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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2011 年第 10 期
CUP1 为筛选标记的酿酒酵母整合型多基因
表达载体的构建
阳辛凤1，2，3 徐林2 弓淑芳2 郭安平2 孔华2 贺立卡2
(1海南大学农学院，海口 570228;2中国热带农业科学院 热带生物技术研究所，
海口 571101;3中国热带农业科学院分析测试中心，海口 571101)
摘 要: 为了赋予工业酿酒酵母对淀粉和纤维素的降解活性，提高酿酒酵母对粗木薯粉进行酒精发酵时的酒精产率;另一
方面，为了解决工业酿酒酵母不适于使用营养缺陷型筛选标记对转化子进行筛选的问题，以及避免引入抗药性标记基因带来的
安全性问题，构建了以抗铜蛋白基因 CUP1为筛选标记的酿酒酵母整合型多基因表达载体。以载体 pYES2-PMF-rDNA为基础，
以新的筛选标记基因 CUP1替换原有的尿嘧啶 Ura-基因，得到载体 pYES2M。再顺序插入葡聚糖内切酶基因 eg3、葡萄糖淀粉酶
基因 ga1和 β-葡萄糖苷酶基因 bgl1，构建得到以 CUP1为筛选标记的酵母整合型三价表达载体 pYES2M-eg3-ga1-bgl1，其中每个
基因都具有独立而完整的表达盒，包括启动子、信号肽和终止子，从而实现多基因单表达载体一次转化。
关键词: 酿酒酵母 载体 CUP1 多基因转化
Construction of an Integrated Multi-gene Expression
Vector of Saccharomyces cerevisiae Using CUP1 as Selection Marker
Yang Xinfeng1，2，3 Xu Lin2 Gong Shufang2 Guo Anping2 Kong Hua2 He Lika2
(1Agricultural College，Hainan University，Haikou 570228;2 Institute of Tropical Bioscience and Biotechnology
CATAS，Haikou 571101;3Analysis and Test Center of CATAS，Haikou 571101)
收稿日期:2011-03-14
基金项目:国家“863”重点课题(2007AA021307) ，转基因生物新品种培育重大专项课题(2008ZX08012-04)
作者简介:阳辛凤，女，博士研究生，研究方向:微生物生物技术;E-mail:yangxinf@ sina． com
通讯作者:郭安平，E-mail:gap21l@ 126． com
Abstract: In order to make industrial Saccharomyces cerevisiae possessing degradation function to starch and cellulose，improve al-
cohol yield as alcohol fermentation on crude cassava by Saccharomyces cerevisiae，resolve the problem of auxotrophic selection marker not
fitting for the screening of industrial S． cerevisiae transformants and biosafety of drug-resistant marker genes，a yeast integrated multi-
gene expression vector was constructed using the copper resistance gene CUP1 as selection marker． Based on the vector pYES2-PMF-rD-
NA，the original Ura-gene was replaced by the new selection marker CUP1 and the new vector was named as pYES2M． Glucanase gene
eg3，glucoamylase gene ga1 and β-glucosidase gene bgl1 was inserted into pYES2M and a new yeast trivalent integrated expression vec-
