全 文 ：生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN·研究报告· 2008年第 6期
收稿日期：2008-04-30
基金项目：国家自然科学基金项目（30471009）
作者简介：邹智（1982-），男，湖南娄底人，在读硕士，研究方向：植物基因工程；E-mail：zouzhi2008@126.com
通讯作者：卢长明，Tel：027-86728186；E-mail：cmlu@oilcrops.cn
农杆菌介导法以机理明确、操作简单、费用低廉等独特优点成为植物遗传转化的首选。 在农杆菌的转
化过程中，T-DNA 区基因的表达可分为瞬间和稳定表达 2 种。 瞬间表达无需 T-DNA 整合进植物基因组 [1]，
它是外源基因进入细胞核后、整合之前利用宿主的转录、翻译系统进行短时间的基因表达 [2]，表达产物即新
合成的蛋白质或酶活性在侵染后 36～72h 就能检测到 [2~5]，3～4d 达到最大值，随后逐渐降低 [2，5，6]，10d 左右降
到最低。稳定表达是 T-DNA 整合到宿主基因组后产生的，侵染后大约 10～14d 表达开始增加 [2]。虽然稳定表
达是衡量转化效率高低的最终指标（在实际应用中一般以外源基因在转化植株及后代中的表达为标准）[5]，
但鉴于农杆菌介导法转化周期过长、影响因素众多等，采用瞬间表达优化转化体系已成为提高农杆菌介导
植物转化效率的重要手段 [7]。
植物源内含子对 GUS基因表达模式的影响
邹智 吴刚 肖玲 武玉花 聂淑晶 肖娜 卢长明
（中国农业科学院油料作物研究所 农业部油料作物遗传改良重点开放实验室，武汉 430062）
摘 要： 采用报告基因的瞬间表达来优化转化体系是提高农杆菌介导法转化效率的重要手段，GUS以稳定、易于
定性定量分析等独特优点成为瞬间表达体系的首选。pCaMV 35S启动下的GUS基因可在农杆菌中表达，另外还首次报
道该嵌合基因同时也可在大肠杆菌中高效表达。为避免 GUS基因在农杆菌中的表达对瞬间表达体系的影响，一拟南芥蛋
白基因的内含子被插入到 GUS基因的编码区，进而构建了含内含子的GUS植物表达载体pBI121-GUSint。组织化学染色
结果表明，GUSint在农杆菌中没有表达，而在接种3d的油菜中可高效瞬间表达，其中在子叶柄（带子叶）中瞬间表达率高
达100%，这一方面证实载体构建成功，另一方面也为进一步优化油菜及其它芸薹属植物转化体系及在油菜中快速研究目
的基因的功能和表达调控模式奠定了基础。
关键词： GUS 内含子 表达模式 根癌农杆菌 甘蓝型油菜 瞬间表达
Effects of Botanical Intron on Expression Pattern of GUS Gene
Zou Zhi Wu Gang Xiao Ling Wu Yuhua Nie Shujing Xiao Na Lu Changming
（Oil Crops Research Institute，Chinese Academy of Agricultural Sciences，Key Laboratory of Oil Crops Genetic
Improvement，Ministry of Agriculture，Wuhan 430062）
Abstract： Using transient expression of reporter genes to optimize transformation systems has become an important
method to improve the efficiency ofAgrobact rium-mediated transformation，whileGUS gene used as reporter gene
commonly in transient expression systems to analyze transformation qualitatively and quantitatively.GUS gene drived by
pCaMV 35S was expressed inAgrobacterium tumefaciens，and expression inE. col was reported for the first time. To
avoid GUS expressing inAgrobacterium，a GUS expression vector pBI121-GUSint with a histone intron ofArabidopsis
thaliana was constructed. The results of histochemical GUS assay showed that no expression of GUSint was observed in
Agrobacterium，with transient expression as high as 100% in cotyledonary node（with cotyledons） ofBrassica napus L.
after inoculated for three days. It not only verified that the vector was successfully constructed，but also laid a basis for
further increasing the stable transformation efficiency of otherBrassic plants，and rapidly clarifying the function and
pattern of expression and regulation of a unknown gene.
