全 文 ：生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN·研究报告· 2008年第 6期
收稿日期：2008-06-02
作者简介：王松华（1982-），男，江苏无锡人，硕士研究生，主要从事生物化学与分子生物学研究；E-mail：allan19821123@yahoo.com.cn
通讯作者：田亚平，女，教授，硕士生导师；E-mail：yapingtian@hotmail.com
脲酶（E.C.3.5.1.5），又称尿素氨基水解酶，广泛存在于动物、植物和微生物体内，能够分解尿素。 有部
分微生物产生的酸性脲酶（acid urease）不同于植物中提取的中性、偏碱性脲酶，酸性脲酶能耐受酸性环境，
在 pH4.0~5.5 的体系中仍具有活性。
尿素是酒中由微生物代谢过程中所产生的副产物，是形成氨基甲酸乙酯的前体物质 [1，2]。 进入 20 世纪
80 年代，酒精饮料中氨基甲酸乙酯具有致癌作用被越来越多的研究者们认同 ，研究者即致力于酒用脲酶
来源和产生菌的研究 [3~6]。 国内吴伟祥，刘颖等 [7~9]从污泥中筛选到产酸性脲酶的菌株，并研究了产酶条件。
通过向酒中添加少量的脲酶，可以有效去除尿素，抑制氨基甲酸乙酯形成 [10，11]。我国出口黄酒中所用的
脲酶均从国外进口，国内尚未形成生产规模，因此酒用脲酶的研究对我国酿酒业的发展，拓展国际市场等
方面均有深远的意义。
从动物粪便中利用传统微生物筛选方法，经过酸性平板初筛、中性平板复筛，得到一株稳定产酸性脲
酶的菌株，对该菌进行了生理生化及分子鉴定，并对其所产脲酶对黄酒中的尿素去除效果进行了考察。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 样品来源 动物粪便（鸟粪、鼠粪、牛羊粪便），农田土壤，污泥。
产酸性脲酶菌株的筛选、鉴定及其脲酶的应用初探
王松华 田亚平
（江南大学工业生物技术教育部重点实验室，无锡 214122）
摘 要： 利用传统微生物筛选方法，从动物粪便中经过酸性平板初筛、中性平板复筛，得到一株产酸性脲酶的菌株
JN_R12。通过比较形态特征、生理生化以及16S rDNA测序结果，结合系统发育分析，确定该菌为肠出血性大肠埃希氏菌
EnterohemorrhagicEscherichia coli O157：H7。JN_R12所产脲酶对酒精有较好的耐受性。离心后得到的全细胞在模拟酒
样中的尿素去除率接近100％；黄酒中24h孵化后的去除率在60％以上。
关键词： 酸性脲酶 16S rDNA 聚合酶链反应 系统发育分析 尿素去除率
Isolation and Identification of Acid Urease-producing
Strain and Primary Application
Wang Songhua Tian Yaping
（The Key Laboratory of Industrial Biotechnology，Ministry of Education，Jiangnan University，Wuxi 214122）
Abstract： A strain with acid urease catalytic activity named as JN_R12，was isolated from animal dropping by
using traditional acid and neutral pH plate screen. Based on polyphasic study，phenotypic characteristics，physiological-
biochemical properties，16S rDNA sequence and phylogenetic analysis，JN_R12 was identified as EnterohemorrhagicE.coli
O157：H7. The urease of JN_R12 showed an incredible tolerance to alcohol，and urea elimination ratio of centrifugal
cells in simulation wine reached to almost 100% for 3 days. Up to 60% of the urea was eliminated after 24h incubation
as urease added to Chinese rice wine.
Key words： Acid urease 16S rDNA PCR Phylogenetic analysis urea Elimination ratio
