全 文 ：·研究报告·
生物技术通报
B IO TECHNOLOGY　BULL ETIN 2009年第 11期
细粒棘球蚴 AgB 8 /2基因的原核表达及免疫学鉴定
陈献威　王志钢　王红霞　毕玉新　李树裕　李洁　王媛媛
(内蒙古大学生命科学学院 哺乳动物生殖生物学与生物技术教育部重点实验室 ,呼和浩特 010021)
　　摘 　要 : 　旨在克隆细粒棘球蚴 A gB 8 /2基因 ,优化原核表达体系 ,鉴定纯化蛋白并初步确定其诊断价值。采用 RT2PCR
扩增 A gB 8 /2基因 cDNA,构建原核表达载体 pET2AgB8 /2并在大肠杆菌 BL21 (DE3)中表达 ,优化表达条件。纯化的 AgB8 /2
融合蛋白经 W estern blot鉴定正确后 ,采用斑点免疫金渗滤法初步验证其血清学诊断价值。结果显示 ,克隆的 A gB 8 /2基因包
含了 273 bp的完整 ORF,序列分析表明与其它已报道的 A gB 8 /2 cDNA序列的同源性在 99% ～100%之间。优化的表达条件
为 ,当菌液 OD600值为 0. 6时 ,加入终浓度为 0. 05 mmol/L的 IPTG, 37℃,振荡培养 5 h。纯化的蛋白经 W estern blot鉴定为目
的蛋白。克隆的 A gB 8 /2基因高度保守 ,原核表达载体 pET2AgB8 /2构建正确并高效表达可溶性融合蛋白 ,可作为特异性抗原
应用于斑点免疫金渗滤法检测血清抗体。
关键词 : 　细粒棘球蚴 　A gB 8 /2基因 　基因克隆 　原核表达 　斑点免疫金渗滤法
Prokaryotic Expression and Immunologic Identif ication of
AgB8 /2 Gene from Ech inococcus granu losus
Chen Xianwei　W ang Zhigang　W ang Hongxia　B i Yuxin　L i Shuyu　L i J ie　W ang Yuanyuan
( College of life Science, InnerM ongolia University, The Key Laboratory of M amm al
Reproductive B iology and B iotechnology, M inistry of Education, Huhhot 010021)
　　Abs trac t: 　 It aimed at cloning the AgB8 /2 gene from Echinococcus granu losus and exp ressing fusion p rotein in E. coli BL21
(DE3) followed by immunologic identification with W estern blot and diagnostic value with dot immunogold filtration assay (D IGFA ).
A gB 8 /2 gene was amp lified from Echinococcus granu losus by RT2PCR, and then was cloned into pET244a ( + ) to construct the p rokary2
otic exp ression vector pET2AgB8 /2. AgB8 /2 fusion p rotein was exp ressed successfully in E. coli BL21 (DE3) at an op tim ized exp ression
condition and then was purified after identification by SDS2PAGE and W estern blot. D IGFA was used to value serological significance of
the p rotein. Results showed that the cloned A gB 8 /2 gene sequence includes 273 bp ORF and has 99% ～100% identity with other
A gB 8 /2 gene sequences released in GenBank. The highest exp ression level was achieved by inducing the bacteria with 0. 05 mM IPTG,
at 0. 6 of OD600 value for 5 h at 37℃. Purified soluble fusion p rotein was identified to be the correct target p rotein by SDS2PAGE and
western blot. Thus, it p roved that The A gB 8 /2 gene is highly conservative. The p rokaryotic exp ression vector pET2AgB8 /2 was construc2
ted successfully and exp ressed at a high level under the op tim ized exp ression condition. The fusion p rotein can be used to dot immuno2
gold filtration assay as a specific antigen.
