全 文 ：研究报告
生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2010年第 3期
刺参基因组 DNA提取的探讨
孙孝德 1, 2 孙国华2 杨建敏 2 吉成龙 1, 2 王卫军 2 宋志乐 3
( 1上海海洋大学水产与生命学院,上海 201306; 2山东省海洋水产研究所,烟台 264006;
3烟台市芝罘区渔业技术推广站,烟台 264000)
摘 要: 以刺参为试验材料, 分别以 CTAB法、SDS法、Segam a试剂盒法对刺参的触手、管足、体壁、纵肌、肠和呼吸树组
织进行基因组 DNA的提取,均得到了高质量的基因组 DNA。 Segam a试剂盒提取 DNA条带较其他两种方法清晰,杂质少且无
降解, 效果最佳。对比 6种不同的刺参组织,其中纵肌组织 3种方法均获得高质量基因组 DNA, 为提取基因组 DNA的首选组
织。开发了利用刺参触手和管足活体取样提取基因组 DNA的方法,得到了高质量的基因组 DNA, 这为刺参无损伤取样提供
了数据支持, 使得将来刺参家系建立过程中保证亲体的健康存活及减少试验样品取样所带来的损伤成为可能。
关键词: 刺参 基因组 DNA DNA提取 无损伤取样 CTAB法 SDS法 Segama试剂盒法
Studies on Genom ic DNA Extraction of Sea Cucumbers
(Stichopus japonicus Selenka)
Sun X iaode
1, 2 Sun Guohua2 Yang J ianm in2 J iChenglong1, 2 W angW eijun2 Song Zhile3
(
1
College of F isheries and Life Science of Shanghai Ocean University, Shanghai 201306;
2
Marine Fisheries Research Institute of Shandong P rovince, Yantai 264006;
3
F isheries T echnical Ex tension Station of the Zhifu D istrict of YantaiC ity, Yantai 264000)
Abstrac:t Genom ic DNA of d ifferen t tissues from S tichopus japonicus w as ex tracted through CTAB m ethod, SDS m ethod and Se
gam a k it m ethod, respective ly. H igh qua lity genom icDNA w as iso lated from six kinds of sea cucumbers tissues, including tube feet, body
w a l,l long itudina lm uscles, intestinal and respiratory tree. Compare to the othe r two m ethods, Segam a kit go t cleare r DNA band w ithout
deg radation. The best qua lity o f genom ic DNA from Long itud ina lm usc le tissue ofApostichopus japonicus was obta ined by threem ethods.
A t the sam e tim e, sea cucumbers tentac les and tube feet extracting genom ic DNA from live body were used to extract DNA and also got
h ighquality genom icDNA, wh ich prov ide da ta to support noninvasive sam pling of Sea Cucum ber. A lso, the study prored that it is poss i
b le to ensure the parents to surv ive and rem a in hea lthy, and reduce the body o f the test sam ple dam age caused by samp ling in the