Key words： GUS Intron Expression patternAgrobacterium tumefaciens Brassica napus L. Transient expression
2008年第 6期
在众多报告基因中，GUS 基因以稳定、易于定性定量分析等独特优点成为瞬间表达体系的首选，一般
联合一些组成型启动子如 pCaMV 35S（Cauliflower mosaic virus 35S promoter）。 pCaMV 35S 来源于植物病毒，
并且作为一种泛组织表达启动子广泛用于植物的转基因研究，但有研究表明它与 GUS 基因构成的融合基
因可在农杆菌中表达 [3，4]，这会干扰对瞬间表达体系的研究。 为此，有必要对表达载体进行改造，应用最多
的是在 GUS 基因的编码区插入一个植物来源的内含子，因为农杆菌属于原核生物，缺乏内含子剪接装置
而不能形成蛋白，这就可避免 GUS 在农杆菌中的溢漏表达 [3，8]。由于密码子偏爱性，不同来源的内含子在同
一植物中的剪切效率不同，同一内含子在不同植物中的剪切效率也不一样 [9]。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 转化所用植物 本实验室自交多代的甘蓝型油菜（Brassica napus L.）品种中油 821。
1.1.2 菌株和质粒 大肠杆菌 （Escherichia coli.）菌株 TOP10F、根癌农杆菌 （Agrobacterium tumefaciens）菌
株 LBA4404（内含质粒 pAL4404）、中间载体 pZERO （Ampr，吴刚等 未发表资料 ）、植物表达载体 pBI121-
H2A1（Kanr） [10]、pBI121（Kanr） [11]和 pBI121-GFP（Kanr，吴刚等 未发表资料）均由本实验室保存。
1.1.3 酶 、试剂盒及生化试剂 高保真 DNA 聚合酶 （Kod Plus）购自 ToYoBo 公司 ；PCR 相关试剂 、Takara
LA Taq DNA 聚合酶 、限制性内切酶和其它工具酶皆购自宝生物工程 （大连 ）有限公司和基因公司 ；cycle-
pure kit（100）和 Rapid Plasmid DNA Daily Miniprep Kit（250）购自 omega 公司 ；PCR 引物均由上海生物工程
技术服务有限公司合成 ；氨苄青霉素 （Amp）、卡那霉素 （Kan）、利福平 （Rif）、链霉素 （Str）、羧苄青霉素
（Car）、乙酰丁香酮（As）、X-Gluc、MS、B5 和 LB 培养基成分及抗生素购自国内外相关厂商 。 As、Amp、Car、
Kan、Rif、Str 均用 0.22μm 滤膜抽滤灭菌，于培养基高温高压灭菌后再加入。
1.2 方法
1.2.1 载体构建 PCR 扩增引物设计 从 pBI121 和 pBI121-H2A1 上设计如下 3 对引物 P1：5-AGCGGATAA
C AATTTCACACAGGA-3；P2：5-CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC-3；P3：5-CTTTCGGTATAAAGA CTTCGC
G-3；P4：5-GTTGGGCAGGCCAGCGTA-3；P5：5-GTAAAATTACATCGTCTTTTCTCTCT-3；P6：5-CTGAACA A
ATTCAAAACACACAATT CA-3。
测序及验证引物 P7：5-TTTGGAGAGAACACGGGGGACT-3；P8：5-GTTAAGCATGTAA TAATTAACATG-
3。
载体构建过程参照《分子克隆实验指南》第 3 版、试剂盒相关说明书，用高保真 DNA 聚合酶扩增相应
的片段，载体及菌验证采用 Taq 酶，以 pBI121 为模板用 P1/P3 和 P2/P4 分别扩增到 GUS 基因的 2 段序列
G1 和 G2， 以 pBI121-H2A1 为模板用 P5/P6 扩增到 H2A
