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南丰蜜橘β-胡萝卜素羟化酶基因内含子的鉴定和分析



全 文 :研究报告
生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2010年第 9期
南丰蜜橘 胡萝卜素羟化酶基因
内含子的鉴定和分析
冯唐锴  王幸斌  韩柱  叶水英
(景德镇高等专科学校生物与化学工程系,景德镇 333000 )
  摘  要:  植物 胡萝卜素羟化酶 (简称 羟化酶 )是玉米黄素合成过程中的关键酶。柑橘、拟南芥、大白菜等多种植物
羟化酶基因都已被克隆。柑橘中合成玉米黄素的中间产物 隐黄素的含量远远高于其它植物, 推测柑橘与其它植物的 
羟化酶基因相比有一些特殊的差异。本研究以南丰蜜橘为材料,克隆了柑橘 羟化酶全长基因, 并对该基因内含子进行定位
和分析, 结果表明南丰蜜橘 羟化酶基因具有 6个内含子,其中内含子 6的长度远大于拟南芥和大白菜中相应的内含子。进
一步研究发现内含子 6中有两段特殊序列, 一段长 122 bp, 另一段长 95 bp。特别是 122 bp序列两端具有反向重复序列, 全序
列中含有许多不同的转录起始原件。二级结构预测其对应 RNA二级结构能构形成较稳定的发夹结构。
关键词:  胡萝卜素羟化酶  内含子  发夹结构
Identification and Analysis of the Introns of carotene Hydroxylase
Gene from Nanfeng Orange(Citrus reticulata Blanco var.
kinokuni( Tanaka)H. H. Hu)
Feng T angkai W ang X ingbin H an Zhu Ye Shu iy ing
(T he D epartm ent of Biological and ChemicalEngineering, J ingdezhen Comprehensive Co llege, Jingdezhen 333000)
  Abstrac:t  P lant caro tene hydroxy lase( hydroxy lase) is a key enzym e in the process o f zeaxanthin synthesis. hydroxy lase
genes o fC itrus, A rab idop sis, Ch inese cabbage and other plant have been cloned. cryptox anth in is an inte rmed iate product of synthetic
zeaxanthin, and C itrus conta in m ore cryptoxanth in than other p lants. W e speculate thathydroxy lase gene from C itrus in com parison
w ith o ther plants w ith special differences. In th is study, C itrus hydroxy lase fu ll leng th genew as c loned from Nanfeng O range, and the
gene ana lysis and in tron location showed tha thydroxy lase gene of N anfeng O range w ith in 6 introns. The length o f in tron 6 is larg er
than the co rresponding in tron in A rab idop sis and Chinese cabbage. Furthe r stud ies revea led that in tron 6 has tw o specia l sequences, in
cluding a 122 bp long sequence and a 95 bp long sequence. Particu lar ly, the 122 bp sequence ends w ith inverted repeat sequences, com
p lete sequence o f it conta ins a number of different transcr iption initiation o rig ina .l Secondary structure pred iction show that the seconda
ry structure o f theRNA corresponds to the 122 bp sequence has a stable ha irp in structure.