process o f sea cucum be r fam ily bu ild ing.
Key words: Sea cucumbers Genom ic DNA DNA ex trac tion Noninvas ive samp ling CTABm e thod SDS m ethod Segam a
k itm e thod
收稿日期: 20091130
基金项目:山东省博士基金项目 ( 2008BS06004) ,山东省科技发展计划项目 ( 2008GG10005023) ,山东省良种工程项目
作者简介:孙孝德,男,硕士研究生,研究方向:动物遗传育种与繁殖; Em ai:l sunx iaode007@ 163 com
通讯作者:杨建敏,男,研究员,博士,研究方向:动物遗传育种与繁殖; Em ai:l ladderup@ 126 com
刺参 ( Apostichopus japonicus Se lenka )在分类上
隶属棘皮动物门 ( E ch inoderm ata)海参纲 ( Ho lothu
ro idea)楯手目 (A sp idochirot ida) ,由于其体壁中含有
丰富的胶原、黏多糖和多种微量元素,有很高的营养
和药用价值 [ 1] ,一向被人们视为名贵的滋补食品和
佐膳佳肴,市场对刺参的需求量日益增大,促进了刺
参养殖业的迅速发展 [ 2]。但与此同时,养殖刺参的
病害频发 [ 3] ,野生刺参的资源也因过度捕捞而受到
严重破坏,因此,对刺参种质资源的遗传多样性及分
子遗传标记的研究迫在眉睫 [ 4 ]。迄今为止, 有关刺
参的研究主要集中在形态描述、生活习性、人工育苗
和养殖以及活性物质等方面 [ 2, 5] , 关于刺参的分子
生物技术通报 B iotechnology Bulletin 2010年第 3期
生物学研究方面国内报道相对较少。提取高质量的
DNA是进行动物基因组及分子生物学研究的基础,
但由于刺参含有丰富的黏多糖和蛋白质, DNA的提
取比较困难,从而对其分子水平遗传背景的研究造
成诸多不便 [ 6]。本试验初步探讨了刺参 DNA的提
取方法,以及同一方法不同组织效果的差异 [ 7, 8] ,为
今后进一步利用分子生物学手段进行刺参种质资源
保护、种质鉴定、遗传多态性及遗传育种等方面的研
究提供技术参考。
同时考虑到刺参表面主要是胶原蛋白和多糖,
很难获取到足量含有基因组 DNA的组织和细胞。
但传统的剖取内部的肌肉组织会导致试验个体在试
验过程或试验结束后试验对象死亡, 这样对于刺参
育种选种研究工作的开展极为不利。此外, 由于刺
参体内自溶酶体系的存在, 刺参基因组的提取常常
会因为各种偶然因素尤其是在采样过程中低效率操
作而导致最终试验失败。根据实践经验, 提出了利
用刺参触手及管足活体取样提取基因组的方法,在
保持受试个体活性的情况下,剪取刺参的少量管足,
进行基因组的提取试验。由于接触个体进行取样的
时间较短,以及剪取的少量管足都对仿刺参生活状
态影响较小, 可以在试验后反馈指导刺参选种
工作 [ 9]。
1 材料与方法
11 供试材料
刺参购自烟台市场。同一个体均等分为 3份,
其中 1份用于 CTAB法提取基因组 DNA, 1份用于
SDS法提取基因组 DNA, 1份用于 Segama试剂盒法
提取基因组 DNA。另取 3个活刺参进行无损伤
取样。
12 无损伤取样
将刺参放在盛有少量海水的容器中, 海水刚没
过刺参为宜,待几分钟刺参恢复生活状态后用尖嘴
镊子分别拔取刺参的触手和管足 5 - 10条 (约
200mg) ,然后用生理盐水冲洗干净放入取样用离
心管中,做好标记备用。
13 CTAB法
取 200 mg刺参组织用液氮磨至粉状, 再加入
700 L 65 预热的 CTAB提取缓冲液 [ 10] : T risHC l
( 100 mmol /L )、NaC l( 14 mol /L )、EDTA ( 20 mmo l/
L )、CTAB ( 2% ) [ 11, 12] ,同时加入 8 L 20mg /mL的蛋
白酶 K, 置于 55 水浴槽, 4 h左右,过夜效果最好,
其间轻轻摇动,直至裂解澄清。然后加入等体积苯
酚氯仿 ( 11) , 颠倒 2 - 3 m in, 使两者混合均匀,
12 000 r/m in离心 15 m in, 取上清再加入 2 L
20mg /mL的 RN ase A酶, 水浴 30 m in, 加入等体积
氯仿离心,重复上步直至上清液澄清无浑浊,取上清