tor pYES2M-eg3-ga1-bgl1 was constructed，in which CUP1 was selection marker． In the vector pYES2M-eg3-ga1-bgl1，each gene has an
independent and complete expression cassette，including promoter，signal peptide and the terminator． The study proved that transforma-
tion of multi-gene by one vector could be realized．
Key words: Saccharomyces cerevisiae Vector CUP1 gene Multi-gene transformation
工业酿酒酵母能将葡萄糖等底物转化为乙醇，
在酒精工业中被广泛应用［1］。随着对燃料酒精需
求的增加，利用木薯、甘薯、秸秆等非粮淀粉质原料、
木质纤维素原料等生物质生产燃料酒精已成趋
势［2］。这些生物质原料的特点是大分子水解为单
糖的过程需要众多酶的参与，且水解产物复杂。为
了节约酶制剂，同时将水解产物充分转化为乙醇，提
高酒精产率，降低生产成本，重要途径之一是对酿酒
酵母进行遗传改良，例如，构建能降解淀粉、纤维素
等大分子的多基因表达载体并转化工业酿酒酵母，
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2011 年第 10 期
赋予酿酒酵母多底物代谢和转化途径［3，4］。本研究
针对构建工业酿酒酵母多基因单转化整合型表达载
体这一环节，旨在将 3 个与糖代谢有关的基因以独
立表达盒形式串联在同一表达载体上，为后续的具
有多底物代谢功能的工业酿酒酵母工程菌的构建奠
定基础。在构建工业酿酒酵母整合型多基因转化载
体时，为了避免引入抗药性标记(如 G418 等) ，增加
生物安全，本试验选择抗铜基因 CUP1 作为抗性筛
选标记。
1 材料与方法
1． 1 材料
1． 1． 1 菌株与质粒 试验所用的供试菌株、质粒的
相关信息如表 1 所示。
表 1 试验所用的菌株与质粒
菌株及质粒 表型 /基因型 来源 菌株及质粒 表型 /基因型 来源
E． coli DH5α 本实验室保存
pMD19T-simple vector Ampr 购自 TaKaRa公司
pYES2 Ampr，Ura －，2μ ori，fi ori， 购自 Invitrogen 公司
pUC ori
pYES2M Ampr，Cupr，fi ori，pUC ori， 本研究制备
rDNA fragment，Ppgk，α-MF
pMD19T-egT Ampr 本研究制备
pMD19T-PMFbgl1 Ampr 本研究制备
pMD19T-PMFgaT Ampr 本研究制备
1． 1． 2 试剂 高保真酶 High Fidelity PCR Enzyme
Mix、Rapid DNA Ligation Kit、限制性内切酶 SphⅠ(Pae
Ⅰ)、SmiⅠ(SwaⅠ)、AgeⅠ(BshTⅠ)、FastDigest Sph I、
FastDigest Aff Ⅲ(BspT I)、FastDigest Kpn2 I、FastDi-
gest NheⅠ、FastDigest SnaBⅠ、XbaⅠ、NotⅠ、Esp3Ⅰ、二硫
苏糖醇(DTT)为 Fermentas公司产品。
1． 1． 3 仪器 美国 Bio-profil 凝胶成像分析系统，
北京六一仪器厂 DYY-6B 电泳仪，德国 Sigma Sig-
ma2-16K高速泠冻离心机。
1． 1． 4 培养基 LB (Luria-Bertani)培养基［5］。
1． 2 方法
PCR扩增体系与条件，DNA与载体连接体系与
条件，酶切体系与条件，大肠杆菌 DH5α的转化与筛
选，质粒 DNA的提取参考文献［5，6］。
2 结果
2． 1 载体 pYES2 的构建
以 Esp3Ⅰ /Nhe Ⅰ对质粒 pMD19T-CUP1 进行双
酶切，得到 CUP1 片段。表达载体 pYES2-PMF-rD-
NA 同样进行 Esp3Ⅰ /Nhe Ⅰ双酶切，电泳，回收
CUP1 片段和线性化的 pYES2-PMF-rDNA 大片段，
两个片段通过 DNA 连接酶进行连接。连接产物转
化感受态 E． coli DH5α，筛选转化子，用含氨苄青霉
素的 LB 液体培养基培养，提取质粒。首先电泳检
测可能带有 CUP1 片段的克隆，然后进行菌液 PCR
验证和酶切验证。菌液 PCR结果(图 1)生成约 600
bp的片段。酶切鉴定结果见图 2，Esp3Ⅰ /Nhe Ⅰ双
酶切生成约 600 bp的目的片段和约 7 kb的 pYES2-
