全 文 ：·研究报告·
生物技术通报
B IO TECHNOLOGY　BULL ETIN 2009年第 11期
单克隆抗体与多克隆抗体配对 EL ISA方法比较
张小兵 1 　邸禄芹 2 　吴萌 1 　闫静辉 1
(1河北省生物研究所 ,石家庄 050081; 2河北医科大学第三医院 ,石家庄 050051)
　　摘 　要 : 　以人绒毛膜促性腺激素 (HCG)为抗原 ,制备出对 HCG的多克隆抗体和特异性单克隆抗体 ,并进行抗体纯化和
特性分析 ,利用辣根过氧化物酶 (HRP)分别对其进行了标记。采用双抗夹心 EL ISA试验 ,探讨了多克隆抗体与单克隆抗体配
对的若干事项。结果表明 ,利用单克隆抗体和酶标多克隆抗体配对 ,并用含动物血清的稀释液稀释酶标抗体 ,可实现对检测
原的高特异性和高灵敏度检测。
关键词 : 　单克隆抗体 　多克隆抗体 　抗体配对 　EL ISA法
Study of the Optimum Pa ir ing of Polyclonal Antibodies and
M onoclona l Antibodies with Sandwich EL ISA
Zhang Xiaobing1 　D i Luqin2　　W u Meng1 　Yan J inghui1
(1 B iology Institu te of Hebei , Shijiazhuang 050081;
2 The Third Hospital of Hebei M edical University, Shijiazhuang 050051)
　　Abs trac t: 　U sing human chorionic gonadotrophin (HCG) as the antigen, polyclonal antibodies and monoclonal antibodies(McAbs)
specific for HCG were generated, characterized and highly purified. Then these antibodies were labeled with horseradish peroxidase
(HRP). By a double antibody sandwich enzyme2linked immunosorhent assay, several p roblem s of the op timum pairing of polyclonal an2
tibodies and monoclonal antibodies were discussed. The results showed that with monoclonal antibody as trapp ing antibody and poly2
clonal antibody labeling with enzyme as testing antibody which should be diluted with animal sera as diluent, the sandwich EL ISA had a
highly specificity and sensitivity to detect antigen.
Key wo rds: 　Monoclonal antibody　 Polyclonal antibody　Op timum pairing of antibodies　Sandwich EL ISA
收稿日期 : 2009207213
作者简介 :张小兵 (19732) ,男 ,河北景县人 ,高级工程师 ,主要从事生物技术的应用研究 ; E2mail: 9xiaobing9@ sina1com
