全 文 ：·综述与专论·
生物技术通报
B IO TECHNOLOGY　BULL ETIN 2009年第 6期
O 2连接的 N2乙酰葡糖胺糖蛋白的研究进展
潘丽晶 1, 2 　庞义 1
(1 中山大学有害生物控制与资源利用国家重点实验室 ,广州 510275; 2 珠海市农业科学研究中心 ,珠海 519070)
　　摘 　要 : 　O2连接的 N2乙酰葡糖胺 (O2GlcNAc)修饰是普遍存在的翻译后修饰。已有许多的蛋白被发现是 O2GlcNAc蛋
白。目前 ,许多分析方法可以检测 O2GlcNAc,将其从内膜系统的多种糖基化中区分出来。O2GlcNAc修饰在细胞事件中发挥
着重要的功能 , O2GlcNAc的调控异常可能会引起某些人类疾病 ,如癌症、阿尔茨海默病和 II型糖尿病。杆状病毒 GP41蛋白
也是糖蛋白 ,它介导芽殖型病毒粒子 ( budded virus, BV )的核衣壳通过胞核。O2GlcNAc的调控研究为探讨 GP41蛋白 O2Glc2
NAc的调控作用提供了参考模式。
关键词 : 　O2连接的 N2乙酰葡糖胺 　分析方法 　功能 　杆状病毒 　GP41
Advances in the Study on O 2linked N2acetylglucosam ine
Pan L ijing1, 2 　Pang Yi1
(1 S tate Key Laboratory for B iocontrol, Zhongshan ( Sun Yat2sen) University, Guangzhou 510275;
2 Zhuhai Agricultural Science Research Centre, Zhuhai 519070)
　　Abs trac t: 　O2linked2N2acetylglucosam ine (O2GlcNAc) that has been found on a diverse range of p roteins, involed in common
post2translational modification1Various analyticalmethods have been developed to detectO2GlcNAc and distinguish it from glycosylation
in the endomembrane system1 It is clear that O2GlcNAc p lays a critical function in key cellular events1Dysregulation of O2GlcNAc me2
tabolism is correlated with human diseases such as tumorigenesis, A lzheimer′s disease, diabetes1 Research in the control of O2GlcNAc
modification could contribute to the research on regulation of O2GlcNAc in GP41, which was required for the egress of nucleocap sids
from the nucleus in the pathway of the budded virus(BV) synthesis1
Key wo rds: 　O2GlcNAc　Analytical methods　Function　Baculoviruse　GP41
收稿日期 : 2008211207
基金项目 :国家自然科学基金项目 (30370965) ,国家重大基础研究项目 (2003CB114202)
作者简介 :潘丽晶 (19762) ,女 ,博士 ,助理研究员 ,主要从事微生物分子生物学的研究
