全 文 ：核 农 学 报　 ２０１４，２８（１）：００４４ ～ ００５１
Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｎｕｃｌｅａｒ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ
收稿日期：２０１３⁃０１⁃２１　 接受日期：２０１３⁃０３⁃２８
基金项目：甘肃省科技支撑计划（１０１１ＮＫＣＡ０７７ ）
作者简介：高宜峰，男，主要从事作物遗传育种研究。 Ｅ⁃ｍａｉｌ：３５４６８９９３７＠ ｑｑ． ｃｏｍ
通讯作者：张金文，男，教授，主要从事生物技术在作物育种中应用研究。 Ｅ⁃ｍａｉｌ：ｊｗｚｈａｎｇ３０５＠ １６３． ｃｏｍ
文章编号：１０００⁃８５５１（２０１４）０１⁃００４４⁃０８
ＴＭＶ、ＰＶＭ和 ＣＭＶ干扰载体构建及对人参果遗传转化
高宜峰１，２，３ 　 张菲菲３ 　 张金文１，２，３ 　 陆艳梅１，２，３ 　 魏桂民１，２，３ 　 马廷蕊１，２，３
（ １ 甘肃省作物遗传改良与种质创新重点实验室，甘肃 兰州　 ７３００７０；２ 甘肃省干旱生境作物学
重点实验室，甘肃 兰州　 ７３００７０；３ 甘肃农业大学农学院，甘肃 兰州　 ７３００７０）
摘　 要：人参果是以营养器官繁殖为主的多年生草本植物，连年种植易造成多种病毒病积累。 为了寻求
一种能同时抵御多种病毒病的方法，本试验以危害人参果的 ３ 种主要病毒为研究对象，根据 ＧｅｎＢａｎｋ中
烟草花叶病毒（ＴＭＶ）Ｐ１２６ 基因、马铃薯 Ｍ病毒（ＰＶＭ）ＣＰ 基因和黄瓜花叶病毒（ＣＭＶ）２ｂ 蛋白基因序
列，利用 Ｅ⁃ＲＮＡｉ 网站提供的分析软件，筛选出含有较多有效小干扰 ＲＮＡ［ ｓｉＲＮＡ，１９ ｎｔ］的长 ｄｓＲＮＡ
（Ｌｏｎｇ ｄｓＲＮＡ）片段作为 ＲＮＡｉ的靶序列。 用重叠延伸 ＰＣＲ方法将三个靶标片段融合在一起，构建了一
种具有内含子（ ｉｎｔｒｏ）的反向重复结构和嵌合基因的植物 ＲＮＡｉ 表达载体 ｐＣＥＩＨＦＲ。 将 ｐＣＥＩＨＦＲ 通过
冻融法导入农杆菌 ＬＢＡ４４０４ 并转化人参果，经过草甘膦筛选和 ＰＣＲ检测，确认其中的 ２４ 株为转基因阳
性植株。
关键词：烟草花叶病毒；马铃薯 Ｍ病毒；黄瓜花叶病毒；ｉｈｐＲＮＡ；转基因人参果
ＤＯＩ：１０：１１８６９ ／ ｊ． ｉｓｓｎ． １００⁃８５５１． ２０１４． ０１． ００４４
　 　 人参果（Ｓｏｌａｎｕｍ ｍｕｒｉｃａｔｕｍ Ａｉｔ． ）系茄科直立半木
质化、高度杂合体的多年生草本植物，从栽培品种的果
实中获取的种子不能繁殖纯种，较少用于生产，通常采
用扦插或者体外微繁技术繁殖。 人参果果肉清香多
汁，低糖、低脂肪，富含硒和钼等多种微量元素，老少皆
宜食用。 人参果的成熟期比其他已知的茄科植物（如
茄子、辣椒和西红柿等）更长，在我国北方多以温室栽
培为主，植株能够连续生长结实近 １０ 年。 然而，不规
范的无性繁殖及连年高温高湿的栽培环境使田间病毒
病的发生流行日趋严重。
调查研究发现，甘肃省河西走廊的人参果种植区
域出现了大面积病害，表现为植株矮化、节间变短；叶
片皱缩、呈黄绿相嵌的斑驳状；果实僵化、畸形，品质退
化且产量大幅下降。 发病严重的区域植株大面积死
亡，农户经济损失惨重，严重影响人参果产业的发展。
根据其症状初步判断为病毒病感染；酶联免疫吸附实
验和分子生物学检测结果进一步表明该地区人参果植
株主要感染了烟草花叶病毒（ＴＭＶ）、马铃薯 Ｍ 病毒
（ＰＶＭ）以及黄瓜花叶病毒（ＣＭＶ）。
ＲＮＡ 干扰 （ ＲＮＡｉ）是指生物体内的双链 ＲＮＡ
（ｄｓＲＮＡ）在 ｍＲＮＡ 水平上靶基因表达关闭或沉默的
过程［１］。 已有的研究表明，将不同植物病毒的有效核
酸（ｃＤＮＡ）片段拼接成嵌合基因，构建成具有特殊结
构的植物 ＲＮＡ干扰表达载体转化植物，可以获得同时
抗多种病毒病的转基因植株［２ － ４］。 研究表明，靶标片
段的来源［５ － ６］以及载体的插入片段结构［７ － １０］ 影响
ＲＮＡｉ效率。 本试验综合考虑前人研究成果，构建了优
化插入结构的 ＲＮＡｉ 植物表达载体，通过转化人参果
验证，获得了 ２４ 株转基因阳性植株，为后续病毒侵染
实验及获得抗病毒人参果植株奠定了基础。
１　 材料和方法
１􀆰 １　 材料
人参果感病植株采自甘肃省河西走廊感病区的塑
料大棚。 大肠杆菌 Ｅ． ｃｏｌｉ ＤＨ５ａ和 Ｅ． ｃｏｌｉ Ｋ１２、中间载
体质粒 ｐＨＡＮＩＢＡＬ 和表达载体质粒 ｐＣＥＰＳＰＳ 均由本
实验室保存（其中 ｐＣＥＰＳＰＳ 载体是将 ｐＣＭＢＩＡ１３００ 载
４４
　 １２ 期 ＴＭＶ、ＰＶＭ和 ＣＭＶ干扰载体构建及对人参果遗传转化
体中的潮霉素抗性基因（ｈｙｇ）替换为草甘膦抗性基因
（ｅｐｓｐｓ）的衍生载体）。 ＲＮＡ 提取试剂盒、小量 ＤＮＡ
胶回收试剂盒、 高保真 ＤＮＡ 聚合酶 （ Ｐｆｕ ＤＮＡ
Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ）及平末端片段 ３′端加碱基 Ａ 反应液购自
天根生化科技（北京）有限公司。 Ｔａｑ ＤＮＡ 聚合酶、克
隆载体 ｐＭＤ１９ － Ｔ、标准 ＤＮＡ 分子量 Ｍａｒｋｅｒ、限制性
内切酶、Ｔ４ ＤＮＡ Ｌｉｇａｓｅ购自 ＴａＫａＲａ（大连）有限公司，
其他试剂均为进口或国产分析纯。 ＰＣＲ 引物合成及
ＤＮＡ序列测定由生工生物（上海）有限公司完成。
１􀆰 ２　 方法
１􀆰 ２􀆰 １　 靶标片段的克隆
１􀆰 ２􀆰 １􀆰 １　 靶标片段的选择及引物设计　 以 ＧｅｎＢａｎｋ 中
ＴＭＶ Ｐ１２６ 基因 ［ＧＩ：３７１７８６０６９］、ＰＶＭ ＣＰ 基因 ［ＧＩ：
３６１０７１２９６］以及 ＣＭＶ ２ｂ 蛋白基因［ＧＩ：８３２８２７１５］为基
础片段筛选最佳靶标片段，由于后期构建载体需要，分
别将这三个蛋白基因中 ＸｈｏⅠ、ＫｐｎⅠ、ＣｌａⅠ、ＸｂａⅠ、ＳａｃⅠ和
ＰｓｔⅠ六种酶切位点剔除后的片段输入 ＲＮＡｉ设计网站 Ｅ⁃
ＲＮＡｉ，为了控制靶标片段融合后的总长度，在网站中限
定这三个蛋白基因的靶标片段长度范围分别为 ２００ ｂｐ、
３００ ｂｐ和 ２５０ ｂｐ，其它参数为网站默认。 将筛选出的最
佳靶标片段扩增区域（最佳靶标片段信息见表 １）分别
