全 文 ：研究报告
生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2010年第 4期
牦牛 TGF2基因片段的克隆测序及系统进化分析
唐懿挺 钟金城
(西南民族大学动物遗传育种学国家民委 -教育部共建重点实验室,成都 610041 )
摘 要: 克隆测序了牦牛的 TGF2基因, 并进行了 B lastn比较分析。结果表明, 牦牛 TGF2基因片段长为 559 bp,与
普通牛、人、黑猩猩、小鼠的相应片段的同源性分别达 98%、95%、94% 、93%。在 5 端调控区域没有类似 TATA盒元件, 推测
TGF2基因在脾脏、肾脏组织细胞中表达量不是很高。由于 TGF对细胞的生长、分化和免疫功能都有重要的调节作用,牦
牛 TGF2基因研究对高原畜牧业发展提供了科学资料。
关键词: 牦牛 TGF2基因 系统进化
Cloning and Sequence Analysis of Yak TGF2 Gene
Tang Y iting Zhong J incheng
(College of Life Science and T echnology, Southwest University forN ationalities, Chengdu 610041)
Abstrac:t Th is study c loned and sequenced the yak TGF2 gene, and conducted a com para tive analysis of the Blastn. The resu lts
show ed that, Y ak TGF2 gene fragm ent length o f 559 bp, w ith ordinary cattle, hum an, pan trog lody tes, m ice co rrespond ing fragm ent
der ived 98% , 95% , 94% , 93% respec tive ly. The TGF2 prom oter conta ins no TATA box. TGF have an im po rtan t ro le in d iffe r
entiation and regulation of immune func tion in ce l,l the re fo re, theYak TGF2 gene tic research could prov ide scientific inform ation on
the p lateau an im al husbandry development.
Key words: Yak TGF2 gene Phylogenetic
收稿日期: 20091208
作者简介:唐懿挺,男,硕士,研究方向:分子遗传学与基因工程; Em ai:l yaobo12@ sina. com
通讯作者:钟金城,男,博士,教授,研究方向:动物遗传学; Em ai:l zhongj incheng518@ 126. com
TGF ( transfo rm ing grow th factor )是一种具
有多种功能的多肽生长因子,可促进细胞增殖与分
化、细胞外基质合成、胶原产生,也是多种免疫细胞
自分泌和旁分泌的调节因子 [ 1]。TGF来源广泛,
在细胞分化的所有阶段的许多细胞及组织都会产生
TGF。TGF至少有 6种异构体, 在哺乳动物体
内发现的有 TGF1、TGF2和 TGF3三种形式,
这些变异体的结构相似, 有 60% - 80%的序列同
源。各种异构体在许多生物反应中表现出相似的
作用。
研究 TGF2不同于 TGF1、TGF3, 他对
血管内皮细胞和造血祖细胞的生长抑制作用仅
为 TGF1和 TGF3的 1%左右, TGF1、TGF
3可抑制一些细胞的活性, TGF2则不具有这
种功能, 可能为羧基端序列的差异所致 [ 2 ]。在人
体中 TGF2主要由骨、肺和脑组织产生, 表达于
上皮细胞及神经细胞中 [ 3] ; 在发育过程中, TGF
1、TGF3基因多在组织结构形态建成的早期
表达, TGF2基因则表达相对晚一些, 参与了上
皮细胞的分化及成熟 [ 4]。本研究通过克隆测序
牦牛的 TGF2基因, 并与其他特种的相应序列