内含子 H，G1 和 G2 先用 T4 PNK 进行磷酸化，G1 磷酸化
产物与 H 用 T4 DNA 连接酶连接再用高保真 DNA 聚合
酶进行扩增，产物纯化后与 G2 磷酸化产物连接。 连接产
物用 EcoRⅠ/HindⅢ酶切后连入同样酶切处理的中间载
体 pZERO（Ampr）上；重组载体经用 P7/P8 PCR 验证后委
托北京三博远志进行序列测定。 确认无误的载体用 EcoR
Ⅰ/HindⅢ酶切后连入同样酶切处理的植物表达载体
pBI121-GFP（Kmr）上 ，用 P5/P5、P7/P8 进行 PCR 验证 ；阳
性载体 pBI121-GUSint 采用电击法导入 LBA4404 感受态
细胞中 [10]。
1.2.2 油菜的转化 油菜转化的基本过程见图 1。

较优条件发芽培养基 1/2MS 无机
盐+1.5%蔗糖+0.8%琼脂，pH5.8；外
植体 4d 龄的子叶柄 ； 预培培养基
1/2MS 无机盐+B5 有机物+0.2mg/L
6-BA+1.0mg/L 2，4-D+1.5%蔗糖+
0.8%琼脂 ，pH5.8， 预培养 2d 农杆
菌增殖 28℃ ， 液体 LB 中培养至
OD600=0.6~0.8；悬菌培养基 1/2MS+
200μM As，pH5.4，19℃， 预活化 3~
4h； 侵染条件 OD600=0.08 的活化菌
侵染 3~5min；共培培养基 1/2MS 无
机盐 +B5 有机物 +0.2mg/L 6 -BA +
1.0mg/L 2，4-D+200μM As+3.0%蔗
糖 +0.8% 琼 脂 ，pH5.4 共 培 条 件
22℃黑暗中共培养 3d
图 1 油菜转化的基本过程及较优的转化条件
邹智等：植物源内含子对 GUS基因表达模式的影响 79
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2008年第 6期
1.2.2.1 外植体的准备 选取籽粒饱满的油菜种子用 70％的酒精浸泡 30s，无菌水冲洗 2～3 次；再用 0.1%
的升汞浸泡 l3～15min（期间不时摇动），无菌水冲洗 3～5 次；然后接种于发芽培养基上，置培养室中 25±℃
下，光照 16h/d，2 000lx 萌发；切取 4d 龄的子叶柄（带子叶，尽量靠近生长点）作为外植体。
1.2.2.2 侵染菌液的准备 取出-70℃保存含有目的表达载体的农杆菌菌株 LBA4404 划线接种于含 50mg/
L Kan+50mg/L Rif+50mg/L Str 的 LB 固体培养基平板上，28℃下倒置培养 3d； 于转化前一天挑取单菌落接
种于含 50mg/L Kan 的 15ml LB 液体培养基中，置于摇床上 200～210r/min，28℃下培养过夜（16～20h），使菌
体达到对数期（OD600=0.6～0.8）；吸取 3ml 菌液离心收集菌体（8 000r/min，3min，室温），用悬菌培养基冲洗 2
次，稀释 10 倍左右使终浓度达 OD600=0.06～0.08；19℃，210r/min 摇 3～4h 进行预活化。
1.2.2.3 侵染及共培养 将切取的外植体置于含农杆菌的锥形瓶中侵染 3～5min， 期间不断晃动使其充分
接触，倒掉菌液，并用灭菌滤纸迅速吸干余液；将子叶柄插入共培培养基中，22℃黑暗中共培养 3d。
1.2.3 细菌与外植体的 GUS 染色
1.2.3.1 GUS 染液 在 Jefferson 等 [11]基础上改进而成，50mmol/L 磷酸钠缓冲液 pH 7.0，100mmol/L 亚铁氰
化钾，100mmol/L 铁氰化钾，10mmol/L Na2EDTA，1% Triton X-100 （V/V），0.1mg/ml 氯霉素，20%甲醇，1.0mg/
ml X-Gluc。
1.2.3.2 染色方法 大肠杆菌（含有 pBI121 的 TOP10F 和不含 pBI121 的 TOP10F 2 种）37℃、农杆菌（不含