Key words:  caro tene hydroxy lase Intron H a irpin structu re
收稿日期: 20100226
基金项目:景德镇高等专科学校青年基金项目 ( QN JJ0802)
作者简介:冯唐锴,男,讲师,研究方向:生物化学与分子生物学; Em ai:l ftk ftk0@ 163 com
玉米黄素是植物叶黄素中的重要成分, 在强光
胁迫下该成分对植物起光保护作用, 它参与细胞中
多余光能的非放射性释放和光氧化的抑制 [ 1]。植
物 胡萝卜素羟化酶 (简称 羟化酶 )是玉米黄素
合成过程中的关键酶 [ 2]。 羟化酶基因广泛存在
于多种植物中, 柑橘、拟南芥、大白菜等 [ 3, 4]多种植
物 羟化酶基因都已被克隆。其中拟南芥和大白
菜的 羟化酶基因的全序列被测定, 其它都只测定
了 mRNA序列。柑橘中合成玉米黄素的中间产物
隐黄素的含量远远高于其它植物,推测柑橘与其
它生物的 羟化酶基因有一些特殊的差异。本研
究以南丰蜜橘为材料,克隆了柑橘 羟化酶全长基
生物技术通报 B iotechnology  Bulletin 2010年第 9期
因。该基因外显子及酶蛋白的空间结构已做了详细
的分析 [ 5, 6] ,本研究则重点对该序列内含子进行分
析,通过对该内含子的分析,旨在更好地了解南丰蜜
橘 羟化酶基因内含子的情况, 以及小分子 RNA
和逆转座子在进化中的关系。
1 材料和方法
11 材料
以南丰蜜橘 杨小 26!幼嫩叶片为材料提取基
因组 DNA,叶片样品采自江西省农业科学院园艺研
究所。
12 引物设计
从 GenBank数据库获得多种柑橘 羟化酶基
因 ( AB114653、AB114661、AB114669、AF296158、
AF315289、AY 533828、AY623047、DQ002893) , 比对
得到保守区域。根据保守序列特征, 利用 Primer
Prem ier 50软件设计 4对引物用于扩增南丰蜜橘
羟化酶基因全序列。引物由上海生工生物工程技
术服务有限公司合成:
Carf1 5∀AAGTCCAGAATTCACGCT3∀, Carr1
5∀AAACTA2GACATGACGGCAG3∀;
Carf2 5∀CCGAGAAATTGGCGAGAAAG3∀, C ar
r2 5∀TGGCTGGAACTGCGTTGATT3∀;
Carf3 5∀TTTTGAGCTAAACGATGTG3∀, Carr3
5∀AACCTTTTGTGAACGAGAC3∀;
Carf4 5∀ACT2TGGCATTACGGTGTT3∀, Carr4
5∀TTTGTTATCTTTCATTGACT3∀。
13 基因组 DNA的提取和检测
南丰蜜橘基因组 DNA的提取采用 CTAB法。
所得基因组 DNA用 07%琼脂糖凝胶电泳检测。
14 PCR反应
50 L反应体系, 含上述基因组 DNA模板 1
L;引物对 02 mol/L; TaKaRa公司的 10 # Ex Taq
Buffer(含 Mg2+ ) 5 L; dNTPs 200 mo l/L; TaKaR a
ExTaq DNA聚合酶 025 U。 PCR反应程序: 94∃
预变性 5 m in; 94∃ 变性 30 s,引物对最适退火温度
( 4对引物最适退火温度分别为: 48、54、48和 52∃ )
退火 30 s, 72∃ 延伸 1 m in, 35个循环; 最后 72∃ 延
伸 10m in。
15 基因克隆
利用 DNA回收试剂盒 ( Q iagen公司 )回收纯化
PCR产物。纯化产物连接到 pMD18T Vector( TaK a
Ra公司 )。重组质粒转化 TG1感受态细胞。利用 2
#YT /氨苄青霉素 (氨苄浓度 100 g /L)固体培养
基和菌落 PCR筛选重组子。菌落 PCR为 25 L反
应体系,用灭菌牙签挑取少量菌体代替基因组 DNA
模板,其它条件与基因组 PCR反应一致。检测出的
阳性克隆单菌落在 2 #YT /氨苄青霉素液体培养基
中 37∃ 震荡培养 16- 18 h后,利用质粒提取试剂盒
(上海生工 )提取质粒。所得质粒溶液于 - 20∃ 保
存备用测序。
16 DNA序列测定和拼接
用 AB I Prism 3100型全自动 DNA测序仪对重
组质粒测序,测序引物为 pMD18T质粒的通用测序
引物。测序结果用 DNAStar软件包中的 SeqM an程
序进行拼接。
17 生物信息学分析
利用在线软件 GENESCAN[ 7] ( http: / /genes
m itedu/GENSCANhtm l)和在线软件 NetGene2[ 8]
( http: / /www cbsdtudk /serv ices /NetGene2)分析基
因结构; 利用 blastn在线软件 ( http: / /blastncb i
