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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2011 年第 7 期
烟草微丝结合蛋白 Fimbrin-ABD1 结构域的表达及纯化
徐宁 陈志玲
(首都师范大学生命科学学院，北京 100048)
摘 要: 微丝骨架在细胞生命活动中发挥着重要作用，微丝结合蛋白通过调控微丝骨架达到调节细胞生理过程的作
用，Fimbrin是重要的微丝结合蛋白，目前对其调控机制还不清楚。以烟草 Fimbrin 基因为模板，首先通过 PCR 技术获得了其
肌动蛋白结合域(actin-binding domain，ABD1)基因，随后构建了蛋白表达载体 pET28a-Fimbrin-ABD1，经 IPTG诱导获得了 Fim-
brin-ABD1 包涵体，通过摸索包涵体复性的条件得到了有活性 Fimbrin-ABD1 结构域，并对其功能进行了初步研究，为进一步探
讨其作用机制奠定了基础。
关键词: Fimbrin-ABD1 结构域 肌动蛋白 包涵体
Denaturation，Renaturation and Purification of Recombinant
Tobacco Fimbrin-ABD1 Expressed in Escherichia coli
Xu Ning Chen Zhiling
(College of Life Science，Capital Normal University，Beijing 100048)
Abstract: The actin cytoskeleton is involved in numerous cellular processes including cell division，cell shape maintenance． The
organization of the actin network is modulated by actin-binding proteins． Among the actin-binding proteins，fimbrin is an important regu-
lator in actin polymerization and depolymerization． In this study，Ntfimbrin-ABD1 cDNA was successfully cloned through polymerase
chain reaction． In order to investigate the interaction between Ntfimbrin-ABD1 domain and actin，pET28a-Fimbrin-ABD1 recombinant
expression vector was constructed． Subsequently，the fusion proteins were expressed as inclusion bodies in Escherichia coli． The inclusion
bodies were denatured and renatured，then the fusion proteins were purified by Ni-NTA argarose affinity column． The recombinant Nt-
Fimbrin-ABD1 proteins were confirmed to have the ability to interact with actin． All these results provide the basis for further study on
Ntfimbrin-ABD1 function．
Key words: Ntfimbrin-ABD1 domain Actin Inclusion bodies
收稿日期:2011-01-09
基金项目:国家自然科学基金资助项目(30871231)
作者简介:徐宁，男，硕士研究生，研究方向:植物细胞骨架;E-mail:quarter19861030@ sina． com
通讯作者:陈志玲，女，博士，副教授，研究方向:植物细胞骨架;E-mail:zhilingch@ sina． com
与动物和酵母细胞相比，植物细胞的微丝骨架
具有独特的动力学特性［1］，而这些特性是微丝骨架
发挥重要生物学功能的基础，微丝的动态特性是严
格受肌动蛋白结合蛋白的时空调节来实现的，Fim-
brin-ABD1 结构域是其中的重要调控因子之一。本
试验通过大肠杆菌表达系统纯化获得了 Fimbrin-
ABD1 蛋白，为下一步研究其功能奠定了基础。
异源基因在大肠杆菌中高水平表达时，常形成
不可溶、无完整天然构象的包涵体，必须经过复性才
能具有天然结构［2］。因此如何高效地复性包涵体
是蛋白表达纯化中的一个难题。本试验中 Fimbrin-
ABD1 基因在大肠杆菌系统中表达时形成包涵体，
通过对包涵体变性、复性条件的摸索，为此类蛋白的
复性提供一些借鉴。
1 材料和方法
1. 1 材料
1. 1. 1 菌株和质粒 大肠杆菌 BL21(DE3)感受态
细胞、表达载体 pET-28a为本实验室保存。
1. 1. 2 工具酶与试剂 限制性内切酶、T4 DNA 连
接酶购自宝生物公司;胶回收试剂盒、质粒提取试剂
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2011 年第 7 期
盒购自 OMEGA公司;其余试剂购自江晨宏伟生物
公司;Taq Master Mix购自康为公司。两个寡聚脱氧