任何双元载体的 LBA4404、 含 pBI121 但不经预活化的 LBA4404、 含 pBI121 且经预活化的 LBA4404、含
pBI121-GUSint 但不经预活化（不加 As）的 LBA4404 及含 pBI121-GUSint 且经预活化的 LBA4404 5 种 ）28℃
培养过夜后用 1.5ml 的离心管离心并用悬菌培养基稀释至 OD600=0.08；37℃（大肠杆菌） 或 19℃（农杆菌）
210r/min 培养 4h，离心后用 GUS 染液悬浮，37℃保温 4h 后再离心直接进行拍照；把共培一定时间的外植体
用 GUS 染液浸没，37℃保温 4h，用 70%的乙醇脱色后进行拍照。
2 结果与分析
2.1 pBI121-GUSint 载体的构建
pBI121-GUSint 载体构建过程见图 2。 GUSint（3 379bp）连接好后采用高保真 DNA 聚合酶进行 PCR 扩
增并克隆到中间载体 pZERO（Ampr）上，测序结果表明目标片段连接正确（未列出）；随后 GUSint 被克隆到
植物表达载体 pBI121-GFP（Kmr）上，替换了原载体上的 GFP（1 937bp）；最后 pBI121-GUSint 被导入农杆菌
感受态细胞中。用 P5/P5、P7/P8 进行菌落 PCR，结果表明从大肠杆菌和农杆菌中都扩增到 2 394 bp（GUS 基
因编码区）和 347bp（H2Aint）的目标片段（图 3）。



图 2 植物表达载体 pBI121-GUSint 的构建过程
图 3 重组质粒 pBI121-GUSint 的 PCR 扩增产物
M: DNA ladder;1~2，4~5:分别为 2 个大肠杆菌克隆用 P7/ P8 与
P5/P6 的 PCR 扩增产物 ;3 和 6:农杆菌克隆 1 的 PCR 扩增产物
2.2 GUS 基因（pBI121）在大肠杆菌和农杆菌中的高水平表达
早前研究结果表明 pCaMV 35S 启动下的 GUS 基因和 GFP 基因可在农杆菌中表达 [3，4，12]，这不但会在转
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化试验中造成大量的假阳性，而且会严重干扰瞬间表达体系研究中对影响因素的准确评估。 为此，首先研
究了 GUS 基因在细菌（包括大肠杆菌和农杆菌）中的表达情况。 结果表明，GUS 基因不仅可在农杆菌中表
达，同时也可在大肠杆菌中表达，2 种不含 pBI121 的的对照菌中都未见表达。 农杆菌中的结果与早期的研
究是一致的，LBA4404 中不存在内源 GUS 活性 [3，11，13，14]；在农杆菌中 ，As 活化后的 GUS 基因表达水平明显
提高，可与在大肠杆菌中的相当，这一结论还有待进一步定量验证。实验中所构建的 pBI121-GUSint 在农杆
菌（包括预活化过的菌）中都未见表达（图 4）。
2.3 GUS 基因在油菜中的高效瞬间表达
在烟草中，虽然 GUS 基因的 mRNA 产物 18~24h 就能检测到，但 GUS 蛋白只有在接种后 2.5d 才能检
测到 [5]。 油菜中，GUSint 在农杆菌侵染后 2d 开始表达，如进行 12~15h 的预活化，24h 就能检测到，随后逐渐
增强，3～4d 达到最大值（未列出）。 从表达部位看，GUS 活性主要存在于外植体的切口处，即子叶柄的柄端，
中间的维管束附近。 虽然共培 3d 时 GUS 基因的表达水平很高，但是此时农杆菌在培养基上已长出，并且
外植体开始褐化，这在下胚轴的转化中更为严重（未列出），而褐化的外植体一般很难分化出芽。





图 4 大肠杆菌和农杆菌的 GUS 组织化学染色
1：不含任何质粒的大肠杆菌 TOP10F；2：含 pBI121 的 TOP10F；
3：不含任何二元载体的根癌农杆菌 LBA4404；4：未预活化的含
pBI121 的 LBA4404；5：经 As 预活化后的含 pBI121 的 LBA4404；