n lmnihgov / )比对分析序列保守性。利用在线软件
S ignalscan
[ 9]
( http: / /wwwdnaaffrcgo jp /PLACE /
signalscanhtm l)分析序列中的转录调控元件。利用
BDGPpromoter[ 10 ]在线软件 ( http: / /www fruitflyorg /
seq_too ls/promoterhtm l)分析序列中的启动子序列。
利 用 m fold[ 11] ( http: / /m foldb ioinforp iedu /cgi
b in / rnaform1 cg i)在线软件折叠序列的二级结构。
2 结果与分析
21 南丰蜜橘 羟化酶基因的克隆结果及基因组
成分析
利用上述 4对引物扩增南丰蜜橘 羟化酶基
因, 最终得到 4个 PCR纯化产物片段: cit1、c it2、
cit3、c it4(图 1)。克隆测序结果显示, 它们长度分别
为 470、761、294和 991 bp。利用 DNAS tar软件包中
的 SeqM an程序拼接 4段序列,得到一总长度 2 326
bp的序列。该序列被命名为 chy, 并递交到 Gen
Bank数据库, 序列号为 AM408552[ 5 ]。利用 G eneS
can及 NetGene2在线软件分析该 2 326 bp序列。结
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2010年第 9期 冯唐锴等:南丰蜜橘 胡萝卜素羟化酶基因内含子的鉴定和分析
果发现,南丰蜜橘 羟化酶基因含 7个外显子和 6
个内含子。最小的外显子长 57 bp,最大的外显子长
402 bp;最小的内含子 (内含子 1)长 104 bp, 最大的
内含子 (内含子 6)长 437 bp(表 1)。而且所有内含
子两端, 都发现了标准的 GTAG保守碱基, 这表明
对内含子和外显子的定位基本正确。该基因中,内
含子没有打断任何密码子, 保持了外显子中所有密
码子的连续性 (表 2)。
M. 50 bp DNA ladderM ark er; 1. C it1; 2. C it2; 3. C it3; 4. C it4
图 1 四对引物的 PCR产物割胶纯化后的 2%
凝胶电泳检测结果
表 1 南丰蜜橘 胡萝卜素羟化酶基因外显子和内含子
外显子 开放阅读框 内含子
号码 起始 终止 大小
( bp)
起始 终止 大小
( bp)
号码 起始 终止 大小
( bp)
1 120 521 402
120
( ATG)
1 522 625 104
2 626 685 60 2 686 900 215
3 901 972 72 3 973 1084 112
4 1085 1219 135 4 1220 1336 117
5 1337 1462 126 5 1463 1595 133
6 1596 1652 57 6 1653 2089 437
7 2090 2173 84
2173
( TAA )
总数
( bp)
936 936 1118
表 2 内含子 /外显子的连接处和内含子两侧的密码子
外显子 内含子 外显子 内含子两侧的密码子
AATGGAG
GTACTTCA%%
CCGTACAG
GGTGGAG
GAG /GGT
( E134 /G135)
TGCTGCT
GTAAGTTC%%
ATTTGCAG
GTGGGCA
GCT /GTG
(A154 /V155 )
GCACGAG
GTACTAGC%%
CATTGCAG
TCTCACC
GAG /TCT
( E178 /S179 )
TGGTGCT
GTAAGTTC%%
GGAATCAG
GGACTTG
GCT /GGA
(A223 /G224 )
TCACCAG
GTAAATGA%%
GGCTTTAG
CTTCACC
CAG /CTT
( Q265 /L266)
ACCTAAG
GTGGGTCC%%
TGGTGCAG
GAGCTTG
AAG /GAG
( K284 /E285)
  下划线序列为内含子 /外显子边界的保守序列;括号中字母表
示密码子对应的氨基酸的单字母缩写,字母后的数字为该氨基
酸在序列中的位置
22 南丰蜜橘 羟化酶基因内含子的分析
目前已测序全长 羟化酶基因的植物有拟南
芥 (AF125577)和大白菜 ( DQ156907)。它们的外显
子与南丰蜜橘 羟化酶基因高度保守 [ 5] , 内含子定
位也很相似。但内含子序列保守性差、长度也变化
较大。如表 3所示,拟南芥和大白菜的 1、2、3、6号
内含子大小相近。南丰蜜橘的 1、3号内含子略长于
拟南芥 1、3号内含子; 2号内含子长度约为拟南芥 2
号内含子的 3倍; 6号内含子长度约为拟南芥 6号
内含子长度的 5倍, 该变化非常显著。南丰蜜橘 4
号内含子是拟南芥 4号内含子的 1 /3, 是大白菜 4