通讯作者 :闫静辉 (19632) ,男 ,河北辛集市人 ,副研究员 ,主要从事细胞生物学及抗体工程技术的研究 ; E2mail: Yanjinghui@126. com　　当前 ,抗体不仅仅用于医学和生物学 ,它的应用范围已扩大到农业、工业、基础研究、环境保护和食品检测等各个方面。特别是近几年来 ,抗体在动植物疾病的防治方面越来越活跃。尤其今年 ,在快速大量检测奶粉中三氯氰胺的过程中 ,抗体类试剂盒更是凸显了其无比的优越性。但对于抗体配对问题探讨的报道很少。笔者以 HCG为抗原 ,制备了多克隆抗体和单克隆抗体 ,并以其为模式抗体 ,利用一种抗体标酶另一种抗体包被酶标板的方式 ,组装了双抗夹心式 EL ISA试剂盒。并对检测中出现的一些问题 ,做了初步探讨 ,以期为对其他种类标志抗原的EL ISA检测提供依据和参考。 1　材料与方法1. 1　主要试剂和仪器新西兰大白兔 (河北实验动物中心 ) ,雌性 BALB /c小鼠 (河北实验动物中心 ) , HCG抗原 ( 1 450 U /mg,系自行提取 ) , LH、FSH两种标准品均系卫生部上海生物制品研究所产品 , HAT、HT、PEG、福氏完全佐剂和福氏不完全佐剂 ( Sigma公司 ) ,辣根过氧化物酶标记羊抗兔 IgG (北京中杉金桥生物技术有限公司 ) ,小鼠 Sp2 /O2Ag14 骨髓瘤细胞 (本研究室保存 ) , DMEM培养基、细胞培养板 ( GIBCO公司 ) ,辣根过氧化物酶标记羊抗小鼠 IgG (北京中杉金桥生物技术有限公司 ) ,小鼠单克隆抗体亚型试剂盒
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生物技术通报 B iotechnology　B u lle tin 2009年第 11期
( Sigma公司 ) ,辣根过氧化物酶 ( HRP, 250 U /mg
material, RZ≥3. 0,北京华美转导科技有限公司 ) ,其
它试剂均为分析纯。
96孔聚苯乙烯酶标板 (厦门云鹏科技发展有限
公司 )、酶联免疫检测仪 ( TECAN )、凝胶成像仪
(UVP)。
1. 2　多克隆抗体的制备 [ 1 ]
用于免疫的新西兰大白兔为健康雄性 ,体重为
2～3 kg。免疫方案 :取 HCG700μg用 1 m l生理盐
水稀释 ,加等体积福氏佐剂充分乳化后 ,于兔背部皮
下多点注射。第一次基础免疫用福氏完全佐剂 ,以
后的加强免疫用福氏不完全佐剂。每次免疫间隔 2
周。每次免疫后 10 d在兔耳缘静脉抽取少许血 ,分
离血清 ,检测免疫效果。在血清效价达到 1∶40万以
上时 ,从颈动脉放血 ,分离血清。
1. 3　单克隆抗体的制备
1. 3. 1　动物免疫及杂交瘤细胞株的建立 [ 2 ] 　用 3
只 7～8周龄雌性 BALB /c小鼠 ,首次基础免疫用福
氏完全佐剂与等体积 HCG溶液 (HCG用量为 100
μg/只小鼠 )混合乳化后颈背部多点注射。两周后
作第 2次免疫 ,用福氏不完全佐剂与首次相同剂量
抗原乳化后颈背部多点注射。再两周后 EL ISA 法
测小鼠血清抗 HCG效价 ,选取一只最佳免疫小鼠融
合前 3 d腹腔注射抗原液 100μg作加强免疫。
取对数生长期的小鼠骨髓瘤 Sp2 /0细胞与免疫
脾细胞按常规方法用 50% PEG进行融合。用间接
EL ISA检测培养上清。选择强阳性克隆 ,用有限稀
释法连续克隆化 2～3次 ,直至有克隆孔 HCG抗体
100%阳性。将建立的稳定分泌高特异、高效价
HCG单克隆抗体的杂交瘤细胞株扩增培养后 ,置液
氮中保存。
1. 3. 2　腹水抗体的制备及特性分析　将各种抗 HCG
杂交瘤细胞分别接种于预先注射石蜡油致敏的成年
雌性 BALB /c小鼠腹腔内 , 7～10 d后收集腹水。
以间接 EL ISA 法对各种杂交瘤腹水的抗体效
价进行测定 ;将 LH、FSH两种标准品分别包被酶标
板 ,采用间接 EL ISA法对单克隆抗体特异性进行测
定 ;以免疫小鼠血清为阳性对照 , Sp2 /0细胞培养上
清为阴性对照。采用 SIGMA公司抗体亚型检测试
剂盒对单克隆抗体抗体类型及亚类进行测定。非竞
争酶免疫试验 [ 3 ]对单克隆抗体的亲和力常数进行
测定。
1. 4　抗体的纯化与鉴定
用辛酸一硫酸铵沉淀法纯化兔抗血清和小鼠腹
水 [ 4, 5 ]。用 SDS2PAGE法对抗体纯度进行鉴定 [ 6 ] ,
并用凝胶成像系统进行分析。采用紫外吸收法 [ 7 ]
对抗体浓度进行测定。
1. 5　抗体的标酶
