全 文 ：综述与专论
生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2010年第 10期
反向重复结构在抗植物病毒上的研究进展
胡琼
(杭州万向职业技术学院,杭州 310023)
摘 要: 双链 RNA( dsRNA )的形成是启动 RNA沉默的关键因子, 而插入了反向重复结构的表达载体能有效地转录产
生 hpRNA,从而能高效启动 RNA沉默。分析了反向重复结构构建的特点,综述了近些年利用该结构启动 RNA沉默后在抗植
物病毒上的研究进展。
关键词: 反向重复结构 hpRNA 抗植物病毒
Advance in the Research of Inverted Repeats in P lant Virus Resistance
Hu Q iong
(H angzhou Wanx iang Poly technic, H angzhou 310023)
Abstrac:t The form ation of dsRNA is the key to induce RNA silenc ing. Expression vec to r w ith inve rted repeats can transc ript
hpRNA wh ich started up RNA silenc ing effectively. Th is paper ana ly zed the tra it o f the fram e, and rev iewed the advance in the resea rch
o f plant virusresistance
Key words: Inverted repea ts hpRNA P lan t v irus resistance
收稿日期: 20100407
作者简介:胡琼,女,博士,讲师,研究方向:植物保护、生物化学和分子生物学; Em ai:l h angzhouhq@ yahoo. com. cn
植物病毒引起的作物病害, 有 植物癌症 之
称, 是一种全球性的病害。全球每年农作物由于
病毒病的损失可以达到 200亿美元。到目前为
止, 全世界发现的植物病毒种类已超过 900种 [ 1]。
农业措施、抗病育种、脱毒和繁育无病毒苗木、化
学药剂防治、脱毒疫苗的应用等是比较常用的防
治病毒的方法,但防治效果并不理想。目前利用生
化技术及基因工程如获得抗病毒转基因植株等是新
的、有一定效果的防治途径 [ 2] , 如利用 RNA干扰技
术植物可以对大量的病毒产生抗性, 故用病原 dsR
NA s转化大麦、烟草、番茄等获得多种抗病毒转基因
植物。
RNA沉默是近些年的焦点话题。最早是在
1928年 W ingard[ 3]发现烟草接种了烟草环斑病毒
( TRSV )后在原始接种叶上会出现坏死斑, 而新叶
却无症,且该烟草对该病毒的二次侵染表现抗性。
这个现象在当时还无法解释。 1990年 Napo li等把
苯基苯乙烯酮合成酶基因 ( CHS)转入矮牵牛, 希望
通过增加 CHS基因的拷贝数来加深花的颜色, 结果
却出现转基因植株部分或全部开白花,表明转基因
植株中内源基因表达受到了抑制, 该现象被植物学
家称为共抑制 ( cosuppression)或转录后基因沉默
( posttranscriptional gene silencing, PTGS) [ 4 ]。
1 反向重复结构在 RNA沉默环节中的构建
特点
RNA沉默是真核生物共有的、在转录后水平起
作用的同源依赖的基因沉默现象, 双链 RNA ( dsR
NA )高效启动 RNA沉默后,被 D icer(RNA酶 样的
核酸酶 )切割成 21- 26 nt的小的干扰型 RNA ( siR
NA s) ,随后 siRNAs整合入 RNA诱导的沉默复合物
( R ISC ),并引导 R ISC对与其同源的目标 RNA进行
降解。故其抗病毒策略则是利用病原 dsRNA引起
与之同源的病毒 mRNA的降解 [ 5]。试验证明, 在众
多的 RNA沉默机制中, dsRNA介导的基因沉默最有
效,如通过 hpRNA ( hairpin RNA )诱导基因沉默的效
率要远高于正义或反义链插入诱导的效果。 hpRNA
的形成途径是首先将体外构建的反向重复结构 ( in
verted repeats, IR) cDNA引入转基因植株。反向重