号内含子的 1 /5, 其长度与后两者相比大大缩短; 而
5号内含子略长于拟南芥 5号内含子,但比大白菜 5
号内含子短。拟南芥和大白菜同属十字花科, 南丰
蜜橘属于芸香科, 羟化酶基因内含子长度的变化
规律,在一定程度上体现了 3种生物之间亲源关系
的远近。
95
生物技术通报 B iotechnology  Bulletin 2010年第 9期
表 3 南丰蜜橘,拟南芥及大白菜中内含子长度的比较
内含子
1( bp)
内含子
2( bp )
内含子
3( bp)
内含子
4( bp )
内含子
5( bp)
内含子
6 ( bp)
南丰
蜜橘 104 215 112 117 133 437
拟南芥 79 76 72 374 105 86
大白菜 94 83 83 565 240 91
南丰蜜橘 羟化酶基因内含子 6(图 2A )比拟
南芥、大白菜对应内含子要长很多,对其进一步分析
发现两段较特殊的序列。第一段长 122 bp的序列
为内含子 6的 54 - 175 bp核苷酸 (图 2A加框序
列,图 2B)。1对 24 bp的反向重复序列位于该序
列两端 (图 2B双下划线序列 ), 其间包含了一段长
76 bp的序列。这对 24 bp反向重复序列中前者的
5∀端和后者的 3∀端都是兼具正向重复及回文特征的
TTAA序列 (图 2B斜体序列 ), 因此这对 24 bp反向
重复序列,也可看作外侧一对 4 bp同向重复序列内
侧包含了 1对 20 bp反向重复序列的组合。对两反
向重复序列中间的 76 bp序列进行 blastn比对, 发
现其中一段 32 bp序列 (图 2B单下划线序列 )的不
同局部非常保守的存在于动物、植物和微生物中。
利用 Signalscan在线软件对这段 122 bp序列进行转
录因子结合位点分析,发现该序列中的正向和反向
序列中都存在一些转录起始元件, 主要有 CAAT( +
19 /101)、CCAAT( + 108 /11)、TATTAAT ( + 53)等
类型 (图 2B大写序列 ), 他们都是典型的 CAAT
BOX1、CCAATBOX1、TATABOX3类型的启动子元
件。此外, 利用 BDGPpromoter在线软件分析这段
序列,也发现其反向互补序列中, 存在一段 50 bp的
疑似启动子的序列 (图 2B阴影部分序列 )。
图 2 胡萝卜素羟化酶内含子 6序列 (A )及其包含的 122 bp特殊序列 (B )、95 bp特殊序列 (C )
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2010年第 9期 冯唐锴等:南丰蜜橘 胡萝卜素羟化酶基因内含子的鉴定和分析
利用 m fo ld在线软件, 对这段 122 bp序列对应
的 RNA二级结构进行折叠, 发现此序列能够形成比
较稳定的茎环结构 (图 3A ),其折叠的最低自由能
G = - 6770。该序列碱基组成为: A% = 3197% ;
G% = 1721%; T% = 3607%; C% = 1475%。为
了更好地了解南丰蜜橘 羟化酶基因内含子 6的
二级结构,对该内含子的 RNA全序列进行折叠。结
果发现该内含子中除了上述 122 bp序列可以折叠
成稳定的茎环结构外,还有一段 95 bp序列 (图 2A
下划线序列, 图 2C ) ,也可以被折叠成一个比较稳
定的茎环结构, 而且后者的结构更加的规则 (图 3
B)。其折叠最低自由能 G = - 4100, 碱基对组成
为: A% = 3684% ; G% = 1474% ; T% = 3368%;
C% = 1474%。不过第二个序列的茎环结构中, 不
配对序列要更多一些。
图 3 chy基因内含子 6中 122 bp序列 ( A)和 95 bp序列
(B )对应 RNA折叠的茎环结构
3 讨论
上述分析结果表明, 南丰蜜橘 羟化酶基因内
含子 6中的 122 bp序列和 95 bp序列结构确实较为
特殊, 将其与一些不同类型的 DNA序列进行比较,
可以初步推测该序列的类型及来源。根据 122 bp
序列的特征,本研究将该序列同以下 3种 DNA序列
进行了比较分析,它们分别是插入序列 IS ( insert ion
sequence)、长末端重复序列 LTR ( long term ina l re
peat)及 M icroRNA基因。
IS是最简单的转座原件,两末端为反向重复序
列,与其相连的宿主 DNA的末端为短的正向重复序
列。上述内含子 6中的 122 bp序列具有这一特征。
但是除 IS1之外,所有的 IS元件皆含有一个单一的
转座酶编码区, 这是该序列所不具备的。即使是
IS1也仍然比本研究中的 122 bp序列要长很多 [ 12 ]。
LTR序列是逆转座子两端成对的同向长末端重复序
列。LTR内部两端有一对短的倒转重复序列 IRS