利用改良过碘酸钠氧化法 [ 8 ]进行抗体标酶。
首先称取适量 HRP酶 ,溶于三蒸水中 ,加入新近配
制的过碘酸钠溶液 ,混匀后置 4℃, 30 m in;加入乙二
醇溶液 ,室温 , 30 m in;加入适量纯化抗体 ,混匀 ,调
pH值至 9. 0,放 4℃,过夜 ;加入硼氢化钠 ,混匀 ,置
4℃, 2 h;将酶标抗体混合液加入等体积饱和硫酸铵
溶液 ,置 4℃, 30 m in;离心后 ,用 pH7. 4的磷酸盐缓
冲液透析过夜。包被 HCG抗原 ,直接 EL ISA法测定
酶标抗体效价。
1. 6　EL ISA法标酶抗体配对及优化
1. 6. 1　双抗夹心 EL ISA检测方案 　用 0. 01 mol/L
pH9. 6碳酸盐缓冲液将多克隆抗体或单克隆抗体稀
释至 5μg /m l包被酶标板 , 4℃过夜 ;用 PBS/T20洗
板 3次 ,每次 3 m in;用含 3%小牛血清的 PBS/T20
封闭 , 37℃孵育 1 h,洗板 ;加入倍比稀释的 HCG溶
液 , 37℃孵育 45 m in,洗板 ;加入 HRP2单克隆抗体或
HRP2多克隆抗体 , 37℃, 30 m in,洗板 ;加入 TMB显
色液 , 37℃避光反应 15 m in后 ,加入终止液 ;读取波
长为 450 nm时的 OD值。
1. 6. 2　检测方案及其优化 　基本方案 1:多克隆抗
体包被酶标板 , HRP2单克隆抗体检测 ;基本方案 2:
单克隆抗体包被酶标板 , HRP2多克隆抗体检测。
为了最大限度地减小非特异性吸附造成的阴性
对照和空白对照读数过高 ,提高检测灵敏度 ,根据统
计学原理设计优化处理。酶标板采取封闭和不封闭
处理 , HRP2抗体分别采用 PBS/T20、含 3%小牛血清
的 PBS/T20、含 3%兔阴性血清的 PBS/T20和含 3%
小鼠阴性血清的 PBS/T20稀释。做完封闭或不封
闭后 ,直接加入用稀释液稀释的 HRP2抗体或用含有
其他动物血清的稀释液稀释的 HRP2抗体 ,其他试验
操作严格按 EL ISA 试验步骤进行。每个处理做 6
个重复。具体优化处理策略如表 1。
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2009年第 11期 张小兵等 :单克隆抗体与多克隆抗体配对 EL ISA方法比较
表 1　优化处理策略
封闭方式 HRP2抗体稀释方法
A PBS/T20 ① PBS/T20 ② 3%小牛血清·PBS/T20
B PBS/T20 ③ 3%兔阴性血清·PBS/T20 ④ 3%小鼠阴性血清·PBS/T20
C 3%小牛血清·PBS/T20 ⑤ PBS/T20 ⑥ 3%小牛血清·PBS/T20
D 3%兔阴性血清·PBS/T20 ⑦ PBS/T20 ⑧ 3%兔阴性血清·PBS/T20
E 3%小鼠阴性血清·PBS/T20 ⑨ PBS/T20 λυ 10 3%小鼠阴性血清·PBS/T20
2　结果与讨论
2. 1　兔抗 HCG多克隆抗体的获得
共免疫 1只新西兰大白兔。免疫 3次后 ,测定
效价达到 1∶40万以上 ,一次性获得抗血清 56 m l。
随后取 2. 8 m l进行纯化 ,获得 300μl纯化抗体。纯
化兔抗 HCG多抗蛋白含量用紫外分光光度法测定
为 10. 83 mg/m l,凝胶成像软件分析纯度可达 88%。
纯化后该多抗效价为 1∶20万。
2. 2　鼠抗 HCG单克隆抗体的获得
2. 2. 1分泌抗 HCG单克隆抗体的杂交瘤细胞株的
建立 　共进行了两次细胞融合 ,每次用 6块 96孔
板 ,平均每孔有 1～2株融合细胞生长 ,融合率为
100%。经过对阳性杂交瘤细胞株进行多次有限稀
释克隆 ,共获得 8株稳定分泌抗 HCG单克隆抗体杂
交瘤细胞株 ,经过初步的试验优选其中的 5株细胞
株进行下一步试验 ,分别命名为 4F6、4A9、3H9、2E3
和 4B11。
2. 2. 2　单克隆抗体的制备及纯化 　5株杂交瘤细
胞株分别注射到小鼠腹腔诱发腹水 ,每只获取 4～
8 m l的优质腹水 ,腹水效价为 40万 ～800万。分别
取 2～3 m l进行纯化 ,获得抗体约 250μl～300μl。