命名为 Ｔ、Ｐ、Ｃ，并分别放入生物学软件 Ｏｌｉｇｏ６􀆰 ０ 优化引
物，使退火温度相差 ２ 度以便于融合，并在各引物的 ５′
端加上合适的酶切位点以便于酶切链接。 靶标片段的
扩增及融合基因的构建所用到的引物见表 ２，送生工生
物（上海）有限公司合成。
表 １　 Ｅ⁃ＲＮＡｉ 网站给出靶标片段的各项参数
Ｔａｂｌｅ １　 Ｔｈｅ ｐａｒａｍｅｔｅｒｓ ｏｆ ｔｈｅ ｔａｒｇｅｔ ｆｒａｇｍｅｎｔ ｉｎ ｔｈｅ Ｅ⁃ＲＮＡｉ ｗｅｂｓｉｔｅ ｇｉｖｅｓ
靶标基因
Ｔａｒｇｅｔ ｇｅｎｅ
靶标片段
长度
Ｐｒｏｄｕｃｔ
ｌｅｎｇｔｈ ／ ｂｐ
ｓｉＲＮＡ
总数
ｓｉＲＮＡｓ，１９ ｎｔ
中靶 ｓｉＲＮＡ数
Ｏｎ⁃ｔａｒｇｅｔ
“脱靶”
ｓｉＲＮＡ数
Ｏｆｆ⁃ｔａｒｇｅｔ
无目标
ｓｉＲＮＡ数
Ｎｏ⁃ｔａｒｇｅｔ
有效
ｓｉＲＮＡ数
Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ
ｓｉＲＮＡｓ
有效 ｓｉＲＮＡ
平均分
Ａｖｇ ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ
ｓｃｏｒｅ
低复杂度
区域数
ＬｏｗＣｏｍｐｌｅｘ
Ｒｅｇｉｏｎｓ
ＣＡＮ
重复数
ＣＡＮ
ＴＭＶ Ｐ１２６ １８７ １６９ ０ ０ １６９ １６７ ５２􀆰 ２８ ０ ０
ＰＶＭ ＣＰ ２９２ ２７４ ０ ０ ２７４ ２６１ ４９􀆰 ８８ ０ ０
ＣＭＶ ２ｂ ２３４ ２１６ ０ ０ ２１６ ２０８ ５２􀆰 ２１ ０ ０
　 　 注：综合考虑网站给出的 ｓｉＲＮＡｓ 数、Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｓｉＲＮＡｓ 数和 Ａｖｇ ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ ｓｃｏｒｅ，选择最佳靶标片段。
Ｎｏｔｅ： Ｓｅｌｅｃｔｉｎｇ ｔｈｅ ｂｅｓｔ ｔａｒｇｅｔ ｆｒａｇｍｅｎｔ ｔｈｒｏｕｇｈ ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ ｃｏｎｓｉｄｅｒｉｎｇ ｔｈｅ ｏｖｅｒａｌｌ ｎｕｍｂｅｒ ｏｆ ｓｉＲＮＡｓ ａｎｄ ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｓｉＲＮＡｓ ａｎｄ ｔｈｅ ａｖｅｒａｇｅ ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ
ｓｃｏｒｅ ｏｆ Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｓｉＲＮＡｓ．
表 ２　 构建载体用到的引物
Ｔａｂｌｅ ２　 Ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｐｒｉｍｅｒｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｖｅｃｔｏｒ
引物名称
Ｐｒｉｍｅｒｓ ｎａｍｅ
引物序列
Ｐｒｉｍｅｒｓ ｓｅｑｕｅｎｃｅ
产物（代号）
Ｐｒｏｄｕｃｔ（Ｃｏｄｅ）
酶切位点
Ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ ｓｉｔｅｓ
Ｔ５ － １
Ｔ３ － １
５′ＣＣＧ ＣＴＣＧＡＧ ＧＧＡＡＧＴＡＴＣＡＴＧＴＧＧＣＣＣＡＴＴ３′
５′ＣＣＧＴＣＣＡＣＡＡＧＡＡＣＡＡＣＣＴＴ３′
ＴＭＶ Ｐ１２６
靶标片段（Ｔ）
ＸｈｏⅠ
无
Ｐ５ － １
Ｐ３ － １
５′ＡＡＡＴＡＴＧＣＧＣＣＣＡＧＡＴＣＣＴＡＣ３′
５′ＣＴＴＣＴＴＣＡＧＣＡＣＡＧＣＣＡＡＧＡＣＧ３′
ＰＶＭ ＣＰ
靶标片段（Ｐ）
无
无
Ｃ５ － １
Ｃ３ － １
５′ＡＡＧＧＴＣＴＣＡＣＡＡＧＡＡＧＡＡＴＣＧＡＣ３′
５′ＧＧ ＧＧＴＡＣＣ ＴＴＡＣＣＡＧＣＧＡＡＣＣＡＡＴＣＴＧＴＡＴＣ３′
ＣＭＶ ２ｂ
靶标片段（Ｃ）
无
ＫｐｎⅠ
Ｐ５ －１
Ｐ３ － ２
５′ＡＡＡＴＡＴＧＣＧＣＣＣＡＧＡＴＣＣＴＡＣ３′
５′ＴＣＴＴＣＴＴＧＴＧＡＧＡＣＣＴＴＣＴＴＣＴＴＣＡＧＣＡＣＡＧＣＣＡＡＧＡＣ３′
Ｐ片段 ＋ Ｃ片段
５′端 １７ ｂｐ碱基（Ｍ）
无
无
Ｐ５ － １
Ｃ３ － １
５′ＡＡＡＴＡＴＧＣＧＣＣＣＡＧＡＴＣＣＴＡＣ３′
５′ＧＧ ＧＧＴＡＣＣ ＴＴＡＣＣＡＧＣＧＡＡＣＣＡＡＴＣＴＧＴＡＴＣ３′
融合基因（ＰＣ） 无
ＫｐｎⅠ
Ｔ５ －１
Ｔ３ － ２
５′ＣＣＧ ＣＴＣＧＡＧ ＧＧＡＡＧＴＡＴＣＡＴＧＴＧＧＣＣＣＡＴＴ３′
５′ＧＡＴＣＴＧＧＧＣＧＣＡＴＡＴＴＴＣＣＧＴＣＣＡＣＡＡＧＡＡＣＡＡＣＣＴＴ３′
ＸｈｏⅠ
无
Ｔ５ － １
Ｃ３ － １
５′ＣＣＧ ＣＴＣＧＡＧ ＧＧＡＡＧＴＡＴＣＡＴＧＴＧＧＣＣＣＡＴＴ３′
５′ＧＧ ＧＧＴＡＣＣ ＴＴＡＣＣＡＧＣＧＡＡＣＣＡＡＴＣＴＧＴＡＴＣ３′
正向插入片段（Ｆ） ＸｈｏⅠ
ＫｐｎⅠ
Ｔ５ －２
Ｃ３ － ２
５′ＧＣ ＴＣＴＡＧＡ ＧＧＡＡＧＴＡＴＣＡＴＧＴＧＧＣＣＣＡＴＴ３′
５′ＣＣ ＡＴＣＧＡＴ ＴＴＡＣＣＡＧＣＧＡＡＣＣＡＡＴＣＴＧＴ３′
反向插入片段（Ｒ） ＸｂａⅠ
ＣｌａⅠ
　 　 注：下划线代表酶切位点和保护碱基，粗体代表重叠的 １７ ｂｐ碱基。
Ｎｏｔｅ： Ｔｈｅ ｕｎｄｅｒｌｉｎｅ ｒｅｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｖｅｓ ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ ｓｉｔｅｓ ａｎｄ ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ ｂａｓｅｓ， ｔｈｅ ｂｏｌｄ ｔｙｐｅ ｒｅｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｖｅｓ ｏｖｅｒｌａｐｐｉｎｇ １７ ｂｐ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ．
５４
核　 农　 学　 报 ２７ 卷