Key wo rds: 　Echinococcus granulosus　A gB 8 /2 gene 　Gene cloning 　Prokaryotic exp ression 　D IGFA
收稿日期 : 2009207201
基金项目 :国家基础科学人才培养基金资助项目 (J0730648)
作者简介 :陈献威 (19872) ,男 ,现为中科院北京基因组研究所硕士研究生 ; E2mail: ndcxw555@163. com
通讯作者 :王志钢 (19622) ,男 ,教授 ,研究方向 :哺乳动物生殖生物学与生物技术 ; E2mail: lswzg@ imu. edu. cn　　细粒棘球蚴病又称囊型包虫病 ( cystic echino2coccosis, CE) ,是由细粒棘球绦虫的幼期细粒棘球蚴寄生于人或动物体内引起的一类重要的、具有地方流行性的人畜共患寄生虫病。我国是世界上囊型包虫病发病最高的国家之一 ,主要分布在内 蒙古、新疆、甘肃、青海、宁夏和西藏等省 (区 ) ,严重危害了西部地区农牧民的身体健康 [ 1, 2 ]。目前常用的血清学诊断抗原是棘球蚴囊液 ,由于其成分复杂 ,与其他蠕虫病患者血清有严重的交叉反应和非特异性反应 ,因此假阳性问题难以克服 ,诊
2009年第 11期 陈献威等 :细粒棘球蚴 A gB 8 /2基因的原核表达及免疫学鉴定
断特异性不理想。
为快速和准确地诊断细粒棘球蚴病 ,各国研究
者一直在寻找强特异性抗原和快速检验方法。斑点
免疫金渗滤法 ( dot immunogold filtration assay , D IG2
FA)具有操作简便、结果稳定的特点 ,是目前血清学
检验中较为灵敏和快速的方法。抗原 B (AgB )被公
认为是细粒棘球蚴特异性囊液抗原 [ 3 ] ,占包囊液中
主要抗原的 90% ,并且含量稳定 ,推测其在生命活
动中发挥重要作用 [ 4 ]。W illiam s等 [ 3, 5～7 ]首次将抗
原 B用于人类包虫病的血清学诊断 ,后来许多学者
就天然抗原 B的血清学诊断价值也做了相关研究。
1989年 , L ightowlers等 [ 6 ]通过免疫化学分析推测抗
原 B 可能是由 8 kD 亚单位聚合而成 , 1996 年 ,
González等 [ 8 ] 证实了这一推论。自从 Shepherd
等 [ 9 ]首次克隆了抗原 B亚单位的部分 cDNA序列 ,
目前已经发现了 5 个抗原 B 8 kD 亚单位 ,包括
EgAgB8 /1[ 10 ] , EgAgB8 /2[ 11 ] , EgAgB8 /3[ 12 ] , EgAgB8 /
4[ 13 ]和 EgAgB8 /5[ 14, 15 ]。
Rott等 [ 16 ]首次将重组 EgAgB8 /1和 EgAgB8 /2
用于血清学诊断研究 ,试验证实重组 EgAgB8 /2的
敏感性和特异性分别高达 93. 1%和 99. 5% ,均比天
然抗原 B和重组 EgAgB8 /1高 ,是目前最具诊断价
值的特异性抗原 [ 17 ]。卢晓梅等 [ 18 ]也证明细粒棘球
蚴重组抗原 B具有较高的敏感性和特异性 ,并且与
泡型包虫病患者 (AE)血清无交叉反应。因此 ,克隆
细粒棘球蚴 A gB 8 /2基因 cDNA并进行原核表达 ,获
得纯化抗原 ,将 AgB8 /2抗原的特异性和斑点免疫
金渗虑法的快速特点相结合研制出特异性快速诊断
试剂盒 ,对于囊型包虫病诊断和流行病学调查具有
重要意义。
1　材料与方法
1. 1　虫株、质粒和菌种