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2008年第 6期
1.1.2 培养基 （1）富集培养基：葡萄糖 2％，Na2Ac 0.2％，KH2PO4 0.2％，NaCl 0.5％，尿素 2％，用 HCl 调节
pH 至 4.0，121℃，20 min 高压灭菌 。 （2）酸性平板 ：葡萄糖 2％，蛋白胨 1％，牛肉膏 0.5％，酵母膏 0.3％，
KH2PO4 0.2％，NaCl 0.5％，Na2Ac 0.2％，尿素 2％，溴甲酚红紫（终浓度 0.005 g/L），琼脂 2％，用 HCl 调节 pH
至 5.0，121℃，20min 高压灭菌。 （3）中性平板：葡萄糖 2％，蛋白胨 0.2％，牛肉膏 1％，酵母膏 0.3％，KH2PO4
0.2％，NaCl 0.5％，Na2Ac 0.2％，尿素 2％，琼脂 2％，酚红（终浓度 0.005 g/L）用 NaOH 调节 pH 至 6.8，121℃，
20min 高压灭菌。 （4）发酵培养基：葡萄糖 2％，蛋白胨 1％，牛肉膏 0.5％，酵母膏 0.5％，KH2PO4 0.2％，NaCl
0.5％，Na2Ac 0.2％，尿素 0.5％，MnSO4·4H2O（终浓度 0.05 g/L），Ni2SO4·6H2O（终浓度 0.05 g/L），用 HCl 调节
pH 至 5.5，121℃ ，20min 高压灭菌 。 （5）LB 培养基 ： 胰蛋白胨 1％ ，NaCl 1% ， 酵母膏 0.5％ ，pH 7.0 ~
7.2，121℃，30min 高压灭菌。
1.2 方法
1.2.1 酸性脲酶菌株的筛选 称取 1g 样品，溶于少量水，过滤后取滤液加入到以尿素作为惟一氮源的富
集培养基（pH 4.0）中培养 24h，以无菌生理盐水梯度稀释至合适菌浓，涂布酸性平板，37℃培养 24h。挑取有
蓝紫色透明圈的单菌落划线接种到中性平板上，若被挑入中性平板的菌落周围不形成变色圈，而仍然为指
示剂的颜色， 则可证明该菌株所产的脲酶为酸性脲酶或偏酸性脲酶。 将菌接入发酵培养基， 静置培养约
36h，离心后洗涤菌体，以 0.05mol/L 的柠檬酸-柠檬酸三钠缓冲液（pH 4.5）按 1︰5（v/v）悬浮测定酶活；测
定尿素去除率时，按菌体︰酒样＝1︰5（v/v）悬浮菌体，适温孵化后测定去除率。
1.2.2 酶活测定 利用 Berthelot 反应 [12]，采用比色法测定脲酶活力。 酶活定义：在常压、37℃、pH 4.5 的条
件下，每分钟分解尿素产生 1μmol 铵离子的酶量为 1 个酶活单位 U。
1.2.3 尿素去除率测定 采用二乙酰一肟-硫代氨基脲法 [13]。
1.2.4 菌株的生理生化初步鉴定 [14，15] 革兰氏染色与显微镜观察；生理生化鉴定。
1.2.5 菌株的分子生物学鉴定 （1）细菌基因组 DNA 提取和纯度检测主要采取传统酚仿法提取基因组
DNA[16]。 取细菌 DNA 20μl，水或 TE 稀释至 100μl，在紫外分光光度计下测量 260nm、280nm 下的 OD 值，计
算 DNA 纯度 、质量 ；（2）通过 GenBank 中所有常见
细菌 16S rDNA 的基因序列，利用 Primer Premier 5.0
软件设计细菌的扩增引物：上游 P0：5-GAGAGTTT
GATCCTGGCTCAG-3，下游 P6：5-CTACGGCTACCTT
GTTACGA-3 引物由上海 Sangon 生物工程公司合
成 ； （3）PCR 反应体系及参数设定 ：94℃ 预变性
5min，94℃ 1min；53℃ 1min，72℃ 2min 30s，35 个循
环；72℃充分延伸 10min， 终止反应，16℃ 保温。 取
5μlPCR 反应产物 ，1.5％ 琼脂糖凝胶 （60 V） 电泳
40min， 置紫外灯下观察 DNA 特异性条带；（4）PCR
产物回收方法 ： 取 20μl PCR 产物 ， 加入 2μl 3M
NaAc，50μl 100%乙醇，12 000g 离心 30min， 吸尽上
清。 加入 70μl 70%的乙醇 ，12 000g 离心 15min，吸
尽上清 ，室温下待已醇挥发干净 ，加入 10μl ddH2O
溶解 DNA； （5）PCR 产物的测序 PCR 反应 。 单个
0.2 mlPCR 管测序产物纯化方法 ： 取 20μl PCR 产
物，加入 2μl 3M NaAc，50μl 100%乙醇，12 000g 离心 30min，吸尽上清。 加入 70μl70%的乙醇，12 000g 离心
15min，马上吸尽上清。 重复此步骤 1 次。 待酒精在室温下挥发干净，加入 10μl Hi-Di Formamide 溶解 DNA。