１􀆰 ２􀆰 １􀆰 ２　 人参果病叶总 ＲＮＡ的提取　 用天根生化科
技（北京）有限公司的总 ＲＮＡ 提取试剂盒（目录号：
ＤＰ４１９）提取感病人参果叶片的总 ＲＮＡ，并用天根生化
科技（北京）有限公司的 ｃＤＮＡ 第一链合成试剂盒（目
录号：ＫＲ１０４）将总 ＲＮＡ 反转录成 ｃＤＮＡ 备用。 操作
步骤除了在反转录时加入 Ｒａｎｄｏｍ 和 ｏｌｉｇｏ（ｄＴ） １５引物
各 １ μＬ外，其它严格按照试剂盒附带的说明书进行操
作。
１􀆰 ２􀆰 １􀆰 ３　 靶标片段 Ｔ、Ｐ、Ｃ的扩增　 以表 ２ 所示 Ｔ５ －
１ ／ Ｔ３ － １、Ｐ５ － １ ／ Ｐ３ － １ 和 Ｃ５ － １ ／ Ｃ３ － １ 序列为上 ／下
游引物，以 ｃＤＮＡ 第一链为模板，摸索出最佳的 ＰＣＲ
扩增体系为：５ μＬ １０ × ＰＣＲ Ｂｕｆｆｅｒ（Ｍｇ２ ＋ Ｐｌｕｓ），４ μＬ
ｄＮＴＰ Ｍｉｘｔｕｒｅ（各 ２􀆰 ５ ｍｍｏｌ·Ｌ － １），上 ／下游引物（各 １０
ｐｍｏｌ·μＬ － １ ）各 １ μＬ，０􀆰 ２５ μＬ ＴａＫａＲａ Ｔａｑ （５ Ｕ·
μＬ － １），０􀆰 １ μｇ ～ １ μｇ 模板，加灭菌蒸馏水至 ５０ μＬ。
ＰＣＲ反应条件为：９４℃预变性 ３ ｍｉｎ；９４℃ ３０ ｓ，退火温
度分别为 ５５􀆰 ９℃ ／ ５６􀆰 ６℃ ／ ５５􀆰 ５℃ ３０ ｓ，７２℃ １ ｍｉｎ，３０
个循环数；７２℃延伸 ５ ｍｉｎ；１６℃保存。 取 ５ μＬ ＰＣＲ产
物进行琼脂糖凝胶电泳检测，分别回收目的条带连接
ｐＭＤ１９ － Ｔ载体并送生工生物（上海）有限公司测序。
１􀆰 ２􀆰 ２　 靶标片段 Ｔ、Ｐ、Ｃ 的融合以及反向插入片段 Ｒ
的合成　 采用重叠延伸 ＰＣＲ 技术（ ｓｐｌｉｃｉｎｇ⁃ｂｙ⁃ｏｖｅｒｌａｐ
ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ ＰＣＲ，ＳＯＥ⁃ＰＣＲ），首先构建融合基因 ＰＣ，然
后再构建正向插入片段 Ｆ。
以 Ｐ５ － １ ／ Ｐ３ － ２ 为上 ／下游引物，以靶标片段 Ｐ
为模版，合成 ３‘端与靶标片段 Ｃ ５’端重叠 １７ ｂｐ 碱基
的片段 Ｍ；以 Ｔ５ － １ ／ Ｔ３ － ２ 为上 ／下游引物，靶标片段
Ｔ为模板，合成 ３’端与片段 Ｍ ５’端重叠 １７ ｂｐ 碱基的
片段 Ｎ。
１􀆰 ２􀆰 ２􀆰 １　 靶标片段 Ｐ、Ｃ融合　 以片段 Ｍ和靶标片段
Ｃ为模板，两步 ＰＣＲ法构建融合基因 ＰＣ。 第一步反应
体系为：２􀆰 ５ μＬ １０ × ＰＣＲ Ｂｕｆｆｅｒ （ Ｍｇ２ ＋ Ｐｌｕｓ），２ μＬ
ｄＮＴＰ Ｍｉｘｔｕｒｅ （各 ２􀆰 ５ ｍｍｏｌ·Ｌ － １ ），０􀆰 ５ μＬ Ｐｆｕ ＤＮＡ
Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（２􀆰 ５ Ｕ·μＬ － １），加灭菌蒸馏水至 ２５ μＬ。 第
一步反应条件为：９４℃ ３ ｍｉｎ； ９４℃ ３０ ｓｅｃ，５７℃ ３０ ｓ，
７２℃ １ ｍｉｎ，１０ ｃｙｃｌｅｓ；７２℃ ５ ｍｉｎ；１６℃保存。 第二步
反应体系为：在第一步反应产物内，补充加入以下试
剂：２􀆰 ５ μＬ １０ × ＰＣＲ Ｂｕｆｆｅｒ （Ｍｇ２ ＋ Ｐｌｕｓ），２ μＬ ｄＮＴＰ
Ｍｉｘｔｕｒｅ（各 ２􀆰 ５ ｍｍｏｌ·Ｌ － １），Ｐ５ － １（１０ ｐｍｏｌ·μＬ － １）和
Ｃ３ － １ （１０ ｐｍｏｌ·μＬ － １ ）各 １ μＬ；０􀆰 ５ μＬ Ｐｆｕ ＤＮＡ
Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（２􀆰 ５ Ｕ·μＬ － １）；加灭菌蒸馏水至 ５０ μＬ。 第
二步反应条件为：９４℃ ３ ｍｉｎ；９４℃ ３０ ｓｅｃ，５７℃ ３０ ｓ，
７２℃ １ ｍｉｎ，２０ ｃｙｃｌｅｓ；７２℃ ５ ｍｉｎ；１６℃保存。 取 ５ μＬ
ＰＣＲ产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，回收目标片段。
１􀆰 ２􀆰 ２􀆰 ２　 靶标片段 Ｔ、ＰＣ 融合 　 以靶标片段 Ｔ 和融
合基因 ＰＣ为模板，两步 ＰＣＲ法构建正向插入片段 Ｆ：
方法参照靶标片段 Ｐ、Ｃ的融合，只是将第一步反应体
系的模板改为 Ｎ和 ＰＣ，第一步反应条件的退火温度改
为 ４６ 度；第二步反应体系上 ／下游引物改为 Ｔ５ － １ ／ Ｃ３
－ １，第二步反应条件退火温度改为 ６０℃。 回收目标
片段，即为正向插入片段 Ｆ。 用平末端片段 ３′端加 Ａ
反应液在 Ｆ的 ３′端添加 Ａ碱基，连接至 ｐＭＤ１９ － Ｔ 载
体，酶切检测正确后送生工生物（上海）有限公司测
序，并将重组子命名为 ｐＭＤ１９Ｔ⁃Ｆ。
１􀆰 ２􀆰 ２􀆰 ３　 反向插入片段 Ｒ 的合成　 以正向插入片段
Ｆ为模板，Ｔ５ － ２ ／ Ｃ３ － ２ 为上 ／下游引物，扩增反向插
入片段 Ｒ。 并将反向插入片段 Ｒ 连接入 Ｔ －载体，经
酶切检测正确后，将重组子命名为 ｐＭＤ１９Ｔ⁃Ｒ。
１􀆰 ２􀆰 ３　 ＲＮＡｉ中间载体的构建　 用 ＸｈｏⅠ／ ＫｐｎⅠ分别
消化连接有正向插入片段 Ｆ 的 Ｔ －载体 ｐＭＤ１９Ｔ⁃Ｆ 和
含有 ｐｄｋ内含子（ｉｎｔｒｏ）的质粒载体 ｐＨＡＮＮＩＢＡＬ，回收
目的片段，经 Ｔ４ ＤＮＡ 连接酶连接，获得具有内含子
（ｉｎｔｒｏ）和正向插入片段的重组子，经酶切鉴定正确后
命名为 ｐＨＡＩＦ；用 ＣｌａⅠ／ ＸｂａⅠ分别消化连接有反向
插入片段 Ｒ的 Ｔ －载体 ｐＭＤ１９Ｔ⁃Ｒ 和载体 ｐＨＡＩＦ，回
收目的片段，经 Ｔ４ ＤＮＡ连接酶连接，获得具有内含子
（ｉｎｔｒｏ）连接的正、反向插入片段的重组子 ＲＮＡｉ 中间
载体，经酶切鉴定正确后命名为 ｐＨＡＩＦＲ。
１􀆰 ２􀆰 ４　 ＲＮＡｉ表达载体的构建 　 用 ＳａｃⅠ／ ＰｓｔⅠ分别
消化载体 ｐＨＡＩＦＲ 和 ｐＣＥＰＳＰＳ，回收目的片段，经 Ｔ４
ＤＮＡ连接酶连接，获得具有内含子连接的发卡 ＲＮＡ
（ｉｎｔｒｏｎ ｓｐｌｉｃｉｎｇ ｈｐＲＮＡ，ｉｈｐＲＮＡ）结构的重组子 ＲＮＡｉ
表达载体，经酶切鉴定正确后送生工生物（上海）有限
公司测序，并将重组子命名为 ｐＣＥＩＨＦＲ（图 １）。
１􀆰 ２􀆰 ５　 ＲＮＡｉ表达载体转化农杆菌及鉴定　 用冻融法