用乙醇沉淀法回收 DNA, 晾干沉淀, 加入 50 L TE
缓冲液溶解沉淀。
14 SDS裂解法
SDS裂解法 [ 13]提取方法基本与 CTAB法相同,
只是将其中的 CTAB提取缓冲液换为 SDS提取缓冲
液: T risHC l( 10 mmo l/L )、N aC l( 2 mo l/L )、EDTA
( 50 mmo l/L )、SDS( 10% ) [ 12]。
15 Segam a试剂盒法
取 30 mg组织液氮中研碎, 加入 350 L Buffer
ML1和 25 L 20mg /mL Prote inaseK混匀于 15mL
EP管中;再加 350 L氯仿异戊醇 ( 241) , 1 000 r /
m in, 抽提 2 m in, 取上清至新的 EP管中, 加 5 L
20mg /mL RN aseA酶, 室温消化 10- 30m in,加等体
积 Bu fferMBL, 剧烈混匀, 70 保温 10 m in, 加 05
倍体积无水乙醇, 再加 750 L混合液于带管柱中,
1 000 r /m in室温离心 1 m in, 将剩余混合液加于柱
中, 离心弃液, 将柱子置于新的外套管中加 500 L
HB Buffer离心、弃液, 再加已加无水乙醇的 700 L
DNA W ashing Buffer, 1 000 r /m in,离心 1 m in, 重复
上步, 将柱置于新 15 L EP管, 加 E lution Buffer
( 60- 70 预热 ) , 1 000 r /m in, 离心 1 m in, 最后 -
20 保存。
2 结果
21 OD值
经测定, 提取各组织的 OD260 /OD 280比值均在
16- 19之间,这表明不同方法及不同组织所提取
到的基因组 DNA效果理想, 基本上没有蛋白质和
RNA污染。表 1- 3分别为不同提取方法对各组织
所提基因组 DNA在 260 nm和 280 nm的紫外吸光
值以及 OD260 /OD280比值。
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2010年第 3期 孙孝德等 :刺参基因组 DNA提取的探讨
表 1 CTAB法提取不同组织基因组 DNA紫外吸收结果
触手 管足 体壁 纵肌 肠 呼吸树
OD260 0028 0027 0032 0030 0026 0025
OD280 0016 0016 0018 0017 0015 0015
OD 260 /OD 280 1712 1722 1756 1742 1704 1710
表 2 SDS法提取不同组织基因组 DNA紫外吸收结果
触手 管足 体壁 纵肌 肠 呼吸树
OD260 0027 0025 0030 0028 0025 0024
OD280 0016 0015 0017 0016 0015 0014
OD 260 /OD 280 1710 1711 1753 1740 1702 1706
表 3 Segama试剂盒法提取不同组织基因组 DNA紫外吸收结果
触手 管足 体壁 纵肌 肠 呼吸树
OD260 0030 0028 0034 0032 0028 0030
OD280 0018 0016 0019 0018 0016 0018
OD 260 /OD 280 1714 1724 1760 1745 1710 1714
22 电泳结果
用 1%的琼脂糖凝胶电泳检测基因组 DNA,结
果见图 1-图 3。由电泳结果图像可以看出各方法
及刺参 6种不同组织均可获得后续试验使用的基因
组 DNA,不同组织不同方法之间存在的差异, 具体
结果如表 4。利用 CTAB法, 各组织均可, 纵肌与呼
吸树最好,体壁较好但有杂质, 触手与管足其次,肠
效果最差; SDS法存在拖尾和杂质污染现象; Segama
试剂盒法效果最好,各组织均比较纯净,只有体壁和
肠有轻微拖尾现象。由此可得出, 提取基因组 DNA
的最佳部位为纵肌, 最好方法为 Segama试剂盒法。
而无损伤取样的触手和管足用各种方法提取的基因
组 DNA质量也很高,这充分说明了无损伤取样的可
行性。
1.触手; 2.管足; 3.体壁; 4.纵肌; 5.肠; 6.呼吸树;M. DNA分子量标准
图 1 CTAB法
1.触手; 2. 管足; 3. 体壁; 4.纵肌; 5. 肠; 6. 呼吸树; M.
DNA分子量标准
图 2 SDS法
1.触手; 2.管足; 3. 体壁; 4.纵肌; 5. 肠; 6. 呼吸树; M .