通讯作者 :庞义 (19452) ,男 ,教授 ,博士生导师 ,主要从事昆虫病理与微生物学的研究　　O2连接的 N2乙酰葡糖胺 (O2GlcNAc)修饰是普遍存在的翻译后修饰 , 1984年 ,它最早被发现为细胞表面的修饰 [1 ]。O2GlcNAc连接是由单一的糖亚基 N2乙酰葡糖胺 (GlcNAc)与 Ser/Thr残基上的羟基 (OH)结合而成。这种结构通常不像其它类型的糖基化一样会进一步延长 (图 1)。已证实 O2GlcNAc存在于所有多细胞生物体中 ,如转录因子 ,染色质与核孔蛋白 ,致癌基因产物与肿瘤抑制物 , RNA形成蛋白 ,蛋白翻译调节蛋白 ,细胞骨架蛋白 ,病毒蛋白和胞质中的酶等(表 1) [2 ]。O2GlcNAc是一种参与信号转导和蛋白多聚化的调节修饰 ,在细胞事件中发挥着重要的功能 ,包括转录、翻译、核运输和信号转导等。许多研究者发 现 ,O2GlcNAc水平的改变是诸如有丝分裂活化作用 ,细胞循环或抵抗逆境的结果 [ 2 ]。杆状病毒 GP41蛋白也是 O2GlcNAc修饰的糖蛋白 ,它介导芽殖型病毒粒子(budded virus,BV)的核衣壳通过胞核。因此 , O2Glc2NAc的调控研究为探讨 GP41蛋白 O2GlcNAc的调控作用提供了很好的参考模式。图 1　O 2GlcNAc修饰的糖蛋白
生物技术通报 B iotechnology　B u lle tin 2009年第 6期
表 1　O 2GlcNAc糖蛋白的分布
细胞核蛋白 细胞骨架蛋白 其他蛋白
核孔蛋白 细胞角蛋白 13, 8, 18 922kD 丝氨酸蛋白
RNA 聚合酶 II 神经丝 H, M, L 异质性胞核核糖核蛋白 p43
转录因子 人红细胞膜带 411蛋白 adenovirus fiber蛋白
c2Myc oncop rotein 突触蛋白 I 人巨细胞病毒 UL32
v2Erb2a oncop rotein 突触小泡蛋白 轮状病毒 NS26蛋白
p53肿瘤抑制因子 微管结合蛋白 淀粉样β蛋白前体
SV40 T抗原 Tau蛋白 杆状病毒 GP41蛋白
酪氨酸磷酸酶 Talin蛋白 p67翻译调节蛋白
染色质蛋白 钮蛋白 malarial蛋白
雌激素受体 网格蛋白装配蛋白 AP3 锥体虫 p roteins
真菌 DNA结合蛋白 A plasia giardia蛋白
神经元蛋白 E1histolytica蛋白
α2水晶体蛋白 血吸虫蛋白
1　O 2GlcNAc的研究分析方法
自有报道称核质蛋白被 O2GlcNAc修饰 20多年
来 ,人们对这种普遍存在的翻译后修饰的功能还知
之甚少。其原因主要在于使用常规的生化手段来检
测 O2GlcNAc修饰存在一定的困难。近些年 ,人们
相继开发出多种检测工具和方法 ,以深入研究对 O2
GlcNAc的功能。
111　半乳糖基转移酶法
O2GlcNAc是一种动态的修饰 ,当它存在于细胞
表面蛋白时 ,有时很难被检测。O2GlcNAc糖蛋白合
成的第一步是半乳糖基转移酶将半乳糖从尿嘧啶二
磷酸半乳糖 (UDP2Gal)转移到末端 GlcNAc残基上 ,
形成β21, 4连接。所以 ,可以用放射性标记的尿嘧
啶二磷酸半乳糖 (UDP2Gal)作为底物 ,检测 O2Glc2
NAc的存在 [ 3 ]。
112　抗体检测法
研究者发现利用 GlcNAc修饰的蛋白所产生的
抗体能够非常有效地检测此类蛋白。O2GlcNAc抗
体检测比其他的实验方法更具特异性 ,因此 ,被应用
于 O2GlcNAc修饰参与的分子调控检测。目前常用
的抗体有 CTD11016[ 4 ]。
113　凝集素检测法
凝集素具有识别特异糖蛋白并与之结合的能
力 ,一种凝集素只对某一种特异性糖基具有专一性
的结合能力 [ 5 ]。因此 ,凝集素可以作为研究糖蛋白
的探针。此外 ,凝集素具有多价结合能力 ,能与荧光
素、酶、生物素、铁蛋白及胶体金等结合、而不影响其
生物活性。例如 ,麦胚凝集素 (W GA )能特异识别
GlcNAc的二聚体和三聚体 ;鸡冠刺桐凝集素 ( ECL )
能高度结合半乳糖基 (β21, 4) GlcNAc等。
114　碱性β2消除法
O2GlcNAc 连接是 GlcNAc 通过 O2糖苷键与
Ser/Thr残基结合 ,在碱性条件下 GlcNAc极易被除
去 [ 6 ]。碱性β2消除法是释放 O2糖苷最常用的方法 ,
此方法将连接糖苷的 Ser和 Thr残基分别转化为丙
氨酸和 22氨基丁酸。
115　光谱测定法
光谱测定也被广泛应用于 O2GlcNAc糖蛋白的
检测和特性研究。应用液相色谱串联质谱法 (LC2
MS2MS)技术检测完整蛋白 ,可以观察 O2GlcNAc糖