细粒棘球蚴原头蚴采自内蒙古锡林郭勒盟屠宰
场羊肝脏 ,现场采集后立即放入液氮中 ,带回实验室
置 - 80℃保存。原核表达载体 pET244a ( + )由本院
侯鑫博士惠赠 , E. coli DH5α和 E. coli BL21 (DE3)由
本实验室保存。
1. 2　主要酶和生化试剂
总 RNA抽提试剂盒 (RNA iso Reagent)、反转录
酶 M2MLV、LA Taq DNA聚合酶、限制性内切酶 ( EcoRⅠ
和 H indⅢ)、T4 DNA 连接酶、dNTP、O ligo d ( T) 18
Primers及 DL2000和 λ2EcoT14ⅠDNA Marker购自
宝生物工程 (大连 )有限公司 ;质粒提取试剂盒和琼
脂糖凝胶 DNA回收试剂盒购自 Axygen公司 ;预染
蛋白 Marker购自 Fermentas公司 ;蛋白纯化试剂盒
( TALON Purification Kit)购自 Clontech公司 , Anti2
H is Antibody、辣根过氧化物酶标记羊抗鼠 IgG、异丙
基 2β2D2硫代半乳糖苷 ( IPTG)购自天根生化科技
(北京 )有限公司 ;辣根过氧化物酶标记羊抗人 IgG
购自北京博奥森生物技术有限公司 ; DAB购自 B io
Basic Inc公司 ;葡萄球菌 A蛋白 2胶体金购自武汉博
士德生物工程有限公司 ;确诊包虫病患者血清由内
蒙古医学院张莉博士惠赠 ,健康人血清采自内蒙古
自治区医院体检健康人群 ;常规试剂均为国产分
析纯。
1. 3　RT2PCR扩增 A gB 8 /2基因 cDNA
根据总 RNA 提取试剂盒 ( RNA iso Reagent)的
操作方法提取原头蚴总 RNA,反转录酶 M 2MLV合
成 cDNA第一链。根据 GenBank中已报道的细粒棘
球蚴 AgB8 /2亚单位基因序列 ( GU15001) ,在不打
破编码序列的前提下 ,采用 Primer Prem ier 5和 O ligo
6软件设计特异性引物 ,扩增 A gB 8 /2 基因 cDNA
片段。
上游引物 ( P1 ) : 5′2GCCATATG GAATTC TCT2
GCGTGTGACATTTGTGGAG23′, 5′端加 N de I和 EcoR
I酶切位点和 GC保护性碱基 ;
下游引物 ( P2 ) : 5′2GCAAGCTTTAGGCAAAT2
CATGTGTC2CCGAC23′, 5′端加 H ind III酶切位点和
GC保护性碱基。
引物由宝生物工程 (大连 )有限公司合成。25μl
PCR反应体系 :模板 cDNA 2. 5μl, LA Taq (5 U /μl)
0. 25μl, 10 ×LA PCR BufferⅡ(Mg2 + p lus) 2. 5μl,
dNTP M ixture (各 2. 5 mmol/L) 4. 0μl, P1 (5 pmol/μl)
2. 5μl, P2 (5 pmol/μl) 2. 5μl, ddH2O 10. 75μl。扩增
条件 : 94℃ 4 m in; (94℃ 10 s, 63. 5℃ 10 s, 72℃ 20 s)
×30个循环 ; 72℃, 10 m in。1%琼脂糖凝胶电泳检测
PCR产物。
1. 4　原核表达载体 pET2AgB8 /2的构建及测序
EcoRⅠ和 H indⅢ双酶切 PCR回收产物 ,与经
相同双酶切的原核表达载体 pET244a ( + )大片段连
131
生物技术通报 B iotechnology　B u lle tin 2009年第 11期