进行 B lastn比较分析, 以期为了解牦牛 TGF2
基因的结构、功能, 以及今后进一步研究牦牛的
生长发育、免疫等的分子机制提供理论基础。
1 材料与方法
1. 1 试验动物及试剂
麦洼牦牛的脾脏、肾脏、脑等组织取自成都青白
江屠宰场, 置于液氮内带回实验室, - 80! 保存备
用。英骏 Trizo l、Marker DL2000、rTaq聚合酶、dNTP、琼
脂糖购于 T aK aRa公司; 反转录试剂盒 ( TakaRa )、
PCR产物胶回收纯化试剂盒购于 AxyGENE公司。
生物技术通报 B iotechnology Bulletin 2010年第 4期
1. 2 mRNA的提取和反转录
麦洼牦牛脾脏、肾脏、脑等组织中总 RNA的提
取按英骏 Trizol说明书的方法提取, 溶于 RNase
FREE水中, - 80! 保存。用琼脂糖凝胶电泳检测
mRNA的纯度后, 分装备用。取每种组织 3- 5 L
mRNA根据反转录试剂盒操作说明 RTPCR反转录
分别生成 2管 cDNA。
1. 3 引物设计和 PCR扩增
根据 GenBank中普通牛 TGF2( GenBank登录
号: XM _001788732)序列设计 1对引物, 由北京金杰
生物公司合成。
5 primer: TGCCTAATAGCCACTCGTCT
3 primer: AAGTCCCTGGTGCTGTTGTA
PCR引物 PCR反应在 25 L体系中进行: 10 ∀
Buffer 2. 5 L, M gC l2 ( 25 mmo l/L ) 1. 5 L, dNTPs
( 10mmo l /L ) 2. 0 L, 引物 ( 10 pmo l/L )各 1 L,模
板 cDNA1 L ( 25 ng /L) , rTaq酶 ( 5 U /L) 0. 15
L,灭菌双蒸水 16. 85 L。 PCR扩增程序为: 1 ∀:
94! 2 m in, 35 ∀: 94! 1 m in, 57. 8! 1 m in, 72! 1
m in; 72 ! 5 m in, 4! 保存。产物用 1% 的琼脂糖凝
胶电泳, Go ldv iew染色, 凝胶成像系统拍照检测。
1. 4 目的基因的克隆
将 PCR产物按 AxyG ene小量胶回收试剂盒说
明书进行回收纯化后, 与 PMD19T载体充分混匀,
在恒温金属浴中 16! 连接 12 h, 再将连接产物加
入到 E. coli JM 109感受态细胞中, 涂布于含有 X
Ga l底物、IPTG诱导物和 Amp的固体 LB平板上,
置于 37! 恒温培养箱中培养过夜 ( 12- 16 h) , 挑
选白斑作单菌落培养, 参照 #分子克隆实验指南 ∃
(第 3版 )上的方法提取质粒,酶切鉴定和 PCR扩增
验证插入片段的大小并筛选出阳性的重组克隆。
1. 5 DNA序列测定及分析
将筛选出的含阳性重组克隆,用 AB I 3730 DNA
测序仪进行测序。然后用 DNAStar软件组装、分析
测序结果, BLAST进行序列对比和分析。
2 结果与分析
2. 1 PCR扩增产物
参照普通牛 TGF2基因序列 (GenBank登录号:
XM _001788732),预测克隆的麦洼牦牛 TGF2基因
PCR产物大小 559 bp。从图 1可见,牦牛 TGF2基因
的 PCR产物大小均在 550 bp左右,与预期结果一致。
M. DNA marker2000; 1, 2, 3. 分别为
来源于肾、脾、脑组织的 TGF2基因
图 1 PCR产物的琼脂糖凝胶电泳图
2. 2 重组质粒的鉴定
将转化后的菌液 PCR比对, 载体插入目的片段
后的大小为 500左右 (图 2)。与预期结果一致, 说
明目的片段克隆成功。
M. DNA m aker 2000; 1- 3.阳性质粒中的 TGF2
图 2 菌液 PCR产物的琼脂糖凝胶电泳图
2. 3 测序结果及分析
测序结果用 DNAMAN生物软件进行比对, 从克
隆的该基因编码区比对结果得出,麦洼牦牛 TGF2
基因的核苷酸序列 ( GenBank登录号: GQ150163)与
普通牛、人、黑猩猩、小鼠的相应序列同源性依次为
98%、95%、94%、93% (图 3)。克隆该序列中含有翻
译起始密码子 ATG和 5 非编码区,但缺少该基因的
3 末端序列。 5 端编码区出现 E sp I、E co47 III、