蛋白糖基化形成的时相和延伸。与其他的分析法相
比 ,光谱测定具有更准确更定量的特点 [ 7 ]。
116　其他分析方法
应用检测 N2糖基化的方法作为 O2糖基化检测
的基础 ,在确定非 N2连接糖蛋白后 ,再使用凝集素
检测、碱性β2消除法等确定 O2GlcNAc修饰。检测
N2糖基化的方法有 N2糖苷酶试验和 N2糖基化抑制
试验等。N2糖苷酶 PNGase F能够切除所有 N2连接
糖蛋白的 A sn2连接的糖苷键 [ 8 ]。N2糖基化特异性
抑制剂衣酶素能够抑制 N2糖基化的形成。
2　O 2GlcNAc的功能
211　蛋白间相互作用
由于许多 O2GlcNAc糖基化的蛋白是多聚体 ,
O2GlcNAc的一个功能就是作为蛋白间相互作用的
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2009年第 6期 潘丽晶等 : O 2连接的 N 2乙酰葡糖胺糖蛋白的研究进展
中介。例如 ,锌指 DNA结合转录因子 YY1被 O2Gl2
cNAc修饰。这种修饰使 YY1从眼癌蛋白 (pRb)脱
离而结合到 DNA上 [ 9 ]。此外 , O2GlcNAc修饰对 T
淋巴细胞受体的识别也非常重要 [ 10 ]。
212　降解作用
富含 Pro, Glu, Ser, Thr, 或 PEST序列的蛋白
是被快速降解的靶蛋白 ,而 O2GlcNAc能保护该蛋
白不被降解。雌激素受体β的 Ser16同时被磷酸化
和 O2GlcNAc糖基化修饰。当该位点被磷酸化时 ,
靶蛋白会被快速降解 ,而 O2GlcNAc糖基化使其降
解缓慢 [ 11 ]。据报道 ,许多由调节和催化亚基组成的
蛋白酶体都被 O2GlcNAc修饰 ,蛋白酶体 O2GlcNAc
糖基化的抑制剂能降解特定蛋白 [ 12 ]。
213　转录
所有 RNA 聚合酶 II转录因子都被 O2GlcNAc
所修饰。Stat5中 O2GlcNAc与转录辅激活蛋白 CBP
结合 ,活性 Stat5是转录的媒介 [ 13 ]。当 Sp1 (参与管
家基因调节的遍在转录因子 )被 O2GlcNAc修饰时 ,
它与某些操纵子转录器的相互作用受到抑制 ;而
Sp1的 O2GlcNAc糖基化使其与其它操纵子的活性
增强 [ 14 ]。
3　O 2GlcNAc与人类疾病
311　癌症
许多参与癌变的蛋白被鉴定是 O2GlcNAc修饰
蛋白 ,包括 β2连环蛋白 , p53, pRb家族成员和 c2
Myc[ 2 ]。c2Myc主要的 O2GlcNAc修饰位点 Thr58是
淋巴瘤突变的活跃区 ,也是主要的 GSK3β磷酸化
位点 [ 15 ]。此外 ,在特定的癌变组织中 , O2GlcNAcase
的活性有所增强。有关乳腺癌与其相应的正常组织
的比较研究发现 ,随着水平的降低 ,癌变组织中活性
增强 [ 16 ]。
312　神经退行性病变
糖代谢异常是目前所发现的引起阿尔茨海默病
(A lzheimer’s disease, AD )即脑功能障碍最早的原因
之一。与 AD有关的微管结合蛋白 tau的 O2GlcNAc
糖基化负调节其磷酸化 , AD患者大脑中葡萄糖利
用水平下降 ,从而使以葡萄糖作为原料的 UDP2乙酰
氨基己糖的合成减少 ,造成 UDP2GlcNAc的显著下
降。UDP2GlcNAc是 O2GlcNAc糖基化的供体 , UDP2
GlcNAc的减少最终导致 AD患者脑中 tau蛋白的 O2
GlcNAc糖基化程度降低 , tau蛋白的磷酸化增加 ,
使 tau蛋白失去刺激微管组装和稳定微管结构的功
能 ,转变成毒性分子 ,猎获正常微管相关蛋白 ,使得
微管崩解 ,神经细胞退化 ,引起 AD的相应症状 [ 17 ]。
313　糖尿病
据估计 ,全世界患有糖尿病的人群当中 90% ～
95%是 II型糖尿病患者 ,其特征表现为胰岛素作用
的细胞或组织对胰岛素不敏感 (胰岛素抵抗 )。研
究发现 O2GlcNAc与通过氨基己糖生物合成通道的
葡萄糖流量相关。相关研究显示 ,在 O2GlcNAc转
移酶 (OGT)上有一个新型类脂结合点 :在胰岛素刺
激下 ,有一种类脂与 OGT结合 ,将其吸收进胞质膜
中。随后 , OGT用糖来“装饰 ”胰岛素信号通道蛋
