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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2011 年第 4 期
树干毕赤酵母木糖还原酶基因的克隆及在
大肠杆菌中的表达
麻慧明 陈介南 张伟涛 何钢
(中南林业科技大学生物环境科学与技术研究所，长沙 410004)
摘 要: 根据 NCBI中的木糖还原酶基因序列设计引物，利用高保真聚合酶克隆树干毕赤酵母木糖还原酶基因，加 A后
克隆到质粒 pGM-T中，测序验证。然后将目的基因克隆到含有强启动子的穿梭表达载体 p424GPD中，构建含有 XYL1 基因的
重组质粒 p424GPD-XYL1。将 p424GPD-XYL1 转化到大肠杆菌中，提取总蛋白，聚丙烯酰胺凝胶电泳分析，酶活测定确定木糖
还原酶基因 XYL1 在大肠杆菌中得到活性表达，表明表达载体构建成功。表达载体的成功构建为后续构建重组酿酒酵母利用
木糖发酵奠定基础。
关键词: 树干毕赤酵母 木糖还原酶基因 穿梭载体 酿酒酵母 乙醇
Cloning of Xylose Reductase Gene from Pichia stipitis and
Expression in E． coli
Ma Huiming Chen Jienan Zhang Weitao He Gang
(Institute of Biological and Environmental Science ＆ Technology，Central South University
of Forestry and Technology，Changsha 410004)
Abstract: The primers were designed according to the sequence of XYL1 reported on the NCBI． The gene encoding xylose reduc-
tase was amplified by using high-fidelity DNA polymerase from total DNA of Pichia stipitis，and cloned into pGM-T vector after added
A． The vector was verified by sequencing． The target gene was cloned into a shuttle vector p424GPD and placed under the strong consti-
tutive promoter GPD． The recombinant vector p424GPD-XYL1 was transformed into E． coli TOP10，extracting the total protein and anal-
ysis by SDS-PAGE． The xylose reductase gene was expressed in E． coli by means of enzyme assay． The construction of this vector pro-
vides an important basis for the further establishment of recombinant Saccharomyces cerevisiae．
Key words: Pichia stipitis XYL1 gene Shuttle vector Saccharomyces cerevisiae Ethanol
收稿日期:2010-11-02
基金项目:国家公益性行业科研专项(201004001) ，国家“948”项目(2006-4-123) ，常德市科学技术局技术研究与开发资金项目(2010BS04)
作者简介:麻慧明，女，硕士研究生，研究方向:酵母代谢工程;E-mail:mahuiming198611@ 163． com
通讯作者:陈介南，E-mail:chenjny@ gmail． com
木质纤维资源是地球上现存最大量的生物质资
源，也是当前利用率最低的资源。因此，利用生物技
术将其转化为乙醇，既可以节约自然资源，又可以减
缓能源紧张。木质纤维素主要由纤维素、半纤维素
和木质素组成。其中纤维素，半纤维素经酸处理或
酶解后可转化为葡萄糖和木糖等单糖。
目前，尚无天然微生物能够将木质纤维糖化液
中的 C6和 C5糖同时快速有效地转化为乙醇，成为了
木质纤维高效发酵乙醇的一大障碍，因此，开发出能
对 C6和 C5糖进行快速、完全、同步发酵并且抗逆性
强的工程菌株成为当务之急。
传统乙醇生产菌株酿酒酵母只能利用葡萄糖，
而不能利用木糖发酵，但能发酵其异构体木酮糖，可
通过基因工程等方法将代谢木糖的关键基因转入酿
酒酵母，对其进行改造以获得能利用木质纤维素水
解液中的多种组分又能稳定高效产醇的基因工程
菌［1 － 4］。利用基因工程技术改良酿酒酵母，一般是
将树干毕赤酵母中的木糖还原酶基因(XYL1)和木
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2011 年第 4 期
糖醇脱氢酶基因(XYL2)转入酿酒酵母中进行表
达［5 － 9］，使其能够利用木糖。通过遗传重组来解决
C6 /C5 糖共发酵难题，已在一些酿酒酵母中获得部
分成功。如 Eliasson 等［10］构建的的代谢木糖的重组
酿酒酵母 TMB3001，Karhumaa 等［11，12］构建的重组酿
酒酵母 TMB3050 和 TMB3057 等，提高了一些菌株在
厌氧条件下葡萄糖和木糖的乙醇发酵能力，为木质纤
维生物转化制取生物乙醇奠定了一定的理论基础，但
目前乙醇的产率仍比较低，因此，需进一步对利用木
糖发酵生产乙醇的重组酵母菌株进行研究。
本研究主要是利用高保真酶从树干毕赤酵母中
克隆得到木糖还原酶基因 XYL1，经序列测定，结果