接 ,构建重组原核表达载体 pET2AgB8 /2,转化 E. coli
DH5α感受态细胞。经 Amp抗性筛选阳性克隆 ,碱
裂解法提取重组质粒 ,单、双酶切和 PCR鉴定正确
后送宝生物工程 (大连 )有限公司测序。
1. 5　原核表达条件优化
采用单因子法进行表达条件的优化 ,每项优
化结果用于后续试验。重组质粒 pET2AgB8 /2转
化 E. coli BL21 (DE3 )感受态细胞 ,挑取阳性克隆
接种于 5 m l LB 培养基 (含 100 μg /m l氨苄青霉
素 , 0. 2%葡萄糖 )中 , 37℃,过夜培养 ,次日按 1∶
100接种到新鲜 LB培养基中 ,诱导表达。表达条
件优化包括诱导前 OD600值、IPTG浓度、诱导时间、
诱导温度等因素。诱导表达后 ,离心收集菌体 ,超
声破碎细胞提取总蛋白 ,离心 ,取上清 , 10% SDS2
PAGE电泳检测。
1. 6　可溶性分析
在优化的表达条件下 ,离心收集菌体 ,超声裂解
后 4℃, 12 000 r/m in离心 15 m in, 10% SDS2PAGE
电泳检测上清和沉淀中的目的蛋白。
1. 7　融合蛋白的纯化
采用 TALON Purification Kit纯化 AgB8 /2融合
蛋白。诱导表达后离心收集菌体 ,加入终浓度为
0. 75 mg/m l的溶菌酶 ,超声波破碎菌体。离心分离
上清和沉淀 ,将上清与树脂充分结合。按试剂盒操
作程序纯化目的蛋白 , 10% SDS2PAGE检测。
1. 8　W estern blot鉴定
纯化的蛋白样品经 10% SDS2PAGE电泳分离、
转 PVDF膜 , 5%脱脂奶粉 TBST 37℃封闭 1 h。6 ×
H is标签检测以鼠源 H is2单抗 ( 1∶2 500)为一抗 ,以
羊抗鼠 IgG2HRP为二抗。AgB8 /2蛋白检测分别以
包虫病患者血清 (1∶200)和健康人血清 ( 1∶200)为
一抗 ,羊抗人 IgG2HRP为二抗。一抗 4℃孵育过夜 ,
二抗室温孵育 1 h, DAB显色。
1. 9　斑点免疫金渗滤法 ( dot immunogold filtration
assay , D IGFA)鉴定
自制反应盒 ,取浓度为 0. 30 mg/m l的纯化融
合蛋白 5 μl点在 NC膜的中央 ,待抗原渗入后 ,
100μl 5% BSA封闭 , 100μl TBS洗脱 ;再滴加 5
μl囊型包虫病患者血清结合 ,渗入后洗脱 ;之后滴
加 10μl葡萄球菌 A蛋白胶体金 ( 1∶2稀释 )溶液
标记 ,渗入后 100μl TBS洗脱。根据颜色判定结
果 ,边缘清晰的红色圆点判为阳性 ,边缘模糊的浅
色圆点 ,或者无色判为阴性。再以同样的方法检
测 30份健康人血清。试验设不加血清和不加抗
原的对照组。
1. 10　生物信息学分析
A gB 8 /2基因 cDNA 序列用 NCB I上的 BLAST
进行序列比对 ( http: / /www. ncbi. nlm. nih. gov/
BLAST/ ) ,开放阅读框 (ORF)预测采用 Finder软件
( http: / /www. ncbi. nlm. nih. gov/ ) ,蛋白质二级结构
和抗原表位分析采用 DNAStar软件 ,蛋白质结构域
分析采用 SMART程序 ( http: / / smart. embl. de / ) ,蛋
白质功能位点分析采用 Psite程序 ( http: / /www.
