡聚糖[2]。在青贮发酵过程中，这种酶可降解大麦β-葡聚糖，有效
提高家畜、家禽对饲料的利用率[3]。从地衣芽孢杆菌WS-6中克隆到β-1，3-1，4-葡聚糖酶基因并进行测序，将该基因与大
肠杆菌表达载体pET32a进行连接，转化大肠杆菌BL21，使该基因得到了有效的表达，为进一步在食品级宿主菌中的表达
奠定了基础。
关键词： 地衣芽孢杆菌WS-6 β-葡聚糖 β-1，3-1，4-葡聚糖酶基因 原核表达
Cloning of β- Glucanase Gene from Bacillus licheniformis
WS-6 and Expression
Shan Qimuge1，2 Bao Huifang1 W Wei1，3 Yang Honglan1，2 Hu Shuang1，2
（1Institute of Microbiology，Xinjiang Academy of Agricultural Science，Urumqi 830091；2Key Laboratory of Agricultural
Technology，Shihezi University，Shihezi 832003；3Xinjiang Engineering Research Center for Microbiology of Extreme Habitat，
Urumqi 830091）
Abstract： The barley glucan is an anti-nutrition l factor that hinders the digestion of barley-bas d diets.β-
glucanase that is secreted from Bacillus species，can hydrolyze glucan and improve digestion of barley-b sed iets
effectively. Therefore，it has been applied in animal feed additive industry.The research and application ofβ-g ucanase as
a silage additive have been being developped quickly. In this research，theβ-1，3-1，4-glucanase gene fromBacillus
licheniformis WS-6 was cloned and sequenced，then ligated into pET32a and transformed inEscherichia c li BL 1.
Eventually，the effective heterogeneous expression was accomplished. This work has laid the foundation for achieving a
heterogeneous expression in lactis acid bacteria for further study.
Key words： Bacillus Licheniformis WS-6 β-glucanβ-1，3-1，4-glucanase gene Prokaryotic expression
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2008年第 6期
葡聚糖酶的饲用复合酶制剂能有效地消除 β-葡聚糖的抗营养作用，从而促进饲料中各种养分的消化和吸
收，提高饲料代谢能值和动物的生产性能 [6，7]。 若利用分子生物学技术，将 β-葡聚糖酶基因在食品级宿主菌
中表达，则不需进行酶制剂的发酵生产和添加即可直接加入饲料中，为饲料工业节省大量的人力财力。 本
试验将克隆地衣芽孢杆菌 WS-6 β-1，3-1，4 葡聚糖酶基因，并在大肠杆菌中进行表达，为在食品级宿主菌
中的表达奠定基础。
1 材料和方法
1.1 菌种和质粒
地衣芽孢杆菌 WS-6 （Bacillus licheniformis WS-6） 由本实验室从青贮样品中分离得到 。 大肠杆菌
（Escherichia coli）DH5α、BL21 和表达载体 pET32a 由本实验室保存 ，pMD19-T Simple Vector 购自宝生物工
程（大连）有限公司。
1.2 试剂
β-葡聚糖购自 Sigma 公司；胶回收（小量）试剂盒（Gel Extraction Mini Kit）购自华舜公司；Premix Taq 购
自宝生物公司；DNA Marker 和蛋白质 Marker 购自上海生工。
1.3 β-葡聚糖酶基因的克隆
1.3.1 β-葡聚糖酶基因的扩增 地衣芽孢杆菌基因组的提取参照 CTAB 法进行。 根据 GenBank 上公布的
地衣芽孢杆菌 β-葡聚糖酶基因 ， 设计上游引物 G732-1：5-CGGATCCATGTCTTACCGTGTAAAACGAGTGT-
3，下游引物 G732-2：5-GGTCGACTTATCTTTTTGTGTAACGCACCCAG-3，在上 、下游引物中分别引入 Bam
HI 酶切位点和 Sal I 酶切位点（均以下划线标示）。以 G732-1、G732-2 为引物，地衣芽孢杆菌基因组为模板，
进行 β-葡聚糖酶基因的扩增。 PCR 程序如下：94℃，5min；94℃，1min，61℃，1min，72℃，2min，30 个循环；最
后 72℃，10min。 PCR 反应在 Mastercycler ep PCR 仪上进行。
1.3.2 β-葡聚糖酶基因的测序 PCR 产物经 1.0%琼脂糖凝胶电泳分离， 用胶回收试剂盒回收目的片段；
目的片段与 pMD19-T Simple Vector 经 T4 连接酶 4℃连接过夜后， 将连接产物加入到感受态 DH5α 中，42℃
热激转化；180r/min，37℃复苏 50min， 涂布于含氨苄青霉素、X-Gal 和 IPTG 的 LB 固体培养基上 37℃培养。