白 ,抑制它们的活性 ,阻滞胰岛素反应。OGT在小
鼠肝脏中的过度表达引起胰岛素抗性和血脂异常。
因此 ,胰岛素信号通道的异常 O2GlcNAc修饰导致
胰岛素抗性和 II型糖尿病的形成 [ 18 ]。
4　杆状病毒 GP41糖蛋白
杆状病毒 ( baculovirus)是一类主要感染昆虫的
双链环状 DNA病毒 ,在应用上主要作为重要的无公
害生物杀虫剂及外源基因高效表达载体。该类病毒
根据其包涵体的形态可分为两个属 ,核多角体病毒
属 (Nucleopolyhedrovirus, NPV s) 和颗粒体病毒属
( Granulovirus, GV s)。NPV s的生活史中存在两种完
全不同形态的病毒 ———包埋型病毒粒子 (occlusion2
derived virus, ODV )和芽殖型病毒粒子 ( budded vi2
rus, BV )。这两种病毒粒子在病毒感染中具有不同
的生物学功能 , ODV负责对昆虫进行初级感染 ; BV
则负责在感染的个体中将病毒由中肠向其他组织扩
散 [ 19 ]。两种病毒粒子的结构和蛋白质组成的差异
也同样说明了它们功能上的不同 ,其中糖蛋白组成
上具有明显的差异。
目前 , 3种糖蛋白在杆状病毒感染周期中起重要
作用 ,分别是 GP64、GP37和 GP41[ 20 ]。内源糖苷酶消
化证明 ,连接 GP64的糖是 N -连接寡糖 ,而不是 O2连
接寡糖 [ 21 ]。衣霉素 ( tunicamycin)处理证实了 GP37蛋
白是 N2连接糖蛋白 [22, 23 ]。Whitford和 Pan[24, 25 ]分别证
实了苜蓿丫纹夜蛾核多角体病毒 (Autographa californi2
ca multinucleocapsid multinucleocapsid NPV, AcMNPV )
GP41蛋白和斜纹夜蛾核多角体病毒 (Spodoptera litura
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生物技术通报 B iotechnology　B u lle tin 2009年第 6期
multicapsid nucleopolyhedrovirus, Sp ltMNPV ) GP41蛋白
都是 O2GlcNAc糖蛋白。
411　AcMNPV GP41糖蛋白
从目前已获得全基因组的杆状病毒来看 , gp41
基因保守的存在于所有杆状病毒中 [ 26 ]。
AcMNPV gp41基因的氨基酸亲水性分析发现 ,
多肽氨基酸的疏水区是保守的跨膜结构域 ,表明
GP41蛋白可能是膜蛋白。然而 ,推导的多肽中在 N
端和 C端均无疏水区 ,表明 GP41不是整合膜蛋白。
AcMNPV GP41含有一个潜在的 O2连接糖基化位点
T2位于第 128个氨基酸处 (C IDTNP IS) ,周围有一个
脯氨酸存在 [ 24 ]。
W hitford和 Faulkner[ 24 ]研究和分析了 AcMNPV
GP41糖蛋白糖残基的连接方式。研究结果显示
GP41蛋白糖链并不是以 N2糖苷共价连接到多肽链
上 ,其部分是以 O2连接糖苷形式 , GlcNAc作为末端
糖残基。因此 , AcMNOPV GP41 蛋白是由单一的
GlcNAc以 O2糖苷连接到多肽链上。到目前为止 ,
GP41蛋白的生物学功能还不清楚 ,可能涉及多角体
内病毒粒子包涵体的形成。
O lszewski和 M iller[ 27 ]利用标记挽救试验 ,并通过
DNA测序 ,发现 AcMNPV 温度敏感突变株 [ 27 ] ———
tsB1074仅仅在 gp41基因内部存在一个核苷酸的突
变 ,使得 AcMNPV gp41基因的第 317位的氨基酸异
亮氨酸 ( Ile)突变成苏氨酸 ( Thr) ,并且此 Ile正处于
跨膜结构域中。在非允许温度 33℃条件下 ,在
tsB1074感染的细胞中没有检测到 BV的存在。利用
电子显微镜观察野生型 (w t)和 tsB1074在 33℃条件
下感染的昆虫细胞 ,在感染的晚期 , w t和 tsB1074感
染的细胞中均能检测到正常的核衣壳以及病毒发生
基质的存在。w t感染的细胞中 ,核衣壳与核膜相互