生物技术通报 B iotechnology Bulletin 2010年第 10期
复结构由两段 IR DNA序列和一段其它 DNA ( spac
er)序列组成, 两段 IR DNA由 spacer连接起来, 转
录后会形成发夹结构 ( hpRNA )。 hpRNA由 茎
( stem, IR DNA 转录的产物配对形成的双链 )和
环 ( spacer, DNA转录的单链结构 )组成。该途径
产生的 dsRNA是稳定的, 可高水平地诱发基因沉
默。如上文所提, D icer主要对 hpRNA 中的双链
茎部分进行切割,因此茎是诱发基因沉默的关键
部位,且其长短和来源对 RNA沉默的效率和稳定性
有很大的影响 [ 6 ]。W esley等 [ 7]发现当插入片段的
茎长在 98- 853 bp时, 所构建的不同表达载体,转
化后均可以使 90% - 100%的转基因植物产生基因
沉默现象。而李云等 [ 8, 9]研究发现 hpRNA中的环
区段与 PTGS没有直接的关系, 但适宜的茎环比例
(如41、21和 11), 可能是获得高效基因沉默效
率和高效基因克隆的关键, 因为环的长度可影响转
基因转录后 hpRNA的形成和稳定性,进而影响基因
沉默的效率。
2 反向重复结构在抗植物病毒病中的应用
利用反向重复序列, 使得以前某些不能用单链
RNA来沉默的转基因变得可行。因此导入反向重
复片段后转录产生 hpRNA ( dsRNA )是利用 RNA沉
默技术抗植物病毒病的重点 [ 10]。
2. 1 IR结构在体外转录出的 hpRNA在抗病毒中
的应用
张德咏等 [ 11]以 CMV AN株系的 CP基因为环,
分别构建了含有 RNA2片段和 MP基因反向重复片
段的原核表达载体。表达这两种 hpRNA的细菌破
碎液诱导烟草对 CMV产生的抗性分别为 45%和
60%,而对照发病率均为 100%。用农杆菌培养液
浸润接种植物组织来瞬时表达基因可向植物投递
RNA沉默诱导因子等。T enllado等 [ 9]发现用含有
PMM oV 54 kD区域的 hpRNA而形成 dsRNA的农杆
菌浸润接种后的本氏烟对 PMM oV有抗性, 且该外
源 dsRNA对植物病毒侵染的干涉作用与 RNA沉默
有直接联系。该结果与用 dsRNA摩擦接种植物叶
片中所产生的干涉效果相似,都缺乏同源细胞核因
子、转基因或内源基因等因子, 同时又不具有持续输
入适量外源 dsRNA的能力,以致特定信号分子不能
向植物其他部分传递。
2. 2 IR结构在体内转录出的 hpRNA在抗病毒中
的应用
目前研究比较成熟的是利用 IR结构在转基因
植物中产生病原 dsRNA ( hpRNA )分子防治植物病
毒病,主要是针对植物 RNA病毒病方面的防治。
2. 2. 1 粮食作物方面 为了防治大麦黄矮病毒病
( BYDV )这种全世界范围内危害严重的病害, W ang
等 [ 12]构建了包含部分 BYDV PAV 序列的发夹结
构, 转化入大麦后该结构转录产生的 hpRNA启动
RNA沉默机制,使获得的大麦转化体中有 40%的植
株对 BYDVPAV表现了抗性, 在部分转基因大麦植
株中该抗性表现为免疫且能稳定遗传。几年后, 也
是针对该病毒,中国农科院燕飞博士等通过农杆菌
介导法、基因枪法和花粉管通道法等不同方法对小
麦进行遗传转化构建有 BYDVGPV株系的复制酶
基因 ( Rep)片段和外壳蛋白基因 ( CP)片段的、可转
录出 hpRNA的真核表达载体, 表明 70%左右的转
基因小麦有抗性。水稻矮缩病毒病 ( RDV )是一种
在水稻上危害极重的病害, M a等 [ 13]以该病毒基因
组中第 8片段编码区 627 bp的序列为茎构建含有
反向重复结构的表达载体后转化水稻,结果发现该
转基因水稻对 RDV高抗或延迟发病。
2. 2. 2 经济作物方面 用与李痘病毒 ( PPV ) RNA
基因组同源的 197 bp片段作为反向重复序列双臂、
中间有 intron的发夹结构, Pando lfin i等 [ 14 ]转化培育
了对 PPV表现出系统抗性的转基因本氏烟,且该抗
性能够稳定遗传。D iN icolaNegri等 [ 15 ]利用 PPV M
分离物的 P1和 HCPro抑制子蛋白不同基因序列构
建了 4种含有发夹结构的载体, 转化培育后的转基