16h 后挑取白色菌落，进行菌落 PCR 鉴定和质粒酶切鉴定 [8，9]。 从筛选到的转化子中挑取单菌落摇菌，提取
质粒，寄宝生物公司完成测序。 该重组质粒命名为 pT-glu。
1.4 β-葡聚糖酶基因在大肠杆菌 BL21 中的表达
1.4.1 重组表达载体的构建 pT-glu 和表达载体 pET32a 经 Bam HI、SalI 37℃双酶切 3h。 酶切产物经 1%
琼脂糖凝胶电泳，用胶回收试剂盒分别回收目的基因片段和经同样双酶切线性化的表达载体 pET32a。 将
双酶切得到的目的基因和线性化 pET32a 于 4℃连接过夜。 构建的重组表达载体命名为 pET-glu。
1.4.2 转化大肠杆菌 BL21 连接产物转化大肠杆菌感受态 BL21 中，并涂布于 LB 固体培养基（含氨苄青
霉素 100μg/ml）培养过夜。 随机挑取单菌落，进行菌落 PCR。 并分别接种于 10ml LB 培养液中培养，提取质
粒后进行质粒酶切鉴定 [10]。
1.4.3 诱导表达葡聚糖酶 将转化子转接入含有氨苄青霉素的 LB 液体培养基，37℃ 180r/min 培养过夜，
以 1%的接种量进行活化，当 OD600=0.5~0.7 时加入终浓度为 2.0mmol/L 的 IPTG 诱导表达，培养 5h。
1.5 表达产物 SDS-PAGE 电泳
参照文献[11]进行。
1.6 β-葡聚糖酶活性检测
β-葡聚糖酶活力测定参见文献[12]。 用 DNS 法分别测定上清液和菌体内的酶活性。 酶活力单位定义：
1ml 酶液在 40℃和 pH5.0 条件下， 每分钟水解 β-葡聚糖生成相当于 1μg 葡萄糖还原物的量为 1 个酶活力
单位（U）。
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2 结果与分析
2.1 β-葡聚糖酶基因 PCR 扩增
以地衣芽孢杆菌 WS-6 基因组 DNA 为模板，G732-1、G732-2 为引物， 进行 PCR 扩增。 扩增产物经 1%
琼脂糖凝胶电泳，发现有 1 条 730bp 左右的特异条带，与理论相符（图 1）。
2.2 PCR 产物克隆
将切胶回收的目的片段与 pMD19-T Simple Vector 经 T4 连接酶于 4℃连接过夜后， 取 5μl 连接产物转
化大肠杆菌 DH5α 感受态，并涂布于含氨苄青霉素、X-Gal 和 IPTG 的 LB 固体培养基上。 16h 后挑取白色菌
落，进行菌落 PCR 鉴定和质粒酶切鉴定。 鉴定结果表明 pT-glu 构建成功。
2.3 β-葡聚糖酶基因的序列分析
β-葡聚糖酶基因测序结果：该基因全长 732bp，未被 GenBank 收录。用 DNAMAN 软件分析表明，该基因
ORF 为 732bp，编码 243 个氨基酸，分子量约为 27kD。
2.4 重组表达载体的构建
pT-glu 和表达载体 pET32a 经 Bam HI 和 Sal I 37℃双酶切后，将目的基因与表达载体连接。连接产物转
化大肠杆菌 BL21 感受态细胞中，涂布于 LB 固体培养基（含 100μg/ml）。 从平板上长出的白色菌落中随机
挑取多个菌落，进行菌落 PCR 鉴定和质粒酶切鉴定，鉴定结果证明含有 β-葡聚糖酶基因的大肠杆菌工程
菌构建成功。
2.5 表达产物 SDS-PAGE 电泳
含有 pET-glu 的大肠杆菌 BL21 经 IPTG 诱导后进行 SDS-PAGE 电泳。结果发现，与含有 pET32a 的大肠
杆菌 BL21 菌相比，含有 pET-glu 的大肠杆菌 BL21 在 45kD 左右有特异蛋白条带。 这与用 pET32a 进行融合
表达的产物理论大小相符（图 2）。


图 1 PCR 产物电泳图 图 2 在大肠杆菌 BL 中表达的 β-葡聚糖酶的 SDS-PAGE
M: 250bp marker; 3: PCR 产 物 （退 火 温 度 为
61℃）；1、2、4、5、6: PCR 产物 （退火温度分别为
55℃、58℃、65℃、68℃、70℃）
M:marker;1: E.coli BL21 含有 pET32a 大肠肝菌 BL21 （未经诱导 ）;2:含
有 pET32a 大肠杆菌 LB21（经诱导 ）;3:含有 pET-glu 大肠杆菌 BL21（未
经诱导）;4: E.coli BL21 含有 pET-glu（经诱导）
2.6 β-葡聚糖酶活性检测结果
酶活检测结果表明， 含有 pET-glu 的大肠杆菌 BL21 经诱导后， 上清液和菌体内都有较高的葡聚糖酶
活性，分别为 1131.2U、2420.92U。而未经诱导时，上清液和菌体内也有少量酶活性，分别为 42.32U、50.28U。
而地衣芽孢杆菌的上清液和菌体内酶活分别是 451.2U、1127.38U。 含有 pET-glu 的大肠杆菌 BL21 经诱导
后，无论是菌体内，还是菌体外酶活性都比地衣芽孢杆菌高出 1~2 倍左右。 检测结果证明 β-葡聚糖酶的异
源表达非常成功。
3 讨论
饲料中的 β-葡聚糖是一种抗营养因子， 极大地阻碍了饲料的利用价值。 β-葡聚糖酶可以有效地消除
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β-葡聚糖的抗营养特性，提高饲料的利用率。 为了加快发展畜牧业，新疆农科院微生物所在国家“十五”科
技攻关的计划下，结合新疆地域特色，研制出了新型饲料级微生物青贮复合菌剂，并已应用于青贮饲料生
产，取得了良好的应用效果。目前，该研究所在原有工作的基础上，拟采用基因工程技术对已有的青贮接种
菌进行分子改良，以期望获得更加优良的青贮接种菌，应用于青贮饲料的生产中。 本研究从自主分离筛选
得到的一株地衣芽孢杆菌 WS-6 中克隆出 β-葡聚糖酶基因，并转化至大肠杆菌 BL21，得到了有效的表达。
这一基础性研究将为实现 β-葡聚糖酶基因在食品级宿主菌中的表达， 进而实现青贮接种菌的分子改良，
简化青贮饲料的制作过程做出一定的贡献。
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