( inverted repeats) ,序列中通常又携带有转录起始和
终止信号 [ 13]。在较大的植物基因组中 LTR逆转座
子的扩张较为普遍 [ 14] , 但是也会通过 LTR序列之
间进行重组交换来丢失一部分基因组 DNA,这一过
程会使得其中的一些 LTR逆转座子只留下一端的
LTR,这种单个的 LTR被称为 so lo LTR。在拟南芥、
水稻、玉米、小麦和大麦的基因组中就发现了许多结
构类似不完整的 so lo LTR逆转座子序列 [ 15]。 Solo
LTR结构特征如下:序列两端为倒转重复;序列两端
外侧存在 4- 9 bp的正向重复序列; 序列内含有一
个长度为 20- 30 bp的多聚嘧啶 [ 16 ]。柑橘 chy基因
内含子 6中的 122 bp序列含有 20 bp倒转重复, 4
bp正向重复及一些重要的转录起始元件。这些都
接近 solo LTR的特征。但是在此段序列中并没有
找到多聚嘧啶,且多数 LTR序列仍然比该序列要大
一些。
M icroRNA(M iRNA )是一类内生的非编码单链
小分子 RNA。M iRNA具有保守、长度为 20- 25 nt、
前体发夹结构以及 M iRNA和靶基因完美或近完美
的匹配等特征。在植物中 M iRNA一般是由 70- 90
nt的初始转录产物剪切加工形成的发夹茎环结
97
生物技术通报 B iotechnology  Bulletin 2010年第 9期
构 [ 17, 18]。预测 M iRNA时,通常可以利用 Ambros[ 19]、
Bonnet
[ 20]和 Mathews等 [ 21]提出的标准对目标序列所
形成的前体发夹结构进行分析和筛选: ( 1)M iRNA前
体能折叠成配对碱基数约为 22 bp的发夹结构;
( 2)M iRNA前体折叠自由能最小。M iRNA前体的折
叠自由能平均为 - 4598 kcal /mo,l明显低于 mR
NA s( - 2308 kca l/mo l) , tRNA s( - 2213 kca l/mo l)
和 rRNAs ( - 1683 kca l/mo l) [ 22] ; ( 3) M iRNA 中
(A + U )含量在 30% - 70%左右; ( 4) M iRNA互补
区段两单链之间的错配碱基数小于 6; ( 5) M iRNA
互补区段两单链没有额外环或缺口; ( 6)新预测
M iRNA与已知 M iRNA 序列的错配碱基数小于
4
[ 23, 24]。南丰蜜橘 羟化酶基因内含子 6的 122 bp
序列符合上述 6个标准中的前 5项: 存在配对碱基
数 24的发夹二级结构 (图 3A ); 折叠自由能为
- 6770, 远小于 M iRNA前体折叠自由能平均值;
(A + T)% = 6803%; 互补区 24 bp无错配和额外
环或缺口。不过该序列长于一般的 M iRNA前体序
列,且 B lastn分析没有发现已知的 M iRNA与此序列
匹配, 但是据此也并不能完全排除该序列作为 M iR
NA的可能性。因为,首先在芸苔属 ( B rassica )植物
中有的 M iRNA前体甚至长达 269 bp[ 24] , Sanger中
心 M iRNA数据库 [ 25] ( http: / / M iRNA. sanger. ac.
uk /sequcences/ index. shtmL)中其它生物也存在一
些前体较长的 M iRNA。其次柑橘基因组全序列未
见报道,不能准确判断该序列是否有靶基因。最后
关于柑橘 M iRNA的报道很少, 无法将 122 bp序列
与之进行比较, 故不能完全排除其作为新的备选
M iRNA的可能。南丰蜜橘 羟化酶基因内含子 6
中的 95 bp序列也具有发夹结构 (图 3A ),该序列
折叠自由能较 122 bp序列要高一些,错配碱基也多
一些, 但是也基本符合上述判断 M iRNA基因标准的
前 5项。这两个序列的类型都有待进一步的研究。
根据上述分析,基本可以确定的是南丰蜜橘 
羟化酶基因内含子 6中的 122 bp和 95 bp序列是在
进化过程中插入的序列。特别是 122 bp序列, 既具
有逆转座子中 so lo LTR序列的部分特征, 又具有非
编码 RNA (M iRNA )的部分特征。该序列究竟属于
哪种类型,还有待后续研究进一步发现。目前已有
报道表明某些非编码的 RNA,如 snoRNA, 同时具有
逆转座子的属性特征 [ 26, 27] , 虽然目前 M iRNA是否
具有逆转座特性尚无相关报道, 但是随着各种生物
基因组全序列的逐步测定,对 M iRNA研究的逐渐深
入, 并不能排除这种可能。南丰蜜橘 羟化酶基因
内含子 6中的 122 bp序列为研究非编码 RNA同逆
转座子在进化过程中的相关性,提供了一个线索。
参 考 文 献
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