纯化后蛋白含量 15. 6 mg/m l～23. 5 mg/m l,凝胶成
像分析纯度达到 84% ～87%。
2. 2. 3　单克隆抗体的免疫学特性 　在包被 FSH和
LH的间接 EL ISA试验中 ,只有 4A9单克隆抗体与
FSH和 LH有交叉反应 ,其余皆无交叉反应。经亚
型检测试剂盒鉴定 , 5株抗体均为 IgG1。5株抗体
的亲和力常数为 1 ×107 ～ ×1010 L /mol。经比较后 ,
选择 2E3做下一步试验。
2. 3　HRP酶标抗体的获得
兔多克隆抗体标记 HRP酶后 ,效价为 20万 ,工
作浓度调整到 1∶1万。2E3单克隆抗体标记 HRP
酶后 ,效价为 80万 ,工作浓度调整到 1∶1万。
2. 4　双抗夹心 EL ISA检测结果
2. 4. 1　基本方案各优化结果 　基本方案 1各优化
处理结果如图 1。处理 A2②与处理 C2⑥、处理 B2③
与处理 D2⑧和处理B 2④与处理 E2⑩各组数据通过
单因数数据分析发现 ,在基本方案 1中酶标板的封
闭处理与不封闭处理显著性差异不明显 ( 0. 05水
平 ) ,即在该试验条件下酶标板可以不封闭。同时
该试验结果也提示 ,在用包被蛋白包被酶标板时 ,只
要蛋白浓度足够大 ,其完全可以占据所有的吸附位
点 ,从而在试验伊始就杜绝了酶标板壁空白位点的
非特异性吸附。在 EL ISA试验中 ,阴性对照和空白
对照的 OD值通常要控制在 0. 200以下 ,因此基本
方案 1各处理数据是可以接受的。但分别对封闭条
件下各处理组间的数据和不封闭条件下各处理组间
的数据进行分析时 ,笔者发现 HRP标记的鼠单抗用
含动物血清的稀释液稀释比单纯用稀释液稀释 ,其
所测得的 OD值要明显得低。说明稀释酶标单克隆
抗体时 ,用含动物血清的稀释液会降低非特异性
显色。
基本方案 2各试验处理结果如图 2,试验结果
显示只要包被蛋白浓度足够大 ,在基本方案 2中封
闭处理的意义并不大 ,与基本方案 1的结果相似 ;但
酶标记多克隆抗体用含动物血清的稀释液稀释与用
单纯的稀释液稀释 ,各处理组间却存在着极显著的
差异。
《抗体技术实验指南 》[ 9 ]一书中指出 :血清中总
抗体浓度是 10 mg/m l,特异性抗体的浓度通常小于
0. 5 mg/m l;而腹水中总抗体的浓度是 1～10 mg/m l,
特异性抗体的浓度是 0. 9～9 mg/m l。既然如此 ,设
想理想状态下 ,纯化后的多克隆抗体溶液中存在一
个特定的单位体积。在这个单位体积中 ,各种类抗
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体间分子的个数是最大公约数。例如 ,在这个单位
体积中 ,各种类抗体的分子个数的总数是 1 000个 ,
特异性抗体分子的个数可能是 49个 ,其他 951个抗
体分子就是非特异性抗体 ,即针对其他抗原或者非
目标抗原的抗体。在如此多得非特异性抗体中肯定
有与小鼠抗体 IgG结合的抗体 ,但数量不会太多 ,假
设是 10个抗体。
　　第一种情况 :用多克隆抗体包被酶标板 , HRP2
试单克隆抗体检测。在包被过程中 ,“Y”字型的蛋
白分子吸附到酶标板壁上 ,其方向性是随机的 ,可能
是 Fab端吸附到酶标板壁上 ,也可能是 Fc端或其他
的部位。但由于空间位阻的原因 ,只有 Fab端充分
暴露的多克隆抗体才能有效抓住抗原分子。如此算
来 ,用 1个上述单位体积多克隆抗体包被酶标板 ,其
中能有效抓住抗原分子的分子个数一般不会超过 3
个。此时 ,加入 HRP2试单克隆抗体会引起非特异性
吸附显色 ,可以将此时的显色强度定为 3。
第二种情况 :用单克隆抗体包被酶标板 , HRP2
试多克隆抗体检测。单克隆抗体的理化性状高度均
一 ,生物活性单一 ,并且与抗原的结合特异性强。因
此 ,如果用 1个单位体积的单克隆抗体包被酶标板 ,
吸附在酶标板上的能被多克隆抗体非特异结合的单
克隆抗体分子个数肯定要大大超过 10个。此时 ,加
入 HRP2试多克隆抗体所引起非特异性吸附显色强
度应该是 10,接近于第一种情况的 3倍 ,能与试验