将 ｐＣＥＩＨＦＲ转化农杆菌 ＬＢＡ４４０４，转化细胞均匀涂布
于含有链霉素和利福平的 ＹＥＰ固体培养基，２８℃培养
２ ｄ后，挑取单克隆接种到含有相同浓度的链霉素和
利福平的 ＹＥＰ 液体培养基，２８℃震荡培养 ２ ｄ 后提取
质粒，分别用特异引物 Ｔ５ － １ ／ Ｔ３ － １、Ｐ５ － １ ／ Ｐ３ － １、Ｃ５
－ １ ／ Ｃ３ － １、Ｐ５ － １ ／ Ｃ３ － １ 和 Ｔ５ － １ ／ Ｃ３ － １ 扩增质粒，
鉴定阳性克隆。
１􀆰 ２􀆰 ６　 农杆菌介导的人参果茎段遗传转化及鉴定　
以人参果试管苗茎段（去腋芽）为受体材料进行农杆
菌遗传转化，激素配方参照 Ａｔｋｉｎｓｏｎ 等［１１］的研究，筛
选培养基中加入 ５０ μｍｏｌ·Ｌ － １草甘膦。 当获得的抗性
幼苗长到 １ ｃｍ 左右时，切下转入生根培养基（ＭＳ ＋
０􀆰 ３ ｍｇ·Ｌ － １ ＩＢＡ ＋ ３０ μｍｏｌ·Ｌ － １草甘膦）进行生根筛选
６４
　 １２ 期 ＴＭＶ、ＰＶＭ和 ＣＭＶ干扰载体构建及对人参果遗传转化
注：ＲＢ：右边界；ＯＣＳ⁃ｔｅｒ：ＯＣＳ 终止子；Ａｎｔｉ⁃Ｓｅｎｓｅ：反向插入片段；ｐｄｋ ｉｎｔｒｏ：ＰＤＫ内含子；Ｓｅｎｓｅ：正向插入片段；３５Ｓ Ｐｒｏ：ＣａＭＶ ３５Ｓ 启动子；
ＥＰＳＰＳ：草甘膦抗性基因；３５Ｓ ｔｅｒ：ＣａＭＶ３５Ｓ终止子；ＬＢ：左边界。
Ｎｏｔｅ： ＲＢ： Ｒｉｇｈｔ ｒｏａｒｄｅｒ； ＣＯＳ⁃ｔｅｒ： ＯＣＳ ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ； Ａｎｔｉ⁃ｓｅｎｓｅ： Ｆｒａｇｍｅｎｔ ｉｎ ａｎｔｉ⁃ｓｅｎｓｅ ｏｒｉｅｎｔａｔｉｏｎ； ｐｄｋ ｉｎｔｒｏ； Ｓｅｎｓｅ： Ｆｒａｇｍｅｎｔ ｉｎ ｓｅｎｓｅ ｏｒｉｅｎｔａｔｉｏｎ；
３５Ｓ Ｐｒｏ： ＣａＭＶ ３５Ｓ ｐｒｏｍｏｔｅｒ； ＥＰＳＰＳ： Ｇｌｙｐｈｏｓａｔｅ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｇｅｎｅ； ３５Ｓ⁃ｔｅｒ： ＣａＭＶ ３５Ｓ ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ； ＬＢ： Ｌｅｆｔ ｒｏａｒｄｅｒ．
图 １　 ｐＣＥＩＨＦＲ表达载体结构示意图
Ｆｉｇ． １　 Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｍａｐ ｏｆ ｐＣＥＩＨＦＲ ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ ｖｅｃｔｏｒ
直至形成完整再生植株。 以提取再生植株叶片基因组
ＤＮＡ为模板，分别以 Ｔ５ － １ ／ Ｔ３ － １、Ｐ５ － １ ／ Ｐ３ － １ 和
Ｃ５ － １ ／ Ｃ３ － １ 为上 ／下游引物进行 ＰＣＲ 扩增，检测阳
性克隆。
２　 结果与分析
２􀆰 １　 靶标片段 Ｔ、Ｐ、Ｃ的克隆
以人参果感病叶片的总 ＲＮＡ 为模版（图 ２ 泳道
１、２），经反转录获得 ｃＤＮＡ第一链，再以 ｃＤＮＡ第一链
为模板，分别以 Ｔ５ － １ ／ Ｔ ３ － １、Ｐ５ － １ ／ Ｐ３ － １、Ｃ５ － １ ／
Ｃ３ － １ 为上 ／下游引物扩增到长度（含有酶切位点和保
护碱基）约为 ２００ ｂｐ（图 ２ 泳道 ３、４）、３００ ｂｐ（图 ２ 泳
道 ５、６）和 ２５０ ｂｐ（图 ２ 泳道 ７、８）的特异片段，与预期
靶标片段大小一致。 回收扩增片段，并与克隆载体
ｐＭＤ１９ － Ｔ 连接，送生工生物（上海）有限公司测序。
测序结果分别与 ＧｅｎｅＢａｎｋ 中 ＴＭＶ Ｐ１２６ 基因 ［ ＧＩ：
１６１１６８４５０］、ＰＶＭ ＣＰ 基因［ＧＩ：３６１０７１２９６］、ＣＭＶ ２ｂ
蛋白基因 ［ ＧＩ： １１５３３５０８８ ］ 的序列同源性达到了
９９％ 、９９％和 ９４％ ，说明成功克隆到了靶标片段。
２􀆰 ２　 靶标片段 Ｔ、Ｐ、Ｃ 的融合以及反向插入片段 Ｒ
的合成
采用重叠延伸 ＰＣＲ 技术 （ ｓｐｌｉｃｉｎｇ⁃ｂｙ⁃ｏｖｅｒｌａｐ
ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ，ＳＯＥ），连接 ＰＶＭ ＣＰ和 ＣＭＶ ２ｂ 的靶标片段
Ｐ和 Ｃ，得到大小约为 ５００ ｂｐ（图 ３ 泳道 １、２）的融合基
因 ＰＣ，同样方法连接 ＴＭＶ Ｐ１２６ 靶标片段 Ｔ和融合基
因 ＰＣ，构建正向插入片段 Ｆ，大小约为 ７００ ｂｐ（图 ３ 泳
道 ３、４），回收片段 Ｆ并与 ｐＭＤ１９ － Ｔ载体连接，经 Ｘｈｏ
Ⅰ／ ＫｐｎⅠ双酶切鉴定（图 ３ 泳道 ５），送生工测序后有
两个碱基发生突变，由于融合片段不需要在生物体内
表达蛋白，不影响后续实验，并将重组子命名为
注：１，２：ＲＮＡ电泳图片；Ｍ：ＤＬ１０００ ＤＮＡ 分子标准；３，４：靶
标片段 Ｔ扩增条带；５，６：靶标片段 Ｐ扩增条带；７，８：靶标片
　 　 　 段 Ｃ扩增条带。
Ｎｏｔｅ： １， ２： ＲＮＡ ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｔｏｇｒａｍ； Ｍ： ＤＬ１０００ ＤＮＡ
ｍａｒｋｅｒ； ３，４： Ｔａｒｇｅｔ ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｔ； ５，６： Ｔａｒｇｅｔ ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｐ；
　 　 　 ７，８： Ｔａｒｇｅｔ ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｃ．
图 ２　 提取 ＲＮＡ检测和靶标片段检测
Ｆｉｇ． ２　 Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ＲＮＡ ａｎｄ Ｔａｒｇｅｔ ｓｅｑｕｅｎｃｅ
ｐＭＤ１９Ｔ⁃Ｆ。
然后再以正向插入片段 Ｆ 为模板，Ｔ５ － ２ ／ Ｃ３ － ２
为上 ／下游引物，扩增反向插入片段 Ｒ，回收 Ｒ 片段并
与 ｐＭＤ１９ － Ｔ 载体连接，酶切条带与预期大小一致
