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研究报告

生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2010年第 9期
透明颤菌血红蛋白在枯草芽孢杆菌WB800中的
表达及其对菌体生长的影响
廖瑜玲1 任楠 2 李俊星 2 杨慧林 2
( 1广东肇庆星湖生物科技股份有限公司,肇庆 526040; 2华南理工大学生物科学与工程学院,广州 510006)
  摘  要:  通过基因工程的方法, 将透明颤菌血红蛋白基因 ( vhb)置于大肠杆菌
枯草杆菌穿梭质粒 pBEP43
DFE的强启
动子 P43下,构建重组质粒 pBEP43
vhb, 并通过化学感受态法转入枯草杆菌WB800中,转化子经过酶切和 PCR验证。采用一
氧化碳差异色谱法测定转入的血红蛋白基因具有表达活性。通过限氧试验表明, 血红蛋白基因能在低氧环境下促进菌体的
生长。
关键词:  透明颤菌 血红蛋白 枯草芽孢杆菌 表达 生长
Expression ofVitreoscilla Hemoglobin Gene inBacillus
subtilisWB800 and Effects on Growth
L iao Yuling
1  Ren Nan2 L i Junx ing2 YangHu ilin 2
(
1
Star LakeB ioscience Co., Inc., Zhaoqing 526040;
2
School of B ioscience and
Bioengineering, South China University of T echnology, Guangzhou 510006)
  Abstrac:t  Through gene tic eng ineer ing m ethod, the V itreoscilla hem og lobin gene( vhb) w as inserted into the Escher ichia coli
Ba

cillus sub tilis shuttle vecto r pBEP43
DFE. The recom binant p lasm id pBEP43
vhb w as construc ted and chem ically transfo rmed in toB acil

lus subtilisWB800. M o lecular ana lys is of the recom binant was carried by enzym e d igestion and PCR. The Vitreoscilla hemog lob in gene
w as dem onstrated by carbon m onox ide b ind ing analysis, and the resu lt show tha t ac tive Vitreoscilla hem og lobin was expressed in Bacillus
subtilisWB800. Accord ing to lim ited oxygen exper iment, V itreo scilla hem og lob in enhanced cell grow th under the low disso lved oxygen
concentrations.
Key words:  V itreoscilla H em og lobin Bacillus subtilis Expression G row th
收稿日期: 2010
02
11
作者简介:廖瑜玲,女,硕士,工程师,研究方向:微生物育种改造; E
m ai:l 65809029@ qq. com
透明颤菌血红蛋白 ( Vitreoscilla hemoglob in,
VHb)是 20世纪 70年代末, Tyree和W ebster在透明
颤菌 ( Vitreoscilla )中发现的一种血红蛋白。 1986
年, W akabayash i等从光谱特性、氧结合动力学和蛋
白质初级结构等角度证明该蛋白是一种原核生物中
的血红蛋白类蛋白质, 并正式将其命名为透明颤菌
血红蛋白 [ 1]。研究表明, VHb能在低氧条件下, 从
分子水平提高细胞自身对溶氧的利用能力, 满足菌
体细胞的呼吸要求,使之适应较低的溶氧水平,促进
细胞生长和代谢产物的合成,提高目的产物的产量
和收率。自从 VHb在大肠杆菌中成功地进行表达
以来, vhb基因已在假单胞杆菌、链霉菌、霉菌和酵
母等多种生物体内实现克隆。它已越来越多地应用
到微生物发酵工业的许多领域, 并取得了显著
成果 [ 2]。
枯草芽孢杆菌属的微生物发酵是高耗氧过程,
本研究拟通过基因工程手段把透明颤菌血红蛋白的
基因导入芽孢杆菌中,为解决芽孢杆菌类发酵中的
氧气利用率问题提供新的参考。
1 材料与方法
11 材料
111 菌株和质粒 Bacillus subtilis WB800和大
肠杆菌 -枯草杆菌穿梭质粒 pBEP43
DFE由华南理
生物技术通报 B iotechnology  Bulletin 2010年第 9期
工大学郭勇教授惠赠; pICAS
vhb质粒由华南理工大
学林影教授惠赠; pMD18
T载体购于 TaKaR a公司。
112 试剂 限制性内切酶 BamH I、Sal I和 T4
DNA连接酶、rTaq DNA聚合酶等购于 TaK aRa公司。
DNA凝胶回收试剂盒购于北京普博欣公司; 酵母浸
出物和胰蛋白胨购于英国 OXOID公司;氨苄青霉素
和卡那霉素购于 S igma;其它化学试剂均为分析纯。
113 PCR引物 用 primer 50软件设计扩增 vgb
引物。 P1: 5
CGAGTCGACATGTTAGACCAGCAAAC