结果相印证。
在第二种情况中 ,若 HRP2试多克隆抗体与浓度
远远高于它的动物血清一起加入酶标孔中 ,由于动
物血清中蛋白的种类和数量的庞大性 ,因此 ,对引起
非特异性吸附显色的 HRP2试多克隆抗体能起到竞
争性抑制的蛋白质分子 ,仅从数量上来说就非常庞
大。因此 ,在方案 2中 ,若用含动物血清的稀释液稀
释 HRP2多克隆抗体 ,可以解决空白对照和阴性对照
OD值高的问题。在方案 1中 ,用含动物血清的稀
释液稀释 HRP -单克隆抗体 ,本来已经很低的空白
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对照和阴性对照的 OD值也会有所降低 ,只是效果
不如方案 2明显而已。
腹水单克隆抗体中 ,特异性抗体数量约占总抗
体的 90% ,非特异性抗体仅占到 10% ,即非特异性
抗体中能结合兔源抗体的鼠源抗体的量非常少 ,所
造成的非特异性显色的强度也就非常小。虽然 ,抗
体间相互作用的情况远非讨论所叙述的那样简单 ,
但总的趋势大致如此 ,并且基本符合试验结果。
在后续的试验操作中 ,都未做封闭处理 ,只是酶
标抗体的稀释均采用含 3%小牛血清的 PBS/T20稀
释 ,其他步骤未做调整。
2. 4. 2　基本方案 EL ISA 检测结果 　在双抗夹心
EL ISA检测所有中 ,检测 HCG的初始浓度是 60μg/
m l,按 2n倍比稀释为不同的浓度 ,加入检测孔中。
基本方案 1的检测结果如图 3所示。由图 3可以看
出 ,基本方案 1的检测灵敏限是 29. 297 ng/m l。
图 3　基本方案 1 EL ISA检测结果
基本方案 2的检测结果如图 4所示。基本方案
2的检测灵敏限是 3. 662 ng/m l。由此可知基本方
案 2要比基本方案 1优越 ,灵敏度提高了约 9～10
倍。基本方案 1与基本方案 2的区别在于方案 1是
多克隆抗体捕获 HCG后 , HCG再结合酶标单克隆
抗体显色 ;方案 2是单克隆抗体捕获 HCG后 , HCG
再结合酶标多克隆抗体显色。在方案 1中 ,每个被
捕获的 HCG分子只能结合 1个酶标单克隆抗体 ;而
方案 2中 ,每个被捕获的 HCG分子可以结合多个酶
标多克隆抗体。这可能就是两个检测方案检测灵敏
度高低不同的关键所在。
图 4　基本方案 2 EL ISA检测结果
3　总结
总结以上试验结果 ,笔者认为用单克隆抗体包
被酶标板 ,捕获检测原 ,可保证检测的特异性 ;用酶
标多克隆抗体来检测 ,可提高检测的灵敏度 ;用含动
物血清的稀释液稀释酶标抗体 ,可保证对检测原的
高特异性和高灵敏度检测 ,此即双抗夹心 EL ISA检
测的最优方案。
参 考 文 献
1　裘法祖 ,武忠弼 ,吴在德 ,等 ,现代免疫学实验技术 [M ]. 武汉 :湖
北科学技术出版社 , 2002, 23～25.
2　金伯泉 ,等 ,细胞和分子免疫学实验技术 [M ]. 西安 :第四军医大
学出版社 , 2002, 9～17.
3　董志伟 ,王琰. 抗体工程 (第 2版 ) [M ]. 北京 :北京医科大学出
版社 , 2002, 218～225, 280～282.
4　 MckinneyMM, Parkinso A. ImmunolMethods, 1987, 96: 271.
5　 刘玉翠 , 邹岳奇 , 闫静辉 , 等. 河北省科学院学报 , 1991, 2:
56～61.
6　奥斯伯 F,等著 ,王海林 ,等译新编分子生物学实验指导 [M ]. 北
京 :科学出版社 , 1998, 333～338.
7　温进坤 ,韩梅 ,医学分子生物学原理与实验技术 [M ]. 上海 :上海
科学普及出版社 , 1999, 192～194.
8　刘玉翠 ,邹岳奇 ,闫静辉. 河北省科学院学报 , 1991, ( 1 ) : 39
～42.
9　哈洛 ,莱恩著 ,沈关心 ,等译 ,抗体技术实验指南 [M ]. 北京 :科学
出版社 , 2002, 3: 49.
921
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