（图 ３ 泳道 ６），说明成功克隆到反向插入片段 Ｒ，并将
重组子命名为 ｐＭＤ１９Ｔ⁃Ｒ。
２􀆰 ３　 ＲＮＡｉ中间载体 ｐＨＡＩＦＲ和表达载体 ｐＣＥＩＨＦＲ
的构建
２􀆰 ３􀆰 １　 ＲＮＡｉ中间载体 ｐＨＡＩＦＲ的构建
２􀆰 ３􀆰 １􀆰 １ 　 正向片段 Ｆ 插入 ｐＨＡＮＮＩＢＡＬ 质粒 　 用
ＸｈｏⅠ／ ＫｐｎⅠ 分 别 消 化 载 体 ｐＭＤ１９Ｔ⁃Ｆ 和 载 体
ｐＨＡＮＮＩＢＡＬ，回收目的片段，经 Ｔ４ ＤＮＡ 连接酶连接
后得到载体 ｐＨＡＩＦ，克隆转化，提取质粒，分别进行
ＸｈｏⅠ单酶切检测（图 ４ 泳道 １）、ＸｈｏⅠ／ ＫｐｎⅠ双酶切
７４
核　 农　 学　 报 ２７ 卷
注：Ｍ１，Ｍ２：ＤＬ１０００ ＤＮＡ分子标准；Ｍ３：ＤＬ５０００ ＤＮＡ 分子标准；１，
２：靶标片段 Ｐ和 Ｃ融合基因；３，４：靶标片段 Ｔ、Ｐ和 Ｃ 融合基因；５：
ｐＭＤ１９Ｔ⁃Ｆ经 ＸｈｏⅠ／ ＫｐｎⅠ双酶切检测；６：ｐＭＤ１９Ｔ⁃Ｒ 经 ＣｌａⅠ／ Ｘｂａ
　 　 　 Ⅰ双酶切检测。
Ｎｏｔｅ： Ｍ１，Ｍ２： ＤＬ１０００ ＤＮＡ ｍａｒｋｅｒ； Ｍ３： ＤＬ５０００ ＤＮＡ ｍａｒｋｅｒ； １，２：
Ｔｈｅ ｆｕｓｉｏｎ ｇｅｎｅ ｏｆ Ｐ ａｎｄ Ｃ； ３，４： Ｔｈｅ ｆｕｓｉｏｎ ｇｅｎｅ ｏｆ Ｔ、Ｐ ａｎｄ Ｃ； ５：
Ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｐＭＤ１９Ｔ⁃Ｆ； ６： Ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｐＭＤ１９Ｔ⁃Ｒ．
图 ３　 靶标片段的融合及酶切鉴定
Ｆｉｇ． ３　 Ｔｈｅ ｆｕｓｉｏｎ ｏｆ ｔａｒｇｅｔ ｆｒａｇｍｅｎｔ ｔｈｅｎ ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ
ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｐＭＤ１９Ｔ⁃Ｆ ａｎｄ ｐＭＤ１９Ｔ⁃Ｒ
检测（图 ４ 泳道 ２）、ＸｈｏⅠ／ ＸｂａⅠ双酶切检测（图 ４ 泳
道 ３），得到的条带和预期大小一致。
２􀆰 ３􀆰 １􀆰 ２　 反向片段 Ｒ插入 ｐＨＡＮＮＩＢＡＬ质粒　 用 Ｃｌａ
Ⅰ／ ＸｂａⅠ分别消化载体 ｐＭＤ１９Ｔ⁃Ｆ 和载体 ｐＨＡＩＦ，回
收目的片段，经 Ｔ４ ＤＮＡ 连接酶连接，构建了 ＲＮＡｉ 中
间载体 ｐＨＡＩＦＲ，克隆转化，提取质粒，分别进行 ＣｌａⅠ
单酶切检测（图 ４ 泳道 ４），ＣｌａⅠ／ ＸｂａⅠ双酶切检测
（图 ４ 泳道 ５），ＸｈｏⅠ／ ＸｂａⅠ双酶切检测（图 ４ 泳道
６），得到的条带和预期大小一致。
２􀆰 ３􀆰 ２　 ＲＮＡｉ表达载体 ｐＣＥＩＨＦＲ 的获得 　 用 ＳａｃⅠ／
ＰｓｔⅠ分别消化载体 ｐＨＡＩＦＲ 和载体 ｐＣＥＰＳＰＳ，回收目
的片段，经 Ｔ４ ＤＮＡ 连接酶连接，构建了植物表达载体
ｐＣＥＩＨＦＲ，分别进行 ＰｓｔⅠ／ ＳａｃⅠ双酶切检测（图 ４ 泳
道 ７），ＫｐｎⅠ／ ＸｂａⅠ双酶切检测（图 ４ 泳道 ８），ＳａｃⅠ
单酶切检测（图 ４ 泳道 ９），得到和预期大小一致的条
带。 并对 ｐＣＥＩＨＦＲ进行测序，结果表明已成功将启动
子、终止子和发卡结构转入载体 ｐＣＥＰＳＰＳ。
２􀆰 ４　 ＲＮＡｉ表达载体 ｐＣＥＩＨＦＲ转化农杆菌及其鉴定
将 ＲＮＡｉ 表达载体 ｐＣＥＩＨＦＲ 转化农杆菌菌株
ＬＢＡ４４０４，提取质粒，分别用引物 Ｔ５ － １ ／ Ｔ３ － １、Ｐ５ －
１ ／ Ｐ３ － １、 Ｃ５ － １ ／ Ｃ３ － １、Ｐ５ － １ ／ Ｃ３ － １ 和 Ｔ５ － １ ／ Ｃ３ －
１ 进行 ＰＣＲ鉴定，目标条带大小与预期一致（图 ５ 泳
道 １、２、３、４、５），证明目标载体已成功转入农杆菌。
２􀆰 ５　 转化再生苗的获得及检测
通过对人参果试管苗茎段进行遗传转化，将获得
注：Ｍ：ＤＬ１００００ ＤＮＡ分子标准；１：重组质粒 ｐＨＡＩＦ经 ＸｈｏⅠ单
酶切鉴定；２：重组质粒 ｐＨＡＩＦ 经 ＸｈｏⅠ／ ＫｐｎⅠ双酶切鉴定；３：
重组质粒 ｐＨＡＩＦ 经 ＸｈｏⅠ／ ＸｂａⅠ双酶切鉴定；４：重组质粒
ｐＨＡＩＦＲ经 ＣｌａⅠ单酶切鉴定；５：重组质粒 ｐＨＡＩＦＲ 经 ＣｌａⅠ／
ＸｂａⅠ双酶切鉴定；６：重组质粒 ｐＨＡＩＦＲ 经 ＸｈｏⅠ／ ＸｂａⅠ双酶
切鉴定；７：重组表达载体 ｐＣＥＩＨＦＲ 经 ＰｓｔⅠ／ ＳａｃⅠ双酶切鉴
定；８：重组表达载体 ｐＣＥＩＨＦＲ经 ＫｐｎⅠ／ ＸｂａⅠ双酶切鉴定；９：
　 　 重组表达载体 ｐＣＥＩＨＦＲ经 ＳａｃⅠ单酶切鉴定。
Ｎｏｔｅ： Ｍ： ＤＬ１００００ ＤＮＡ ｍａｒｋｅｒ； １： Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｐｌａｓｍｉｄ ｐＨＡＩＦ
ｄｉｇｅｓｔｅｄ ｂｙ ＸｈｏⅠ； ２： Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｐｌａｓｍｉｄ ｐＨＡＩＦ ｄｉｇｅｓｔｅｄ ｂｙ
ＸｈｏⅠａｎｄ ＫｐｎⅠ； ３： Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｐｌａｓｍｉｄ ｐＨＡＩＦ ｄｉｇｅｓｔｅｄ ｂｙ
ＸｈｏⅠａｎｄ ＸｂａⅠ； ４： Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｐｌａｓｍｉｄ ｐＨＡＩＦＲ ｄｉｇｅｓｔｅｄ ｂｙ
ＣｌａⅠ； ５： Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｐｌａｓｍｉｄ ｐＨＡＩＦＲ ｄｉｇｅｓｔｅｄ ｂｙ ＣｌａⅠａｎｄ
ＸｂａⅠ； ６： Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｐｌａｓｍｉｄ ｐＨＡＩＦＲ ｄｉｇｅｓｔｅｄ ｂｙ ＸｈｏⅠａｎｄ
ＸｂａⅠ； ７： Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｐｌａｓｍｉｄ ｐＣＥＩＨＦＲ ｄｉｇｅｓｔｅｄ ｂｙ ＰｓｔⅠａｎｄ