核糖核苷酸引物:P1(5-AATGAATTCATGTCAGA-
GAAAGCA-3) ，P2 (5-GAAGCTTACTCCTCTGATG-
GAATATC-3)由上海生工生物公司合成。
1. 2 方法
1. 2. 1 Fimbrin-ABD1 结构域基因的克隆 以本实
验室已有的 pREP-Fimbrin 质粒作为模板进行 PCR
扩增，反应体系:ddH2O 20 μL，Taq Master Mix(2 ×)
25 μL，P1(10 μmol /L)2 μL，P2(10 μmol /L)2 μL，
模板 1 μL，总体积是 50 μL。反应程序:94℃预变性
5 min;94℃变性 30 s，50℃退火 30 s，72℃延伸 1
min，循环 30 次;最后 72℃延伸 10 min。
1. 2. 2 重组表达载体 pET28a-Fimbrin-ABD1 的构
建 将 PCR 纯化产物和 pET-28a 质粒分别进行双
酶切，酶切后进行琼脂糖凝胶电泳回收，然后在 T4
DNA连接酶条件下进行连接，连接产物转化进入大
肠杆菌 BL21(DE3)感受态细胞中，在铺有 LB 培养
基(含有 kana 抗生素 100 μg /mL)的平板上培养过
夜，挑单菌落提取质粒进行酶切鉴定。
1. 2. 3 IPTG 诱导 Fimbrin-ABD1 表达 将鉴定正
确的单菌落菌液按照 1∶ 1 000 比例加入到 10 mL LB
培养基(含有 kana抗生素 100 μg /mL)中，37℃摇床
中培养过夜，次日将 10 mL LB 培养基加入到 200
mL新鲜培养基中继续在 37℃摇床中扩培至 OD600
达 0. 5，取出 1 mL 菌液备用，做未诱导对照。然后
加入 IPTG(终浓度 0. 1 mmol /L)诱导表达 4 h，再取
出 1 mL菌液备用，做总蛋白。收集剩余培养基中的
菌体，悬浮于 lysis buffer，加入溶菌酶混匀后静置 30
min，之后进行超声波震碎 1 － 2 min，然后 4℃、
11 400 r /min离心 15 min，分别收集上清和沉淀。对
未诱导对照、总蛋白、上清和沉淀进行 SDS-PAGE
分析。
1. 2. 4 包涵体复性、纯化 取 2 mL处理液(8 mol /L
尿素、0. 5 mmol /L EGTA、500 mmol /L NaCl pH8. 0)
加到上步所得沉淀中，吹打混匀，震荡至沉淀能溶
解，以下分两个步骤进行复性。(1)稀释复性:室温
下震动 20 min，使处理溶液与从 200 mL培养基中所
得沉淀充分结合，然后分多次加入 ddH2O，共加入 2
mL，边加 ddH2O边震动使 ABD1 蛋白逐渐溶于高浓
度尿素溶液中，大约持续 30 min。然后在 11 400
r /min下离心 10 min。(2)透析复性:将上清加到透
析袋中进行透析，每 6 h 换 1 次透析液(50 mmol /L
NaH2PO4，300 mmol /L NaCl pH8. 0) ，透析 24 － 36
h，此步为蛋白复性。蛋白复性后结合镍胶，进行
纯化。
1. 2. 5 肌动蛋白提取与纯化 首先制备新西兰大
白兔骨骼肌丙酮粉，然后进行肌动蛋白提纯［3］。
1. 2. 6 Fimbrin-ABD1 生物学活性鉴定［4］ (1)配
置 G-Mg buffer:5 mmol /L Tris，0. 2 mmol /L MgCl2，
0. 2 mmol /L ATP，0. 2 mmol /L DTT。10 × KMEI:500
mmol /L KCl，10 mmol /L MgCl2，10 mmol /L EGTA，
100 mmol /L咪唑-HCl，pH7. 0。10 × ME:10 mmol /L
EGTA，1 mmol /L MgCl2。(2)配置 Mix:actin(10
μmol /L)24 μL，10 ×KMEI 3 μL，静置数分钟，加入10 ×
ME 3 μL。新配置溶液中 actin 浓度为 8 μmol /L。
(3)取 4 个离心管，分别配置不同蛋白浓度的反应
体系，如表 1 所示。(4)各个反应的离心管均在室
温放置 1 h，4℃ 200 000 × g，离心 1 h。(5)分别取
上清和沉淀，进行 SDS-PAGE电泳。
表 1 不同蛋白浓度的反应体系
蛋白种类
Mix
(μL)
Fimbrin-
ABD1
(μL)
G-Mg
buffer
(μL)
Actin
浓度
(μmol /L)
Fimbrin-
ABD1 浓度
(μmol /L)
总体积
(μL)
Actin(only) 10 0 10 4 0 20
Actin + ABD1 10 1. 33 8. 67 4 2 20
Actin + ABD1 10 2. 67 7. 33 4 4 20
2 结果
2. 1 Fimbrin-ABD1 结构域基因的克隆
PCR反应后，1%琼脂糖凝胶电泳分析，结果如
图 1 所示，在 750 bp 处有一条特异性条带，与预期
片段大小一致。
2. 2 重组表达载体 pET28a-Fimbrin-ABD1 的酶切
鉴定
对 PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳回收，EcoR I
和 Hind III 双酶切后用于构建重组蛋白表达载体
pET28a-Fimbrin-ABD1，对蛋白表达载体进行 EcoR I
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2011 年第 7 期 徐宁等:烟草微丝结合蛋白 Fimbrin-ABD1 结构域的表达及纯化
和 Hind III双酶切鉴定的结果如图 2 所示，在 5 000
bp和 750 bp处分别有清晰的条带，进一步测序分析