因本氏烟及其后代对 PPV的抗性可达到 90%以上。
Bucher等 [ 16]将番茄斑萎病毒属中 4种病毒的 N
gene序列同时反向重复构建到一个载体上, 转化培
育出来的转基因本氏烟 82%能同时对这四种病毒
产生抗性且遗传稳定。该试验说明培育广谱抗性转
基因作物也可以利用 RNA沉默。朱常香等 [ 17]分别
以 PVY、TMV和 CMV的 CP 3端 100- 200 bp长度
的 cDNA以反向重复的形式插入植物表达载体后转
化烟草,试验结果表明有 1/5的 T0代转基因烟草对
该 3种病毒有抗性。
M issiou等 [ 18]转化了构建了包含有 PVYCP 3
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2010年第 10期 胡琼:反向重复结构在抗植物病毒上的研究进展
末端部分保守序列反向重复结构的表达载体, 结果
发现 80%的转基因番茄株系对 3种株系的 PVY均
高抗,且能检测到基因沉默发生后的产物 siRNA,有
意思的是, 该抗性不受其它病毒共同侵染的影响。
Ba i等 [ 19]将包含有 PVXCP和 PVYN ib部分序列的
反向重复结构构建到无标记基因的表达载体上,转
化培育了双抗 PVX和 PVY的转基因马铃薯, 杂交
检测结果显示有基因沉默的特异性 siRNA产生。
该研究为生产高生物安全性和双抗病毒转基因马铃
薯提供了一条可靠而有效的途径。虽然类病毒是一
种只有 246- 401 nt的小单链环状 RNA病原物,但
类病毒对植物的侵染在许多方面都与病毒类似,
RNA沉默对类病毒侵染的植物同样有效。W ang
等 [ 20]研究发现, 表达马铃薯纺锤形块茎类病毒
( PSTVd)特异反向重复结构的转基因马铃薯在接种
PSTVd前若已积累高浓度的 PSTV d特异 siRNA,则
抗 PSTVd。
2. 2. 3 模式植物拟南芥方面 有研究者将包含有
发夹结构 Pream iRNA的农杆菌浸润拟南芥,检测结
果显示,该转基因拟南芥对 TYMV或 TuMV的抗性
很强且能遗传 [ 21]。
Lapidot和 Friedman等在 2002年提出假设, 认
为 RNA沉默也能作为抗 DNA病毒的手段,其实在
1991年 Day等 [ 22]就报道用能转录出正反义链 RNA
互补结构 ( hpRNA )的转基因植株抗番茄金色花叶
病毒 ( TGMV )。Yang等 [ 23]也将此方法用于对番茄
黄曲叶病毒病 ( TYLCV)的防治中。几年后 G afn i和
他的团队也通过导入反向重复结构沉默 TYLCV CP
基因而获得了抗性植株。 Pooggin等 [ 24 ]构建了包含
有豇豆绒斑黄花叶病毒 ( VMYMV )保守区域的 IR
结构, 转化后的转基因植株在接种后能恢复无症。
众多后续的研究也证明,引入 hpRNA表达 siRNA而
培育出来的转基因植物对植物 DNA病毒病没有很
明显的抗性,只会表现为症状的延迟。
3 展望
随着各种病毒基因测序的完成, 利用病毒本身
的一些基因导入植物从而获得抗病毒植株, 是植物
抗病毒基因工程常用的策略。RNA沉默已被证实
是许多真核生物天然的固有的重要的自身抗病毒策
略,利用该机制所得抗病毒转基因植物中既不存在
有功能的病毒基因或蛋白, 也不存在转基因 mRNA
的积累,因而不存在发生互补、异源包壳、协生和重
组的风险,符合人们对生物安全性的高要求 [ 25]。因
此,如何主动利用 RNA沉默机制来获取抗病毒转基
因植物是基因工程控制植物病毒病害的重要方法。
dsRNA分子已被公认是高效诱导所有生物体中发
生 RNA沉默的关键因子, 而且目前大部分常用作物
已建立起成熟的遗传转化体, 因此可转化插入人工
设计的长度适宜的包含有转病毒基因序列的反向重
复结构 (转录后产生 dsRNA )的表达载体, 在转基因
作物体内快速、高效地启动 RNA沉默机制。另外,
综合很多新的研究我们也发现, 田间病毒容易发生
复合侵染或重组, 将易流行病株的高度保守序列部
分融合在一起,使其形成串联的反向重复序列,类似
于同时获得多个抗性基因, 可同时抑制多个病毒的
基因表达,为培育抗多种病毒的转基因植株提供了
新的途径。
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