ＳａｃⅠ； ８： Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｐｌａｓｍｉｄ ｐＣＥＩＨＦＲ ｄｉｇｅｓｔｅｄ ｂｙ ＫｐｎⅠａｎｄ
　 ＸｂａⅠ； ９： Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｐｌａｓｍｉｄ ｐＣＥＩＨＦＲ ｄｉｇｅｓｔｅｄ ｂｙ ＳａｃⅠ．
图 ４　 重组质粒 ｐＨＡＩＦ、ｐＨＡＩＦＲ和
ｐＣＥＩＨＦＲ酶切鉴定
Ｆｉｇ． ４　 Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｐｌａｓｍｉｄ
ｐＨＡＩＦ、ｐＨＡＩＦＲ ａｎｄ ｐＣＥＩＨＦＲ
的 ５０ 株长度约为 １ ｃｍ的再生幼苗转接到含 ３０ μｍｏｌ·
Ｌ － １草甘膦的生根筛选培养基，成活 ４５ 株完整植株
（图 ６）。 提取这 ４５ 株再生植株的叶片基因组总 ＤＮＡ，
分别以 Ｔ５ － １ ／ Ｔ３ － １、Ｐ５ － １ ／ Ｐ３ － １ 和 Ｃ５ － １ ／ Ｃ３ － １
为上 ／下游引物进行 ＰＣＲ鉴定，有 ２４ 株能够完全扩增
出长度分别约为 ２００ ｂｐ、３００ ｂｐ 和 ２５０ ｂｐ 的特异条
带，而作为阴性对照的非转基因植株则未出现相应的
条带（图 ７，仅列出部分扩增结果），初步说明外源基因
已整合到这 ２４ 株再生植株中。
３　 讨论
ＲＮＡｉ是由 ｄｓＲＮＡ引发的细胞内 ｍＲＮＡ特异降解
现象［１２ － １４］。 利用 ＲＮＡｉ 技术将不同病毒或同一病毒
不同株系的有效核酸片段融合，构建具有内含子和反
向重复结构的植物表达载体转化植物，获得的转基因
８４
　 １２ 期 ＴＭＶ、ＰＶＭ和 ＣＭＶ干扰载体构建及对人参果遗传转化
注：Ｍ：ＤＬ１０００ ＤＮＡ 分子标准；１：Ｔ５ － １ ／ Ｔ３ － １ 作引物的 ＰＣＲ 产
物；２：Ｐ５ － １ ／ Ｐ３ － １ 作引物的 ＰＣＲ 产物；３：Ｃ５ － １ ／ Ｃ３ － １ 作引物
的 ＰＣＲ产物；４：Ｐ５ － １ ／ Ｃ３ － １ 作引物的 ＰＣＲ产物；５：Ｔ５ － １ ／ Ｃ３ －
　 　 　 １ 作引物的 ＰＣＲ产物。
Ｎｏｔｅ： Ｍ： ＤＬ１０００ ＤＮＡ ｍａｒｋｅｒ； １： ＰＣＲ ｐｒｏｄｕｃｔｓ ｕｓｉｎｇ ｐｒｉｍｅｒｓ ｏｆ Ｔ５
－ １ ／ Ｔ３ － １； ２： ＰＣＲ ｐｒｏｄｕｃｔｓ ｕｓｉｎｇ ｐｒｉｍｅｒｓ ｏｆ Ｐ５ － １ ／ Ｐ３ － １； ３：
ＰＣＲ ｐｒｏｄｕｃｔｓ ｕｓｉｎｇ ｐｒｉｍｅｒｓ ｏｆ Ｃ５ － １ ／ Ｃ３ － １； ４： ＰＣＲ ｐｒｏｄｕｃｔｓ ｕｓｉｎｇ
ｐｒｉｍｅｒｓ ｏｆ Ｐ５ － １ ／ Ｃ３ － １； ５： ＰＣＲ ｐｒｏｄｕｃｔｓ ｕｓｉｎｇ ｐｒｉｍｅｒｓ ｏｆ Ｔ５ － １ ／
　 　 　 Ｃ３ － １．
图 ５　 ｐＣＥＩＨＦＲ转化农杆菌菌株
ＬＢＡ４４０４ 阳性克隆的 ＰＣＲ鉴定
Ｆｉｇ． ５　 ＰＣＲ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｃｌｏｎｅｓ ｏｆ ｐＣＥＩＨＦＲ
ｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄ ｉｎｔｏ Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｔｒａｉｎ ＬＢＡ４４０４
植株具有同时抗多种病毒的能力，还兼具抗性强（近
注：Ａ：农杆菌侵染；Ｂ：愈伤组织诱导；Ｃ：芽分化；Ｄ ～ Ｆ：生根及成苗。
Ｎｏｔｅ： Ａ： Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ； Ｂ： Ｃａｌｌｕｓ ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ； Ｃ： Ｓｈｏｏｔ ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ； Ｄ ～ Ｆ： Ｒｏｏｔｉｎｇ ａｎｄ ｓｅｅｄｌｉｎｇ．
图 ６　 遗传转化、选择及再生人参果植株获得
Ｆｉｇ． ６　 Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ， ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ， ａｎｄ ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ Ｐｅｐｉｎｏ（Ｓｏｌａｎｕｍ ｍｕｒｉｃａｔｕｍ）
似免疫）、抗性持久、生物安全性高等优点［２ － ３］。 但是，
植物病毒编码的 ＲＮＡ 沉默抑制子（Ｖｉｒａｌ ｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒ ｏｆ
ＲＮＡ ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ， ＶＳＲ）能够抑制宿主的基因沉默，抵抗
由基因沉默介导的宿主对病毒的抗性。 已知 ＴＭＶ 编
码的 ＶＳＲ Ｐ１２６ 蛋白［１５］ 和 ＣＭＶ 编码的 ＶＳＲ ２ｂ 蛋
白［１６］可通过与宿主基因沉默通路中的 ＲＮＡ或者关键
蛋白分子（如 ＡＧＯ蛋白、ＤＣＬ 酶）相互作用，发挥抑制
宿主对病毒的抗性以及干扰宿主正常的基因表达调控
的功能［１７ － ２０］，因此，本试验从 ＴＭＶ 和 ＣＭＶ 的 ＶＳＲ 中
选取靶标片段，利用 ＲＮＡｉ技术将 ＶＳＲ降解，抑制其功
能的发挥，提高 ＲＮＡｉ抗病毒效果。 在前人的 ＲＮＡｉ实
验中，从 Ｐ１２６［２１］和 ２ｂ［２２］蛋白基因中选取靶标片段也
获得了抗性植株，但本试验在靶标片段选取上与前人
的试验有所不同，抗性效果有待验证。 笔者在对 ＰＶＭ
的靶标片段选择时，还未发现 ＰＶＭ ＶＳＲ 的相关报道，
但已有研究表明，转化不同病毒外壳蛋白基因（ＣＰ）的
全部或部分基因片段，均能获得高度抗病的转基因植
株［３ － ４，２３ － ２４］，因此本实验从 ＰＶＭ 的 ＣＰ 中选取靶标片
段。 经过 Ｂｌａｓｔ分析，Ｐ１２６ 基因、ＣＰ 基因和 ２ｂ 蛋白基