softberry. com) ,蛋白质亚细胞定位采用 PSORT程序
( http: / /p sort. nibb. ac. jp)。
2　结果与分析
2. 1　A gB 8 /2基因克隆
扩增的 A gB 8 /2基因 cDNA片段经 1%琼脂糖
凝胶电泳分析 ,得到与预期相符 ( 335 bp )的特异性
片段 (图 1)。
M. DL2000 Marker; 1. 阴性对照 ; 2.β2actin; 3. PCR产物
图 1　A gB 8 /2 PCR产物电泳检测
2. 2　pET2AgB8 /2的构建及测序分析
构建的重组质粒 pET2AgB8 /2经 PCR (图 2)及
酶切鉴定 (图 3 ) 正确。测序结果表明 , 扩增的
A gB 8 /2基因 cDNA片段全长 335 bp,包含了 273 bp
的完整开放阅读框 (图 4)和起始密码子 ATG前的
33 bp及终止密码子 TAA后的 29 bp。序列比对显
示克隆到的 A gB 8 /2 cDNA序列与 GenBank中的参
考序列 U15001 (乌拉圭羊源 )完全一致 ,并且与表
达载体正确连接。
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2009年第 11期 陈献威等 :细粒棘球蚴 A gB 8 /2基因的原核表达及免疫学鉴定
2. 3　编码蛋白分析
克隆到的 A gB 8 /2 基因 cDNA 的开放阅读框
(ORF)编码一个由 90个氨基酸残基组成的蛋白质 ,
理论分子质量 9. 9547 kD ,等电点 p I 10. 25,氨基酸
组成中 Ser含量最高 ,为 13. 9 %。采用 DNAStar软
件 Gam ier2Robson方案预测蛋白二级结构 ,表明该
蛋白中 α2螺旋占 81. 1% ,β2片层占 4. 4% ,转角
( turn)占 11. 1% ,无规则卷曲 ( coil)占 3. 4%。综合
考虑 DNAStar软件中各个参数 ,最终推测表位位于
氨基酸序列的 21～25, 32～38, 44～48, 67～69,
71～77, 81～90等区域。 SMART检索该蛋白质 1～
21氨基酸位是信号肽序列 , 1～84氨基酸位为棘球绦
虫属特有的结构域 Taeniidae_ag domain ( PF05596)。
蛋白质功能位点分析表明 , 56～61氨基酸位为豆蔻
酰位点 , 26 ～28 氨基酸位是微体 C 端靶信号。
PSORT分析确定为分泌性蛋白。
M. DL2000 Marker; 1. 阴性对照 ; 2. PCR产物
图 2　pET2AgB8 /2 PCR鉴定 M1. DL2000 Marker; 1. EcoRⅠ + H indⅢ双酶切 ;2. EcoRⅠ单酶切 ;M2.λ2EcoT14Ⅰdigest图 3　pET2AgB8 /2酶切鉴定2. 4　表达条件优化及蛋白纯化由 pET2AgB8 /2表达出的融合蛋白中 ,载体原有 Nus A蛋白及其它标签蛋白分子量约为 66. 4kD,插入片段编码的 AgB8 /2蛋白约为 11. 5 kD,预期融合蛋白的分子量约为 78. 0 kD。SDS2PAGE结果显示 ,在预期位置获得了一条特异性条带 (图 5,泳道4)。通过对诱导前 OD600、诱导时间、IPTG浓度和温度的优化 ,确定 AgB8 /2融合蛋白的最佳表达条件为 : 当菌液 OD600 值为 0. 6 时 , 加入终浓度为0. 05 mmol/L的 IPTG, 37℃,振荡培养 5 h。在优化的表达条件下获得了可溶性融合蛋白的高表达 (图5,泳道 6)。通过凝胶成像软件分析 , AgB8 /2融合蛋白的表达量占 BL21菌体总蛋白的 26%以上。纯
化的融合蛋白经 SDS2PAGE检测 ,杂蛋白基本去除
(图 5,泳道 7)。
图 4　细粒棘球蚴 A gB 8 /2 cD NA序列
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生物技术通报 B iotechnology　B u lle tin 2009年第 11期