表明，pET28a-Fimbrin-ABD1为正确的蛋白表达载体。
M． Marker;1． PCR产物
图 1 PCR电泳结果
M． Marker;1． EcoRⅠ和 HindⅢ双酶切
图 2 重组质粒 pET28a-Fimbrin-ABD1 的双酶切鉴定
2. 3 IPTG诱导 Fimbrin-ABD1 表达
将鉴定正确的蛋白表达载体用于蛋白诱导表
达，对诱导前菌体、诱导后总蛋白、超声前后上清和
沉淀分别进行 SDS-PAGE 分析。结果(图 3)表明，
重组蛋白的表达以包涵体形式存在。SDS-PAGE 分
析可以看出经 IPTG 诱导的大肠杆菌可大量表达
一个约 30 kD的新蛋白，同时在裂解后的上清中未
发现新蛋白条带，而在沉淀中发现有大量新蛋白
生成。
2. 4 包涵体复性、纯化
鉴于摸索了一系列条件后，Fimbrin-ABD1 蛋白
均以包涵体形式表达，为了获得有活性的 Fimbrin-
ABD1 蛋白，利用高浓度尿素对包涵体进行了变性
处理，再通过透析逐步除去尿素进行蛋白复性，之后
用镍亲和层析柱进行纯化，SDS-PAGE 分析结果如
图 4 所示。
M． Marker;1．未诱导对照;2．菌体总蛋白;
3．超声后上清;4．超声后沉淀
图 3 蛋白诱导前后及可溶性分析
M． Marker;1．纯化后的 Fimbrin-ABD1 蛋白
图 4 Fimbrin-ABD1 蛋白纯化后电泳图
2. 5 Fimbrin-ABD1 包涵体复性的生物学活性鉴定
从 Fimbrin-ABD1 蛋白结构上分析其具有肌动
蛋白结合位点，为了研究复性后的 Fimbrin-ABD1 蛋
白是否具有活性，利用共沉淀技术对其结合肌动蛋
白的能力进行分析，首先将 Fimbrin-ABD1 蛋白与肌
动蛋白孵育 1 h，之后进行高速离心，并对上清和沉
淀分别进行 SDS-PAGE电泳，结果(图 5)表明，在肌
动蛋白总量固定的情况下，随着 ABD1 蛋白浓度的
增加，上清中的肌动蛋白量逐渐减少，沉淀中的肌动
蛋白量逐渐增多，说明 ABD1 能够与肌动蛋白结合，
具有促进其成束的能力［5］。
3 讨论
蛋白质体外复性是一个十分复杂的过程，虽然
目前已经报道了很多种复性方法，但因蛋白质的性
质各异，还没有一种方法对所有蛋白质都适用。为
了研究烟草 Fimbrin-ABD1 的生物化学特性，本研究
中首先构建了 pET28a-Fimbrin-ABD1 重组表达载
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生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2011 年第 7 期
M． Marker;1．高速离心下 Actin单独处理上清;2．高速离
心下 Actin + 2 μmol /L ABD1 上清;3．高速离心下 Actin + 4
μmol /L ABD1 上清;4． 高速离心下 Actin 单独处理沉淀;
5．高速离心下 Actin + 2 μmol /L ABD1 沉淀;6．高速离心下
Actin + 4 μmol /L ABD1 沉淀
图 5 高速离心后上清与沉淀 SDS-PAGE电泳结果
体，对 Fimbrin-ABD1 进行体外诱导表达纯化，在诱
导过程中，发现 Fimbrin-ABD1 总是以包涵体形式表
达。包涵体的形成主要有以下原因［6 － 8］: (1)外源
基因表达蛋白速率快，浓度大，导致蛋白没有足够的
时间和空间折叠形成正确的结构。(2)重组蛋白的
氨基酸组成，一般含硫氨基酸越多，越易形成包涵
体。(3)原核表达系统缺乏一些蛋白折叠过程所需
的酶和辅助因子。(4)温度、pH 值、某些金属离子
等因素也可使蛋白质无法正确折叠。本研究中利用
ExPASy软件对 Fimbrin-ABD1 的疏水性谱进行分析
后发现，其疏水性较强。针对以上原因，我们在得到
包涵体后先用高浓度尿素破坏二硫键，然后逐渐加
入 ddH2O稀释尿素，再经过长时间透析，让蛋白有
充分时间进行正确折叠，把传统上的稀释复性法［9］
和透析复性法［10］进行综合，随后结合镍胶进行纯
化，获得了有活性的 Fimbrin-ABD1 蛋白。
参 考 文 献
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stable in the absence of the capping protein or fimbrin． J Cell Biol，
1995，131:1483-1493．
［2］Mukhopadhyay A. Inclusion bodies and purification of proteins in bi-
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［3］易克喜．拟南芥 formin同源基因(AtFH8)的克隆、蛋白结构域表
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LIN3 have overlapping and distinct activities in actin bundle forma-
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［5］Zhang H，Qu X，Bao C，et al． Arabidopsis VILLIN5，an actin filament
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(责任编辑 李楠)
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