因分别在 ＴＭＶ、ＰＶＭ 和 ＣＭＶ 不同株系的基因组中都
很保守，可以有效提高抗病毒谱。
哺乳动物细胞内，较长的 ｄｓＲＮＡ（多于 ２９ 个核苷
酸）会导致非特异性基因沉默，即“脱靶”（ｏｆｆ⁃ｔａｒｇｅｔ）效
应［２５］，只有大约 ２１ 个核苷酸的 ｓｉＲＮＡ 才能有效引发
特异性基因沉默；而非哺乳动物细胞不需要考虑 ｏｆｆ⁃
ｔａｒｇｅｔ效应［２６］，可以利用较长的双链 ＲＮＡ 直接诱导
ＲＮＡｉ而无需合成 ｓｉＲＮＡ，因此，设计非哺乳动物细胞
ＲＮＡｉ试验的步骤比较简便，只需通过目的基因体外转
录得到所需要的 ｄｓＲＮＡ，再通过浸染、注射或转染靶
细胞即可实现 ＲＮＡｉ 等［２７］。 Ｗｅｓｌｅｙ 等［７］以及 Ｓｍｉｔｈ
等［８］的研究成果也支持上述观点，他们研究表明，在
９４
核　 农　 学　 报 ２７ 卷
注：Ｍ：ＤＬ１０００ ＤＮＡ分子标准；１ ～ ７：转基因植株；Ｎ：非转化植株。
Ｎｏｔｅ： Ｍ： ＤＬ１０００ ＤＮＡ ｍａｒｋｅｒ； １ ～ ７： Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ ｐｌａｎｔｓ； Ｎ： Ｕｎｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄ ｐｌａｎｔ．
图 ７　 部分转基因人参果中 Ｔ（Ａ）、Ｐ（Ｂ）和 Ｃ基因（Ｃ）检测
Ｆｉｇ． ７　 ＰＣＲ ｐｒｏｄｕｃｔｓ ｏｆ Ｔ ｇｅｎｅ（Ａ），Ｐ ｇｅｎｅ （Ｂ） ａｎｄ Ｃ ｇｅｎｅ （Ｃ） ｉｎ ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ Ｐｅｐｉｎｏ（Ｓｏｌａｎｕｍ ｍｕｒｉｃａｔｕｍ）
许多植物中，发卡 ＲＮＡ 结构（ｈｐＲＮＡ）的正 ／反义壁长
度在 ９８ ｎｔ和 ８５３ ｎｔ之间时都能产生有效的沉默效应，
并且在对单一植物物种的 ＲＮＡｉ 试验中，包含内含子
的发卡 ＲＮＡ结构（ｉｈｐＲＮＡ）对植物的沉默数量比例更
大，能够达到 ９０％ ～１００％ 。 Ｈｉｒａｉ等［９］以及李云等［１０］
的研究进一步发现，当 ｉｈｐＲＮＡ 的茎、环长度比例（茎
环比）在 ２∶ １和 １∶ ２之间时，产生的干扰效果更好。
４　 结论
本研究利用 Ｅ⁃ＲＮＡｉ 网站［２８ － ２９］ （ ｈｔｔｐ： ／ ／ ｗｗｗ．
ｄｋｆｚ． ｄｅ ／ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ／ ｅ⁃ｒｎａｉ３ ／ ／ ）提供的分析软件，对 ＴＭＶ
Ｐ１２６、ＰＶＭ ＣＰ和 ＣＭＶ ２ｂ的高效干扰靶标片段进行预
测和筛选，从网站给出结果中选取含有较多有效
ｓｉＲＮＡ的长 ｄｓＲＮＡ（ ｌｏｎｇ ｄｓＲＮＡ）区域作为靶标片段，
采用重叠 ＰＣＲ法将靶标片段融合，成功构建了具有优
化插入结构的 ＲＮＡｉ植物表达载体 ｐＣＥＩＨＦＲ。 在后期
遗传转化中，激素浓度参照 Ａｔｋｉｎｓｏｎ 等［１１］的研究，并
在分化和生根培养基中加入合适浓度的草甘膦进行直
接筛选，成功获得 ４５ 株完整的人参果再生植株。 经过
ＰＣＲ检测，其中 ２４ 株为转基因阳性植株，为利用 ＲＮＡｉ
技术培育抗病毒人参果植株奠定了基础。
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ｏｆ ｐｅｐｉｎｏ ａｎｄ ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ ｐｌａｎｔｓ ［ Ｊ ］ ． Ｐｌａｎｔ ｃｅｌｌ
ｒｅｐｏｒｔｓ， １９９１，１０（４）： ２０８ － ２１２
［１２］　 Ｇｒｉｓｈｏｋ Ａ， Ｐａｓｑｕｉｎｅｌｌｉ Ａ Ｅ， Ｃｏｎｔｅ Ｄ， Ｌｉ Ｎ， Ｐａｒｒｉｓｈ Ｓ， Ｈａ Ｉ，
Ｂａｉｌｌｉｅ Ｄ Ｌ， Ｆｉｒｅ Ａ， Ｒｕｖｋｕｎ Ｇ， Ｍｅｌｌｏ Ｃ Ｃ． Ｇｅｎｅｓ ａｎｄ ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ
ｒｅｌａｔｅｄ ｔｏ ＲＮＡ ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ ｒｅｇｕｌａｔｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｓｍａｌｌ ｔｅｍｐｏｒａｌ
ＲＮＡｓ ｔｈａｔ ｃｏｎｔｒｏｌ Ｃ． ｅｌｅｇａｎｓ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ ｔｉｍｉｎｇ ［ Ｊ ］ ． Ｃｅｌｌ，
２００１， １０６（１）： ２３ － ３４
［１３］　 Ｈａｍｍｏｎｄ Ｓ Ｍ， Ｂｅｒｎｓｔｅｉｎ Ｅ， Ｂｅａｃｈ Ｄ， Ｈａｎｎｏｎ Ｇ Ｊ． Ａｎ ＲＮＡ⁃
ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｎｕｃｌｅａｓｅ ｍｅｄｉａｔｅｓ ｐｏｓｔ⁃ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ ｇｅｎｅ ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ ｉｎ
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Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ＲＮＡ Ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ Ｖｅｃｔｏｒ Ａｇａｉｎｓｔ Ｔｏｂａｃｃｏ Ｍｏｓａｉｃ Ｖｉｒｕｓ，
Ｐｏｔａｔｏ Ｖｉｒｕｓ Ｍ ａｎｄ Ｃｕｃｕｍｂｅｒ Ｍｏｓａｉｃ Ｖｉｒｕｓ ａｎｄ Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｉｎ
Ｐｅｐｉｎｏ （Ｓｏｌａｎｕｍ ｍｕｒｉｃａｔｕｍ Ａｉｔ． ）
ＧＡＯ Ｙｉ⁃ｆｅｎｇ１，２，３ 　 ＺＨＡＮＧ Ｆｅｉ⁃ｆｅｉ３ 　 ＺＨＡＮＧ Ｊｉｎ⁃ｗｅｎ１，２，３ 　 ＬＵ Ｙａｎ⁃ｍｅｉ１，２，３