CATTAAC
3 , 斜体部分为 Sal I酶切位点; P2: 5

CGGGATCCTTATTCAACCGCTTGAGCG
3 , 斜体部分
为 BamH I酶切位点。引物由上海英骏公司合成。
12 方法
121 vhb基因的克隆 以含有 vhb基因的质粒
pICAS
vhb为模板,用 P1和 P2引物 PCR扩增 vhb。
在 50
L体系中含 5
L rTaq 缓冲液、4
L 25
mmo l /L dNTP和 025
L的 rTaq ( 5 U /
L)。扩增
条件: 94! 5m in; 94! 30 s, 53! 30 s, 72! 30 s, 30
个循环; 72! 10 m in。电泳检测 PCR扩增产物大小
在 440 bp左右,与预期结果相符。将 PCR扩增产物
用普博欣公司试剂盒纯化后与 pMD18
T克隆载体
用 T4 DNA连接酶连接, 于 16! 连接过夜, 转化 E.
coli DH 5感受态细胞,提取阳性克隆的质粒 DNA,
送英骏公司进行 DNA测序分析, 将序列正确的重组
质粒命名为 pMD18T
vhb。
122 vhb基因表达载体的构建 用 BamH ∀和
Sal∀双酶切穿梭质粒 pBEP43
DFE 和 pMD18T

vhb, 分别回收 6 400 bp和 440 bp大小的片段, 连接
转化到 E. coli DH 5感受态细胞。提取质粒 DNA
对重组体进行酶切分析, 鉴定正确的重组表达质粒
命名为 pBEP43
vhb。
123 枯草杆菌WB800的化学转化及转化子筛选
 重组表达质粒 pBEP43
vhb转化枯草杆菌WB800的
方法参考文献 [ 4
6]。
124 血红蛋白的测定 方法参照文献 [ 7, 8] ,采
用一氧化碳差异色谱法测定血红蛋白。
125 枯草WB800的限氧培养 [ 9] 挑取 LB平板
上枯草杆菌WB800的单菌落, 接种于 10 mL LB培
养基中, 37! , 200 r /m in过夜培养, 以 10%接种量接
种于 superrich培养基 [ 10]中, 250mL瓶装液量20mL。 3
种培养方式, 一是正常培养状态: 37! , 200 r/m in;
二是限氧状态: 37! , 100 r /m in, 并用薄膜封口; 三
是贫氧状态: 37! , 20 r /m in, 并用薄膜封口。限氧
和贫氧状态需要每隔 12 h往摇瓶中放一次气。各
组取样测定 OD600值。
2 结果与讨论
21 vhb基因表达质粒的构建
为实现 vhb基因在枯草杆菌中重组表达, 用
BamH∀和 Sal∀双酶切质粒, 克隆到大肠杆菌
枯草杆
菌穿梭质粒 pBEP43
DFE的相应位点,质粒图谱如图 1
所示, PCR和酶切验证如图 2所示。质粒 PCR结果酶
切结果显示 400 bp左右的条带,双酶切后的片段也在
400 bp左右,证实 vhb基因已经成功地克隆到 pBEP43

DFE载体上, vhb基因以强启动子 P43驱动表达。
图 1 表达质粒的图谱
 1. 250 bp DNA M ark er; 2. PCR扩增鉴定 ; 3.阴性对照 ;
4.阳性对照 ( pICASvhb); 5. E coT14 I d igestDNA M arker;
6, 7. B amH ∀ /Sal ∀双酶切 pBEP43
vhb
图 2 PCR和双酶切鉴定电泳图
22 vhb基因表达量的测定
CO与 VHb结合后在波长约 420 nm处会产生
强烈的吸收峰,形成典型的 VHb蛋白特征曲线, 故
采用此法来检测所表达的 VHb是否具有活性。 CO
差异色谱试验结果如图 3显示,转化子表达的 VHb
蛋白在 420 nm处有明显吸收峰, 与之前的报道相
符 [ 5] , 而原始野生型菌株的蛋白粗体提物中没有出
178
2010年第 9期    廖瑜玲等:透明颤菌血红蛋白在枯草芽孢杆菌WB800中的表达及其对菌体生长的影响
现特征性吸收峰。这说明重组质粒 pBE3P43
vhb中
vhb基因在枯草杆菌 WB800中得到了成功表达,且
表达出的 VHb蛋白能结合 CO, 具有生物活性。
图 3 Bacillus subtilisWB800 /pBEP43
vhb
的 CO差示光谱分析
23 枯草WB800的限氧培养
正常培养的条件下, 发酵后期, 菌量增大,溶氧
可能表示出限制水平, 因此, 含有重组表达质粒
pBEP43
vhb的WB800在 10 h后略高于原始菌株 ( 4

A)。而限制培养的两种状态,含有 vhb基因的 Ba

cillus subtilisWB800均表现出好于原始菌株的生长
状态 (图 4
B, C )。说明 VHb对于改善发酵溶氧环
境是有正面效应的。特别是应对复杂的发酵环境,
由菌浓、通气、转速或发酵中的流体等造成整体溶氧
限制,或者局部菌体溶氧的限制, 含有 vhb基因的菌
株能从菌体本身去应对各种限养的环境,从根本上
尽量减少整个培养环境的不统一性, 保证发酵产物
的质量,事半而功倍,相信这也是很多利用外界环境
来缓和发酵液内部溶氧问题很难达到的效果。
3 结语
枯草芽孢杆菌是一种重要的工业微生物, vhb基
因的发现及研究进展为利用分子克隆技术解决枯草
芽孢杆菌微生物发酵过程中的氧气供求矛盾及实现
高密度发酵培养提供了良好途径。本研究构建的含
有 vhb基因的大肠杆菌
枯草杆菌穿梭重组质粒
pBEP43
vhb,为研究 VHb蛋白对枯草芽孢杆菌发酵
的影响提供参考。
A.正常状态; B.限氧状态; C.贫氧状态
图 4 不同培养状态对菌体生长的影响
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生物技术通报 B iotechnology  Bulletin 2010年第 9期
参 考 文 献
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