Bpu1102 I酶切位点。与普通牛编码区比较发现在第
388位、104位、410位 415位、448位、482位、536位、
545位、551位出现碱基替换和颠换的情况,且 GC含
量增高。在非编码区域从第 63位开始出现 CG富集
区的插入,第 258位出现连续 A的丢失, 第 329位出
现富 T区域替换为富 A区。
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2010年第 4期 唐懿挺等:牦牛 TGF2基因片段的克隆测序及系统进化分析
用 C lusta lX、MEGA3. 1、Treev iew等生物信息学分
析软件,采用 N J法对牦牛、普通牛、人、黑猩猩、小鼠
等物种的相应核苷酸序列进行分子系统进化分析
(图 4) ,结果人和黑猩猩先聚为一类,两者相聚后再
与普通牛聚为一类,然后与牦牛聚为一大类,最后才
与鼠相聚。
1 tgcctaatag ccactcgtct ct tttttccc ccccatctcg tcgctccaag aaaacttttt
61 ct tactcccc aaagttaggg ttccccctgg ccatcgtgta ttaatatttc cccttttgga
121 acgacttgta ttttcttttt aaaggaattc aagcaagata gcttttctat tggacat tga
181 ctctcgactg tttgcaaaag tttcgcatta aaaaaaaaaa aaacctacct gatctgaact
241 ttgagagtta ttggtttct t tttttcctac tttttaaatt ttttttgttc t tttttaact
301 ttttccacct ttaaaaaaaa atgcactact gtgtgctgag cgcttttctg ctcctgcatt
361 tggtcgcggt ggcgctcagc ctgtctacct gcagcacgct cgatatggac cagttcatgc
421 gcaagaggat cgaggccatc cgcgggcaga tcctgagcaa gctgaagctc accagccccc
481 cagaagacta tcccgaaccg gaggaagtcc ccccgg
图 3 牦牛 TGF2基因的部分序列
图 4 用 NJ法构建的牦牛与其他物种间的系统进化树
3 讨论与总结
起初对 TGF的生物学功能研究主要在炎症、
组织修复和胚胎发育等方面,近年来发现 TGF对
细胞的生长、分化和免疫功能都有重要的调节作
用 [ 5]。因此, 在牦牛中该基因的研究对于高原畜牧
业发展具有十分重大的意义。研究中发现在牦牛的
脾脏和肾脏中有 TGF2的表达,但在牦牛的脑组
织中未检测到该因子的表达,该因子在人和牦牛脑
组织中的这种差异性表达的现象值得作进一步的
研究。
对 TGF2基因 5 上游非编码区即调控区分析
发现, 该基因不存在许多真核生物所具有的 TATA
盒启动子元件,而真核生物中表达较高的基因核心
启动子大多含有 TATA盒, 推测 TGF2基因在
脾脏组织细胞中表达量不是很高。非编码区中
富 CG碱基的插入, 可能在稳定该因子表达方面
起了一定的作用。而相对于普通牛牦牛 TGF2
编码区域出现 GC含量相对增加的现象可能是由
于进化压力的影响, 编码蛋白质的结构区域趋于
进化稳定 [ 6 ]。
应用 N J法对牦牛、普通牛、人、黑猩猩、小鼠 5
个物种的 TGF2基因编码区核苷酸序列构建了分
子系统进化树,表明牦牛与普通牛、人、黑猩猩的该
功能基因虽然保守性较高,但是由于各物种起源、进
化、历史及生存环境的不同, 使得它们在 DNA水平
上有较大的差异,这不仅为进一步研究 TGF2基
因的功能奠定了基础,也为从 DNA水平上研究牦牛
与普通黄牛、人、黑猩猩及小鼠等 5个物种间起源、
进化关系提供了一定的理论基础。
目前研究 TGF2的资料有限, 尚缺乏对其作
用机理的系统性研究,本研究首次克隆出麦洼牦牛
TGF2基因的片段, 并对 5 端调控区进行了初步分
析, 这为进一步研究牦牛中 TGF2的功能和作用
机理奠定了重要基础。
参 考 文 献
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