ＷＥＩ Ｇｕｉ⁃ｍｉｎ１，２，３ 　 ＭＡ Ｔｉｎｇ⁃Ｒｕｉ１，２，３
（ １Ｇａｎｓｕ Ｋｅｙ Ｌａｂ ｏｆ Ｃｒｏｐ Ｉｍｐｒｏｖｅｍｅｎｔ＆Ｇｅｒｍｐｌａｓｍ Ｅｎｈａｎｃｅｍｅｎｔ， Ｌａｎｚｈｏｕ， Ｇａｎｓｕ　 ７３００７０； ２Ｇａｎｓｕ Ｐｒｏｖｉｎｃｉａｌ Ｋｅｙ Ｌａｂ ｏｆ
Ａｒｉｄｌａｎｄ Ｃｒｏｐ Ｓｃｉｅｎｃｅ， Ｌａｎｚｈｏｕ， Ｇａｎｓｕ　 ７３００７０； ３Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ａｇｒｏｎｏｍｙ， Ｇａｎｓｕ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ， Ｌａｎｚｈｏｕ， Ｇａｎｓｕ　 ７３００７０）
Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｐｅｐｉｎｏ（Ｓｏｌａｎｕｍ ｍｕｒｉｃａｔｕｍ） ｉｓ ｐｅｒｅｎｎｉａｌ ｈｅｒｂ ｗｉｔｈ ｖｅｇｅｔａｔｉｖｅ ｐｒｏｐａｇａｔｉｏｎ． Ｉｔ ｉｓ ｅａｓｙ ｔｏ ｂｅ ｉｎｆｅｃｔｅｄ ｂｙ ｍａｎｙ
ｖｉｒｕｓｅｓ ｄｕｅ ｔｏ ｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓ ｐｌａｎｔｉｎｇ． Ｉｎ ｏｒｄｅｒ ｔｏ ｆｉｎｄ ａ ｎｅｗ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｄｅｆｅｎｄｉｎｇ ｖｉｒａｌ ｄｉｓｅａｓｅｓ， ｔｈｅ ｐｕｒｐｏｓｅ ｏｆ ｔｈｉｓ
ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ ｗａｓ ｔｏ ｓｔｕｄｙ ｔｈｒｅｅ ｋｉｎｄｓ ｏｆ ｈａｒｍｆｕｌ ｖｉｒｕｓｅｓ ｗｈｉｃｈ ｗｅｒｅ ｃｏｍｍｏｎ ｉｎ ｐｅｐｉｎｏ． Ｂａｓｅｄ ｏｎ ｔｈｅ ｇｅｎｅｓ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏｆ
Ｔｏｂａｃｃｏ ｍｏｓａｉｃ ｖｉｒｕｓ （ＴＭＶ） Ｐ１２６， ｐｏｔａｔｏ ｖｉｒｕｓ Ｍ （ＰＶＭ） ＣＰ ａｎｄ Ｃｕｃｕｍｂｅｒ ｍｏｓａｉｃ ｖｉｒｕｓ （ＣＭＶ） ２ｂ ｉｎ ＧｅｎＢａｎｋ， ｔｈｅ
ＲＮＡｉ ｄｅｓｉｇｎ ｗｅｂｓｉｔｅ Ｅ⁃ＲＮＡｉ ｗａｓ ｕｓｅｄ ｔｏ ｓｅａｒｃｈ ｆｏｒ Ｌｏｎｇ ｄｓＲＮＡ ｆｒａｇｍｅｎｔ ｔｈａｔ ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ｔｈｅ ｍｏｒｅ ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ ｓｍａｌｌ
ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ ＲＮＡ［ｓｉＲＮＡ， ｌｏｎｇ １９ｎｔ］ ｆｒａｇｍｅｎｔ ａｓ ｔｈｅ ＲＮＡｉ ｔａｒｇｅｔ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ． Ｔｈｅ ｓｐｌｉｃｉｎｇ⁃ｂｙ⁃ｏｖｅｒｌａｐ ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ ＰＣＲ ｗａｓ
ｕｓｅｄ ｔｏ ｆｕｓｅ ｔｈｒｅｅ ｔａｒｇｅｔ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｉｎ ｔｏｇｅｔｈｅｒ， ａｎｄ ａｔ ｔｈｅ ｓａｍｅ ｔｉｍｅ ｔｏ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔ ａ ｉｎｖｅｒｔｅｄ ｒｅｐｅｔｉｔｉｖｅ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｗｉｔｈ ｐｄｋ
（ｐｙｒｕｖａｔｅ ｏｒｔｈｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｄｉｋｉｎａｓｅ） ｉｎｔｒｏ ｏｆ ｐｌａｎｔ ＲＮＡｉ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｖｅｃｔｏｒ ｐＣＥＩＨＦＲ ｗｈｉｃｈ ｗａｓ ｓｕｐｐｏｓｅｄ ｔｏ ｆｏｒｍ ｉｎｔｒｏｎ
ｓｐｌｉｃｉｎｇ ｈｐＲＮＡ （ｉｈｐＲＮＡ） ａｆｔｅｒ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ． Ｔｈｅ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｐｌａｎｔ⁃ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｖｅｃｔｏｒ ｐＣＥＩＨＦＲ ｗａｓ ｉｎｔｒｏｄｕｃｅｄ ｉｎｔｏ
Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ ＬＢＡ４４０４ ｂｙ ｄｉｒｅｃｔ ｔｒａｎｓｆｅｒｒｉｎｇ， ａｎｄ ｔｈｅｎ ｔｈｅ ｔａｒｇｅｔ ｃＤＮＡ ｗｉｔｈ ｉｎｖｅｒｔｅｄ ｒｅｐｅａｔ ｗａｓ
ｉｎｔｒｏｄｕｃｅｄ ｉｎｔｏ ｐｅｐｉｎｏ． Ｔｗｅｎｔｙ ｆｏｕｒ ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ ｐｌａｎｔｓ ｗｅｒｅ ｃｏｎｆｉｒｍｅｄ ｂｙ ｇｌｙｐｈｏｓａｔｅ ｒｅｓｉｓｔａｎｔ ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ ＰＣＲ ｔｅｓｔｉｎｇ．
Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ：Ｔｏｂａｃｃｏ Ｍｏｓａｉｃ Ｖｉｒｕｓ； Ｐｏｔａｔｏ Ｖｉｒｕｓ Ｍ； Ｃｕｃｕｍｂｅｒ Ｍｏｓａｉｃ Ｖｉｒｕｓ； ｉｈｐＲＮＡ； Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ Ｐｅｐｉｎｏ
１５