 
Ex Taq
 
  l)  
10×Ex Taq Buffer (Mg )  
dNTP  
Template DNA  
P0  
P6  
ddH O 
 

表 1 16S rDNA 50μl PCR 扩增体系组成

 
 PCR

BigDye(2.5×)  

    
ddH O   
96 1min(96 10s50 5s60 4min) ×254

表 2 测序 PCR 反应体系组成
176
2008年第 6期
95℃ 4min，4℃ 4min，上机测序。 （6）16S rDNA 测序与同源性分析应用 ABI 3130 基因测序仪对扩增产物测
序 。 序列的同源性分析在 NCBI 网站上采用 Blast 软件检索 ， 参考 GenBank，EMBL （European Molecular
Biology Laboratory），DDBL（DNA Data Bank of Japan）等数据库。
2 结果与分析
2.1 细菌表型与生理生化鉴定
按照方法 1.2.1 筛选到一株初始酶活为 0.58U 的菌株，初步命名为 JN_R12。该菌的多相特性如表 3、表
4 所示。

 
   pH 5.5
   37
  / 
 ! "#$% &
’ ()*
 +, 2mm-48h.
/01 2
34 34
56 7


 
 
    
    
    
   
   
  MR 
   VP 
D-  !"#$ 
%&  ’ 
(  )* 
+, -, 
./0 
H


S 

表 3 JN_R12 的培养特征 表 4 JN_R12 的生理生化鉴定部分结果
注：＋ 利用但不产酸 ;＋＋ 利用糖且产酸
初步鉴定结果：根据菌株的个体形态、菌落形态以及部分生理生化实验结果，参照《伯杰氏细菌鉴定手
册》第 8 版 [17]，初步鉴定该菌为肠杆菌属细菌 Enterobacter sp.[18]。
2.2 JN_R12 分子生物学鉴定
2.2.1 16S rDNA 的 PCR 扩增 以 P0，P6 作为引物扩增 ，
PCR 产物经 1.5%琼脂糖凝胶鉴定，结果如图所示。在 1 400~
1 500bp 有明显条带。 目的条带清晰，引物特异性强，按照方
法 1.2.5（4），（5）回收并纯化产物后测序（图 1）。
2.2.2 16S rDNA 测序结果的数据库比对 将 16S rDNA 测
序结果登录 NCBI-BLAST， 与已报道的 16S rDNA 比对后发
现 ， 该菌与 Enterohemorrhagic Escherichia coli （EHEC）O157：
H7 有 100％的同源性。 一般公认的聚类分析中，16S rDNA 序
列同源性大于 97%即为同种成员。 从 BLAST 结果中选取同
源性较高的序列， 用 BioEdit 软件读取比对后使用 Mega 3.1
建树（图 2）。
2.3 模拟酒样及黄酒中尿素去除效果的考察
发酵收集全细胞洗涤后，分别添加至模拟酒样及黄酒中测定尿素去除率。 在模拟酒样中孵化 3d，每天
跟踪尿素含量变化。 在模拟酒中 24h 内的去除率接近 100％（图 3），在黄酒中 24h 的去除率也达到 65.2％。
课题组研究发现该菌经提取后的粗酶在一定的添加量下，实际黄酒中 24h 尿素去除率可达 70%以上 [19]。
3 讨论
筛选到一株稳定产酸性脲酶的菌株 JN_R12，该菌经生理生化以及分子生物学鉴定，确定此菌为 E.coli
图 1 JN_R12 16S rDNA PCR 扩增产物电泳图
1：Marker；2：16S rDNA 扩增产物
王松华等：产酸性脲酶菌株的筛选、鉴定及其脲酶的应用初探 177
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2008年第 6期
O157：H7。 该菌所产脲酶能在 pH 4.0 左右的体系
中保持酶活， 其耐酸机制和它能够广泛利用糖类
产酸有关，正由于它本身也能产酸，使它能够适应
酸性的环境。 该菌所产脲酶对酒精有较强的耐受
性，这一点从模拟酒样中尿素去除率就可看出。 此
脲酶在组分复杂的黄酒中其脲酶仍有较强活性 ，
去除率可以达到 60％以上， 说明具备在酒类加工
中尤其是黄酒中应用的优良潜质。
分子鉴定更依赖于数据库的完善 。 16S rDNA
是目前用于菌种鉴定的、 较于普通生理生化更为
准确的鉴定方法，但对于一个菌的归属问题 ，还需
要多方面、全方位的信息综合起来考虑，目前对于
实验中脲酶产生菌 JN_R12 的鉴定也只是结合系
统发育分析得出的结论，还有待于进一步 DNA-DNA 杂交验证。
在分子鉴定和酸性脲酶分离纯化的基础上，利用基因工程、分子克隆的手段，克隆出编码酸性脲酶的
基因，在安全的载体和宿主中进行高效表达，可在提高酶活的同时解决食品加工用酶的安全性问题。
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图 2 JN_R12 的系统发育进化树
图 3 模拟酒样中的尿素去除率















  
 






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