DNA分子量标准
图 3 Segam a试剂盒
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生物技术通报 B iotechnology Bulletin 2010年第 3期
表 4 不同方法对不同组织提取效果的比较
触手 管足 体壁 纵肌 肠 呼吸树
CTAB 一般 一般 好 轻微拖尾 好
弱
有拖尾
好
轻微拖尾
SDS
一般
少量杂质
一般
少量杂质
好
拖尾
好
拖尾
弱
拖尾
好
拖尾
试剂盒 一般 纯净
一般
纯净
好
轻微拖尾
好
纯净
一般
轻微拖尾
好
纯净
3 讨论
31 提取方法的探讨
动物基因组 DNA提取技术并不复杂, 但实际工
作中发现 DNA的提取并不容易, 往往消耗大量的时
间和精力。不同的组织材料,蛋白质、多糖、次生代
谢物含量不同,即使是同样的组织,在不同的生长阶
段, DNA的提取方法也不会完全相同。比如对于乙
醇固定材料来说,大多试验要求用蒸馏水置换乙醇
过夜,中间换水 3- 4次, 可以消除乙醇对所提 DNA
纯度的影响。但在本次试验中发现, 经这种方法处
理的材料反而不能提取出总 DNA, 而将材料从固定
剂取出后, 立即用 PBS缓冲液充分冲洗后进行抽
提,所获得的总 DNA效果良好。有关原因有待进一
步研究。另外, 本试验应用稍加改进的 SDS法和
CTAB法去除多糖效果比原有方法提取的效果好。
对于多糖含量丰富的组织来说,在消化之前充分洗
涤是非常必要的, 可以较充分地除去多糖。在本试
验中经过多次对比操作, 均发现没有经过前处理的
样品在消化时经常粘连成团,即使用移液枪头搅散
后又马上凝聚, 延长消化时间也难以消化。这主要
是由于刺参多糖部分分泌到细胞外, 消化之前的洗
涤可以去除部分多糖以及刺参体外杂质的影响,从
而能够顺利地提取基因组 DNA [ 7 ]。此外,在用缓冲
液消化组织时,如时间充足, 最好让其消化过夜,这
将大大有利于组织蛋白的消化。 CTAB法常用于植
物基因组 DNA的提取, 从本试验来看, 该方法同样
适用于多糖含量丰富的其他动物组织 DNA的提取。
Segama试剂盒法提取到的基因组 DNA杂质少
量足。这应该与试剂盒的高精度是有关的,再者,就
是试剂盒中的柱子最好用 BufferGPS缓冲液提前处
理一下, 然后再进行基因组 DNA的提取, 这将大大
提高基因组 DNA的提取效率。但处理好的柱子要
当天处理当天用,否则会失去处理柱子的意义。
综上分析可以得出, 用传统的 CTAB和 SDS法
提取刺参各组织基因组 DNA是可以的, 但若想得到
纯净无杂质影响的基因组 DNA, Segama试剂盒法效
果最佳。
32 不同部位提取效果的探讨
由电泳图像可以看出各部位提取效果都是可以
的, 但总体来说纵肌效果最好; 体壁和呼吸树其次,
但体壁有杂质存在; 肠效果最差。分析效果不同的
原因可能是纵肌组织比较纯净无其它杂质的污染,
而体壁中存在大量的胶原蛋白和多糖,很难将其除
干净。肠中由于多种酶及杂质的存在,肠分泌的酶
很有可能将自身溶解,而杂质的存在必将影响肠总
量基因组 DNA的提取, 所以当取到肠组织后, 应尽
量用生理盐水多冲洗几遍。
33 无损伤取样
利用刺参管足与触手做无损伤取样提取 DNA
效果理想,这充分说明了无损伤取样的可行性。海
参是一种比较特殊的棘皮动物,由于各种不同原因,
比如海参表面主要是胶原蛋白和多糖,很难获取到
足量含有基因组 DNA的细胞, 棘皮动物提取基因组
的传统取样方法就只能是剖取内部的肌肉组织, 而
试验过程中或试验结束后, 试验对象死亡。这样的
结果对于刺参育种选种研究工作的开展极为不利。
因为一旦研究对象死亡, 所获得的个体遗传信息在
选种上来说已经没有实际意义 [ 9]。此外,试验发现
刺参基因组 DNA极易降解,这可能与其生物学性状
有关。当有外物刺激或外界环境变化时,表皮细胞
自溶、脱落, 直至死亡 [ 14]。刺参基因组的提取常常
会因为各种偶然因素,尤其是在采样过程中低效率
操作而导致试验失败。所以如果按照传统方法, 为
了有效地防止降解,就需要在鲜活时快速及时取样。
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2010年第 3期 孙孝德等 :刺参基因组 DNA提取的探讨
利用刺参触手和管足活体取样提取基因组的方法,
在保持受试个体活性不变的情况下, 剪取刺参的少
量触手和管足, 进行基因组的提取试验。由于接触
个体进行取样的时间较短, 以及剪取的触手和管足
量少都对刺参生活状态影响较小, 可以在试验后反
馈指导仿刺参选种工作。利用刺参触手和管足活体
取样提取基因组技术,可以合理利用刺参资源,进行
辅助育种、养殖状况监测、基因筛选、家系鉴别等工
作 [ 15]。另外,对于棘皮动物中很多濒危种的保护和
研究的意义也十分重大。利用刺参触手和管足活体
取样提取基因组 DNA技术, 可以合理利用仿刺参资
源,进行辅助育种、养殖状况监测、基因筛选及家系
鉴别等工作。
参 考 文 献
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