PMF-rDNA载体片段，说明 CUP1 片段已连接到 pY-
ES2-PMF-rDNA载体上，构建得到重组质粒 pYES2-
PMF-rDNA-CUP1。将该重组载体命名为 pYES2M。
M．分子量标准 DL2000;1-13． PCR 扩增产物;14． CUP1
片段，阳性对照;15．阴性对照
图 1 质粒 pYES2M 菌液 PCR验证
M．分子量标准 DL10000;1，2． 质粒 pYES2M;3，4． pY-
ES2M Esp 3Ⅰ /Nhe Ⅰ双酶切产物
图 2 质粒 pYES2M Esp 3Ⅰ /Nhe Ⅰ酶切验证
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2011 年第 10 期 阳辛凤等:CUP1 为筛选标记的酿酒酵母整合型多基因表达载体的构建
将 pYES2M通过电转仪转化酿酒酵母，涂布在
Cu2 +梯度浓度的 YPD平板上，发现 Cu2 +浓度等于或
低于 10． 0 mmol /L，菌落长势良好;Cu2 + 浓度高于
10． 0 mmol /L，平板上菌落数量极少或无菌落生长，所
以选择 10． 0 mmol /L 作为初筛浓度。初筛获得的转
化子再进一步在 Cu2 +更高的选择平板上进行复筛
(图 3) ，以筛选出整合了多拷贝外源基因的转化子。
图 3 转化子在 Cu2 +浓度为 12． 5 mmol /L
筛选平板上生长状况
2． 2 质粒 pYES2M-egT的构建
将葡聚糖内切酶 eg3 基因与终止子 Tcyc 通过
重叠延伸 PCR拼接起来得到 egT。egT 片段 中 eg3
的 5端有 Not I 位点，终止子 T 的 3端有 BspT I 和
Xba I两个位点(图 4)。这 3 个酶切位点是在引物
设计时引入的，有两个用途，一是通过 Not I /Xba I
将 egT 切下并连接到 pYES2M 多克隆位点;二是
BspT I /Xba I 之间可以插入下一个基因片段。
将 egT 与 T 载体连接得到 pMD19T-egT。以
Not Ⅰ /XbaⅠ对质粒 pMD19T-egT 进行双酶切，得到
egT片段。载体 pYES2M同样进行 Not Ⅰ /Xba Ⅰ双
酶切，电泳，回收 egT片段和线性化的 pYES2M大片
段，两个片段通过 DNA连接酶进行连接。连接产物
转化感受态 E． coli DH5α，筛选转化子用含氨苄青霉
素的 LB 液体培养基培养，提取质粒。先电泳检测
可能带有 egT 片段的克隆，然后进行酶切验证。酶
切鉴定结果见图 5，Not Ⅰ /Xba Ⅰ双酶切生成约 1． 6
kb的 egT 片段和约 7． 3 kb 的 pYES2M 载体片段，
BspT Ⅰ、Xba I 酶切均生成约 9 kb 的片段，表明，
BspT Ⅰ、Xba I 在 pYES2M-egT 有唯一酶切位点，这
些位点可用于后续基因片段的插入。表明已构建得
到质粒 pYES2M-egT。
2． 3 双价载体 pYES2M-eg3-bgl1 的构建
以前期构建的载体 pYES2M-bgl1 为模板，PCR
扩增得到约 3． 3 kb PMFbgl1 片段，即由启动子
Ppgk、信号肽 α-MF、β-葡萄糖苷酶基因 ga1 组成的
基因片段。PMFbgl1 片段启动子的 5端有 BspT I和
Kpn2 I两个位点，终止子 T的 3端有 Xba I位点(图
4)。这 3 个酶切位点是引物设计时引入的，有两个
用途，一是通过 BspT I /Xba I 将 PMFbgl1 切下并连
接到 pYES2M-egT 中 BspT I /Xba I 位点，二是 Kpn2
I /BspT I 之间可以插入其他基因片段。
将 PMFbgl1 与 T 载体连接得到质粒 pMD19T-
PMFbgl1。以 BspTⅠ / XbaⅠ对质粒 pMD19T-PMFb-
gl1 进行双酶切，得到约 3． 3 kb PMFbgl1 片段。表
达载体 pYES2M-egT 同样进行 BspTⅠ / XbaⅠ双酶
切，电泳，回收 PMFbgl1 片段和线性化的 pYES2M-
egT大片段，两个片段通过 DNA 连接酶进行连接。
连接产物转化感受态 E． coli DH5α，筛选转化子，用
含氨苄青霉素的 LB 液体培养基培养，提取质粒。
先电泳检测可能带有 PMFbgl1 片段的克隆，然后进
行菌液 PCR验证和酶切验证，PCR 验证结果如图 6
所示，酶切鉴定结果如图 7 所示。PCR 产物有约
2. 2 kb 的 ga1 片段和 716 bp 的 UCori 片段(载体
pYES2M上的基因片段)。BspTⅠ / XbaⅠ双酶切双
酶切产物得到约 10 kb 的载体片段和约 3． 3 kb 的
PMFbgl1 片段。另外，BspTⅠ、Kpn2Ⅰ在 pYES2-eg-