6：未预活化的含 pBI121-GUSint 的 LBA4404；7：经 As 预活化后
的含 pBI121-GUSint 的 LBA4404
图 5 油菜子叶柄的组织化学染色
A：未经农杆菌侵染子叶柄的 GUS 染色 ；B：农杆菌侵染 3d
后子叶柄的 GUS 染色 ；C：未经农杆菌侵染子叶柄 (带子叶 )
的 GUS 染色 ；D：农杆菌侵染 3d 后子叶柄 (带子叶 )的 GUS
染色；E：子叶柄端染色部位的放大图
3 讨论
鉴于农杆菌介导植物遗传转化过程的复杂性， 在建立或优化转化体系时研究人员都倾向于首先采用
瞬间表达体系对各影响因素进行评估 [13]，而这在单子叶和难转化双子叶植物中应用尤为广泛 [7]。
研究结果表明 pBI121 上的 pCaMV 35S-GUS 可在农杆菌中表达，这与早前的研究结果是一致的 [3，8]。 农
杆菌中高水平的 GUS 基因表达会严重干扰对各影响因素的准确评估。 而值得注意的是国内科研人员似乎
还没意识到这个问题，他们大多采用无内含子的 GUS 基因，如来自 pBI121、pCAMBIA1381 等 [15~17]。 另外还
发现 pCaMV 35S-GUS 可在大肠杆菌中表达， 这在国内外尚属首次报道， 因此研究成员在应用 pCaMV 35S
这类泛组织表达启动子联合无内含子的功能基因进行研究时值得特别注意。 解决这一问题常用的有如下
3 种策略：一是外植体共培后用 Car、Cef 等抗生素进行脱菌处理，这一方面增加了劳动强度，另一方面也影
响了的结果的实时性和准确性。 因此，是一种治标不治本的方法 [15]；二是更换为甘露碱合成酶（mannopine
synthase）等启动子 [4]或去除 pCaMV 35S 中的 SD 序列 [2]，这方法有一定的效果，但应用较少；应用最多的是
第 3 种方法即在 GUS 基因中插入一植物来源的内含子 [2，3，8，18]，内含子的插入一方面可避免 GUS 基因在农
杆菌中溢漏表达，另一方面也可提高 GUS 基因在植物中的表达水平。 然而由于不同植物的密码子偏爱性
不同，不同来源的内含子在同一植物中的剪切效率不同，同一内含子在不同植物中的剪切效率也不一样，
这种差异在单、双子叶植物之间尤为突出 [9]，虽然这部分还与内含子的插入位点有关 [19]。
为了研究早期一些因素对农杆菌介导的芸薹属植物转化效率的影响， 从与芸薹属亲缘关系最近的拟
南芥中克隆了一组蛋白基因的内含子，经插入到 GUS 基因的编码区后，进而构建了载体 pBI121-GUSint。这
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生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2008年第 6期
是国内外首次报道利用拟南芥基因的内含子进行基因的表达调控研究； 采用拟南芥作为内含子来源的另
一个原因是拟南芥基因组小，大部分内含子都在进化中丢失，余下来的一般都比较重要。 PCR 和测序结果
表明序列连接正确（图 3）；GENSCAN 分析表明 GUSint 在拟南芥中可正确剪切（未列出）；组织化学染色结
果表明 GUSint 在农杆菌中没有表达，而在油菜外植体中可高效瞬间表达，这进一步证实载体的构建是成
功的。利用此载体对影响瞬间转化的各因素进行了优化，其中包括外植体的龄期、农杆菌的培养条件、共培
条件、预培养等（邹智等，待发表资料），使子叶柄外植体的瞬间转化率达到 100%，因此，为进一步提高油菜
及其它芸薹属植物的稳定转化效率及在油菜中快速鉴定外源基因的功能和表达调控奠定了基础 。 虽然
GUSint 在植物中的表达水平是否比 GUS 基因表达水平更高还有待进一步研究，但可以肯定的是 ，拟南芥
H2A 内含子作为一种新型的插入内含子至少在油菜（甚至是十字花科植物）中应用是可行的。
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