作用 ,离开细胞核 ,进入细胞质 ,到达质膜。然而这些
现象在 tsB1074感染的细胞中无法检测到。上述试验
表明 ,在 BV的形成过程中 , GP41蛋白介导核衣壳离
开细胞核 ,或者 GP41蛋白推动了核衣壳到达细胞膜。
412　Sp ltMNPV GP41糖蛋白
从推导的氨基酸序列分析 , Sp ltMNPV GP41含
有一个潜在的 O2连接糖基化位点和 4个潜在的 N2
连接的糖基化位点 [ 25 ]。氨基酸亲水性分析表明 ,
GP41蛋白可能是膜蛋白 ,但 GP41不是整合膜蛋
白。在 GP41的跨膜区中 ,有一个保守的异亮氨酸
Ile位点 ,它是核衣壳出核所必需的。
Sp ltMNPV gp41基因读码框全长 993 bp,编码
330个氨基酸 ,预计分子量为 361894 kD。潘丽晶
等 [ 28 ]将 Sp ltMNPV gp41全长基因克隆到原核表达
载体 pQE30上 ,在大肠杆菌 M15中原核表达了一个
分子量为 3719 kD的蛋白 ;在离体细胞以及病毒粒
子中检测到 Sp ltMNPV GP41蛋白大小是 41 kD ,这
表明 Sp ltMNPV GP41 蛋白发生了翻译后修饰。为
了确定 Sp ltMNPV GP41蛋白是否发生了 N2糖基化 ,
首先用 tunicamycin 处理 Sp ltMNPV 感染的细胞 ,
GP41蛋白的表达并未受到抑制。进一步证实 Sp lt2
MNPV GP41蛋白并没有被 N2糖基化 [ 25 ]。生物素标
记的凝集素印迹试验证实了 Sp ltMNPV GP41是 O2
连接的 GlcNAc糖蛋白 [ 28 ]。在选用的 14种凝集素
中 ,有 6种凝集素都识别 GlcNAc糖苷 ,分别是 ECL、
LEL、BSL、DSL、STL 和 W GA ,但只有其中的 3种
( ECL、LEL和 BSL)与 Sp ltMNPV GP41蛋白结合。
在以上 6种能识别 GlcNAc 糖苷的凝集素中 ,
ECL对于半乳糖基 (β21, 4) GlcNAc有着高度的结
合活性 ; LEL和 BSL 则比较偏向于结合 (β21, 4)
GlcNAc的三聚体和四聚体 ;W GA 的受体糖苷是 Gl2
cNAc,一般与许多血清和膜的糖蛋白结合 [ 29 ] ; W GA
和 DSL对 GlcNAc二聚体及三聚体的结合能力较
强 ; STL则结合 GlcNAc单体 (Vector Laboratories)。
Sp ltMNPV GP41蛋白仅被 ECL、LEL 和 BSL识别显
示 Sp ltMNPV GP41蛋白的糖亚基是含有半乳糖基
的 (β21, 4) GlcNAc四聚体 ,这样的糖亚基是不能被
DSL、STL 和 W GA所识别。Sp ltMNPV GP41蛋白多
糖亚基确切的组成成分还有待进一步研究。
5　展望
O2GlcNAc修饰在细胞事件中扮演着重要的角
色 , O2GlcNAc的调控异常可能会引起某些人类疾
病 ,或者影响杆状病毒的致病性。基于这些可能性 ,
该领域研究方法的改进显得尤为重要。在多样的生
物系统中 ,研究者们需要投入更多的精力去深入探
讨 O2GlcNAc的功能。
亚细胞定位分析显示 , Sp ltMNPV GP41在病毒
感染的早期出现在宿主细胞的细胞核中 ;随后进入
细胞质 ,同时分布于核、质中 ;并且在感染的晚期 96
82
2009年第 6期 潘丽晶等 : O 2连接的 N 2乙酰葡糖胺糖蛋白的研究进展
h,核、质中都能检测到 Sp ltMNPV GP41蛋白。这些
发现可能以下这样的观点 :病毒发生基质是病毒核
衣壳装配的地方 ,核衣壳装备完毕后从病毒发生基
质到核膜的转移需要 GP41的介导 ;又或者 GP41推
动了核衣壳通过核膜或核孔到胞质中 [ 28 ]。杆状病
毒 GP41蛋白的 O2GlcNAc修饰是否调控 BV 的形
成 ,它是如何参与这种核衣壳从病毒发生基质到核
膜的转移 ,在核衣壳离开细胞核到达细胞膜的过程
中 ,它又是否参与了蛋白间的相互作用或者信号转
导 ,这些都有待研究者进一步探讨。目前已知的 O2
GlcNAc调控形式为杆状病毒研究者们提供了很好
的参考模式。
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