bgl上只有唯一酶切位点。证明构建得到双价载体
pYES2M-egT-PMFbgl1，其中 eg3 和 bgl1 均各自带有
包括启动子、信号肽和终止子的独立表达盒，将该双
价重组载体命名为 pYES2M-eg3-bgl1。
2． 4 三价载体 pYES2M-eg3-ga1-bgl1 的构建
以前期构建的载体 pYES2M-ga1 为模板，PCR
扩增得到约 3． 5 kb PMFgaT 片段(即由启动子
Ppgk、信号肽 α-MF、葡萄糖淀粉酶基因 ga1 和终止
子 Tcyc组成的表达盒)。将 PMFgaT与 T 载体连接
得到质粒 pMD19T-PMFgaT。以 BspT I / Kpn2 I对质
粒 pMD19T-PMFgaT 进行双酶切，得到 PMFgaT 片
段。表达载体 pYES2M-eg3-bgl1 同样进行 BspT I /
Kpn2 I 双酶切，得到约 12 kb 大片段，电泳，回收
PMFgaT片段和线性化的 pYES2M-eg3-bgl1 大片段，
两个片段通过 DNA连接酶进行连接。连接产物转
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生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2011 年第 10 期
图 4 重组载体 pYES2M-eg3-ga1-bgl1 构建流程图
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2011 年第 10 期 阳辛凤等:CUP1 为筛选标记的酿酒酵母整合型多基因表达载体的构建
M．分子量标准 DL10000;1，2，3． pYES2M-egT Not Ⅰ /
Xba Ⅰ双酶切产物;4． 质粒 pYES2M-egT，对照;5-7． pY-
ES2M-egT BspT Ⅰ单酶切产物;8-12． pYES2M-egT XbaⅠ
单酶切产物
图 5 pYES2M-egT 酶切验证
A:M．分子量标准DL10000;1-15． PCR扩增产物;16． bgl1片段作为阳性对照
B:M．分子量标准DL2000;1-15． PCR扩增产物;16． UCori片段作为阳性对照
图 6 pYES2M-eg3-bgl1 菌液 PCR验证
M．分子量标准 DL10000;1，2． pYES2M-eg3-bgl1 XbaⅠ /
BspTⅠ双酶切产物;3，4． pYES2M-eg3-bgl1 Kpn2Ⅰ单酶
切产物;5，6． pYES2M-eg3-bgl1 BspTⅠ单酶切产物;7，质
粒 pYES2M-eg3-bgl1 作为对照
图 7 pYES2M-eg3-bgl1 酶切验证
化感受态 E． coli DH5α，涂布含氨苄青霉素的 LB 平
板，筛选转化子，用含氨苄青霉素的 LB 液体培养基
培养，提取质粒。先电泳检测可能带有 PMFgaT 片
段的克隆，然后进行菌液 PCR 验证和酶切验证，
PCR验证结果如图 8，酶切鉴定结果如图 9 所示。
PCR产物有约 1． 84 kb 的 ga1 片段和 716 bp 的
UCori片段，BspT I / Kpn2 I 双酶切产物得到约 12
kb的载体片段和约 3． 5 kb 的 PMFgaT 片段，BspT
Ⅰ、Kpn2Ⅰ在三价载体上均只有唯一酶切位点，证
明构建得到双价载体 pYES2M-egT-PMFgaT-bgl1，其
中 eg3、ga1 和 bgl1 均各自带有包括启动子、信号肽
和终止子的独立表达盒，将该三价重组载体命名为
pYES2M-eg3-ga1-bgl1。
A:M． 分子量标准 DL10000;1 － 16． PCR 扩增产物，ga1
片段;17． ga1 片段作为阳性对照;B:M． 分子量标准
DL2000;1 － 16． PCR 扩增产物，UCori 片段;17． UCori
片段作为阳性对照
图 8 三价载体 pYES2M-eg3-ga1-bgl 1 菌液 PCR验证
M．分子量标准 DL10000;1 － 3． pYES2M-eg3-ga1-bgl1
BspT I /Kpn2 I 双酶切产物;4 － 6． pYES2M-eg3-ga1-bgl1
BspTⅠ单酶切产物;7 － 9． pYES2M-eg3-ga1-bgl1 Kpn2Ⅰ
单酶切产物;10．质粒 pYES2M-eg3-ga1-bgl1 作为对照
图 9 三价载体 pYES2M-eg3-ga1-bgl1 酶切验证
构建好的载体 pYES2M-eg3-ga1-bgl1 中含有
rDNA片段，可以通过在载体和 3 个外源基因上都无
切割位点的限制性内切酶 Sph I 进行酶切使线性