1. BL21菌体总蛋白 ; 2. BL21 /pET244a ( + )菌体总蛋白 ; 3. 蛋白标
准分子量 ; 4. BL21 /pET2AgB 菌体总蛋白 ; 5. BL21 /pET2AgB 表达的
包涵体蛋白 ; 6. BL21 /pET2AgB表达的上清蛋白 ; 7. 纯化的可溶性融
合蛋白
图 5　融合蛋白的纯化及可溶性分析的 SD S2PAGE鉴定
2. 5　融合蛋白的 W estern blot鉴定
纯化的 AgB8 /2融合蛋白带有 2个 6 ×H is标签 ,
以 Anti2H is单克隆抗体 W estern blot检测表明 Anti2
H is单抗与融合蛋白特异性结合 (图 6)。用包虫病患
者手术前血清和健康人血清分别作为一抗 ,W estern
blot检测表明 AgB8 /2融合蛋白可特异性识别包虫病
患者血清 (图 7) ,而不能识别健康人人血清。证明得
到了纯化的 Nus2AgB8 /2融合蛋白。
1. 纯化的融合蛋白 ; 2. 蛋白标准分子量
图 6　融合蛋白 H is单抗的 W estern blot分析
2. 6　斑点免疫金渗滤法鉴定融合蛋白
采用 D IGFA法检测了 1份确诊囊型包虫病患
者血清和 30份健康人血清 ,结果显示 ,包虫病患者
血清明显呈阳性 ,健康人血清的阳性率为 3. 33%
(1 /30)。对照组全部呈阴性。
1～2. 纯化的融合蛋白 ; 3. 蛋白标准分子量
图 7　确诊包虫病患者血清为一抗的 W estern blot分析
3　讨论
抗原 B可以作为一种蛋白酶抑制剂来阻止嗜
中性粒细胞的募集 ,从而使寄生虫逃避宿主的免疫
反应 ,在寄生虫与宿主的相互作用中发挥重要作
用 [ 9, 19, 20 ] ,被公认是细粒棘球蚴的特异性抗原并最
具血清学诊断价值。将其应用于细粒棘球蚴病的快
速诊断 ,提早确诊时间 ,可为细粒棘球蚴病的普查工
作提供便利。
试验克隆的内蒙古细粒棘球蚴 AgB8 /2 cDNA序
列 ,与国内外已报道的 AgB8 /2 cDNA序列 (AY942155.
1 U15001. 1, EU622922. 1, FJ810071. 1)的同源性均为
100% [21 ]。与国外报道的序列 ( FJ810069. 1, FJ81006
711)同源性均为 99%。这与前期克隆的内蒙古细粒
棘球蚴 EG95基因和 FAB P基因情况相近 [ 22～24 ]。
许多研究表明细菌生长速率严重影响外源蛋白
的表达 ,因此必须对接种菌量、诱导时间和诱导后细
菌密度进行控制 ,生长过度或过速都会加重细菌合
成系统的负担 ,导致形成包涵体。本试验选择了
pET244a ( + )构建重组表达载体 pET2AgB8 /2,通过
对诱导时间、IPTG浓度、诱导前菌液 OD600和诱导温
度进行梯度优化 ,大大提高了融合蛋白的可溶性表
达。用囊性包虫病患者血清和健康人血清对纯化的
AgB8 /2融合蛋白进行 W estern blot检测 ,表明该蛋
白可特异性地识别包虫病患者血清中的抗体 ,这一
结果确定了表达蛋白的正确性。
最后 ,本试验还采用 D IGFA法初步检测了纯化
的融合抗原在包虫病诊断中的应用价值 ,包虫病患
者血清和健康人血清结果的对比十分明显 ,这不仅
证明了纯化 AgB8 /2融合抗原的正确性 ,同时也初
步证明了其诊断价值 ,为进一步研制基于 D IGFA技
术的包虫病快速诊断试剂盒奠定了基础。但进一步
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2009年第 11期 陈献威等 :细粒棘球蚴 A gB 8 /2基因的原核表达及免疫学鉴定
确定纯化 AgB8 /2融合抗原的敏感性和特异性 ,还
需要更多的血清样本。
参 考 文 献
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