化，通过同源重组使载体整合到酵母基因组上［7 － 9］，
从而实现多基因单表达载体一次转化。
3 讨论
构建多价载体常用的方法是将多个外源基因融
合在一起，使其处于同一表达框(ORF)内，在同一
个启动子下转录成一个转录单元，翻译后得到一个
大的嵌合重组蛋白［10］。本研究将多个外源基因的
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生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2011 年第 10 期
独立表达盒串联在同一载体上，每个外源基因均有
各自的启动子、终止子等调控元件，转录时作为独立
的转录单元，最终表达出多个独立的重组蛋白而非
融合重组蛋白［11］。
三价载体中每个基因都以独立表达盒形式存
在，每个基因的完整表达框碱基数都较多，一般都在
几个 kb 以上，通过 PCR 扩增时如此长的片段时应
选用高保真酶;而且，事先需要将结构基因插入到一
个中间载体的多克隆位点上，该中间载体的多克隆
位点前有启动子和信号肽，多克隆位点后有终止子，
以该中间载体为模板进行长片段 PCR 扩增出需要
的完整或部分表达盒。将结构基因及其调控序列
PCR扩增后作为一个大片段插入载体的多克隆位
点，可以节省酶切位点。
PCR表达盒或片段时，通过 PCR在表达盒或片
段的两端引入适当的酶切位点，为下一个表达盒或
片段的插入提供位点。通过这种方式，理论上可以
插入很多基因。但在选择酶切位点时，由于要受到
外源基因及载体本身序列中酶切位点的限制，实际
上选择范围不多。如果必要，可对基因进行点突变
以去除不期望的酶切位点。
参 考 文 献
［1］武志强，贾耐兵，李娜，等． 酵母整合型载体的构建及其功能分
析．生物学通报，2008，43(5) :47-50．
［2］ Jeyaprakash A，Welch JW，Fogel S． Multicopy CUP1 plasmids en-
hance cadmium and copper resistance levels in yeast． Mol Gen Gen-
et，1991，225(3) :363-8．
［3］姜伯乐，吴圣进，何勇强．酵母耐铜基因 CUP1 改良荧光假单胞
菌耐铜性研究初报．农业生物技术科学，2007，23(9) :96-99．
［4］Stroobants A，Delroisse JM，Delvigne F，et al． Isolation and biomass
production of a Saccharomyces cerevisiae strain binding copper and
zinc ions． Applied Biochemistry and Biotechnology，2010，157(1) :
85-97．
［5］奥斯伯 FM，布伦特 R，金斯顿 RE，等． 分子生物学实验指南
［M］．北京:科学出版社，2005．
［6］Den Haan R，Rose SH，Lynd LR，et al． Hydrolysis and fermentation
of amorphous cellulose by recombinant Saccharomyces cerevisiae．
Metabolic Engineering，2007(9) :87-93．
［7］姜勇，张学成，孙平楠，等．以 rDNA 为同源重组位点酵母表达鲑
鱼降钙素基因多拷贝整合载体的构建． 中国海洋大学学报，
2009，39(3) :443-447．
［8］刘向勇，沈煜，郭亭，等． rDNA 介导的多拷贝整合表达载体的构
建及其在酿酒酵母工业菌株中的应用．山东大学学报:理学版，
2005，40(3) :105-109．
［9］Klabunde J，Diesel A，Waschk D，et al． Single-step co-integration of
multiple expressible heterologous genes into the ribosomal DNA of
the methylotrophic yeast Hansenula polymorpha． Appl Microbiol Bio-
technol，2002，58:797-805．
［10］别晓敏，佘茂云，杜丽璞，等．植物多基因转化研究进展．中国农
业科技导报，2010，12(6) :18-23．
［11］朱华晨，许新萍，肖国樱，等．利用四价抗病基因提高超级杂交
稻的抗性．中国科学 C 辑:生命科学，2006，36 (4) :320-327．
(责任编辑 李楠)
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