与 GenBank 公布完全一致。将木糖还原酶基因
XYL1 导入穿梭表达载体中 p424GPD，并将载体
p424GPD转化大肠杆菌，通过超声破碎方法提取大
肠杆菌总蛋白，SDS-PAGE 电泳分析总蛋白，测定木
糖还原酶酶活(蛋白) ，验证载体构建成功与否，为
下一步整合载体的构建和利用木糖酵母工程菌的构
建奠定了基础。
1 材料与方法
1. 1 材料
1. 1. 1 菌株与质粒 树干毕赤酵母(Pichia stipitis)
购自中国工业微生物菌种保藏管理中心，大肠杆菌
E． coli TOP10 和质粒 pGM-T购自天根生化科技(北
京)有限公司，穿梭表达载体 p424GPD 购自美国标
准菌种收藏所。
1. 1. 2 培养基 LB培养基(1%蛋白胨，0. 5%酵母
膏，1%NaCl，pH7. 0)固体培养基添加 2%琼脂，，用
于培养大肠杆菌;YPD培养基(1%酵母膏，2%蛋白
胨，2%葡萄糖) ，固体培养基加入 2%琼脂用于培养
树干毕赤酵母。
1. 1. 3 主要试剂和仪器 酵母基因组 DNA提取试
剂盒、pGM-T 克隆试剂盒、普通琼脂糖凝胶 DNA 回
收试剂盒、普通 DNA产物纯化试剂盒、X-Gal、Mark-
erⅤ、λ DNA /HindⅢ，T4 DNA 连接酶购自天根。
rTaq酶、高保真酶、限制性内切酶、dNTP Mixture 购
自宝生物。氨苄青霉素购自北京鼎国生物技术有
限公司。引物合成及基因序列的测定有南京金
斯瑞生物科技有限公司完成。NADH 购自 Gen-
view，牛血清清蛋白，考马斯亮蓝购自 Solarbio，其
他化学试剂均为国产分析纯。PCR 扩增仪为 MJ
Research Inc． 生产的 RTC100 型，岛津 UV 5420
紫外分光光度计。
1. 2 方法
1. 2. 1 树干毕赤酵母基因组的提取 将树干毕赤
酵母接于 YPD液体培养基，30℃培养至对数期。采
用天根公司的酵母基因组 DNA 提取试剂盒提取树
干毕赤酵母的总 DNA。
1. 2. 2 引物设计及目的基因的扩增 根据 NCBI
中公布的树干毕赤酵母 CBS6054 的木糖还原酶基
因的序列信息设计引物［13］，上游加入 BamH I 酶切
位点。引物序列:XYL1-up:5-CGGGGATCCGCCAC-
CATGCCTTCTATTAAG-3，XYL1-down:5-GCCAG-
GCTTTTAGACGAAGATAG-3。
提取基因组后，利用如上引物进行高保真扩增。
反应条件:94℃，5 min;94℃，1 min;55℃，1 min;
72℃，2 min;30 个循环;72℃，5 min。扩增产物经琼
脂糖凝胶电泳鉴定。
1. 2. 3 克隆载体 pGM-T-XYL1 的构建、大肠杆菌转
化及阳性克隆的筛选 因为 PCR扩增利用的是高保
真酶，扩增产物经琼脂糖凝胶电泳分离回收，需在 3
末端加A，反应体系:回收DNA片段15 μL，加A反应
液 4 μL，Taq酶 1 μL。反应条件:72℃保温 30 min。
将加 A后的产物和克隆载体 pGM-T连接，连接产
物转化大肠杆菌 TOP10，在含有氨苄抗生素平板上进
行蓝白斑筛选检出白色菌落的转化子接种到含有氨苄
青霉素的 LB液体培养基中培养，提取质粒，电泳检测。
利用限制性内切酶 BamH I，Pst I 双酶切阳性克隆载
体，酶切的产物经琼脂糖凝胶电泳鉴定，与预期大小相
符。将质粒送至南京金斯瑞生物科技有限公司测序。
1. 2. 4 穿梭表达载体 p424GPD-XYL1 的构建及大
肠杆菌转化筛选 将上步所筛选的阳性克隆载体
pGM-T-XYL1 利用 BamH I 和 Pst I 双酶切过夜，经
琼脂糖凝胶电泳分离回收约 1 000 bp左右的酶切产
物。回收片段与经相同的限制性内切酶双酶切回收
的的穿梭表达载体 p424GPD连接，连接产物转化大
肠杆菌 TOP10，在含有氨苄抗生素的平板上挑出转
化子，接种到含有氨苄青霉素的 LB 液体培养基中
振荡培养，提取质粒，电泳检测。利用限制性内切酶
BamH I和 Pst I双酶切部分阳性转化子，酶切的产
271
2011 年第 4 期 麻慧明等:树干毕赤酵母木糖还原酶基因的克隆及在大肠杆菌中的表达
物经琼脂糖凝胶电泳鉴定。
1. 2. 5 粗酶液制备 将 E． coli(p424GPD-XYL1)接
入 LB液体培养基，37℃培养过夜，9 000 r /min 离心
10 min，收集菌体，PBS 洗涤两次后，用 10 mL PBS
悬浮，超声破碎(冰浴，400 W，工作 2 s，间隔 2 s，1
个周期 30 次，2 个周期) ，12 000 r /min离心 10 min，
上层清液即为粗酶液。
1. 2. 6 聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析
采用质量分数为 12. 5 %分离胶进行 SDS-PAGE
电泳，用考马斯亮蓝 R250 染色。
1. 2. 7 木糖还原酶酶活的测定［14］ 按照木糖还原
酶反应体系加入 PBS缓冲液，底物以及 100 μL 5%
的 TCA，在体系中分别加入 0，25、50、75、100、125、
150、175 和 200 μL的 NADH母液(1. 5 mmol /L) ，用
分光光度计测定在 340 nm处的吸光值。
用分光光度计在 340 nm处测定NADH依赖的木
糖还原酶活力。反应体系 3 mL 中包括 100 mmol /L
的 PBS缓冲液，0. 2 mol /LD-木糖，0. 15 mmol /L辅酶
NADH，加入适量的粗酶液启动反应 1 min，用100 μL
TCA终止反应比酶活(U /mg)。用每毫克总蛋白每
分钟内氧化 NADH生成 NAD +的微摩尔数表示。
粗酶液中的蛋白浓度用 Bradford［15］方法测定，
以牛血清蛋白作为标准。
2 结果
2. 1 树干毕赤酵母木糖还原酶基因的克隆
以树干毕赤酵母基因组为模板进行 PCR，PCR
产物经琼脂糖凝胶电泳检测，结果(图 1)显示，在大
约 1 000 bp处有明显条带，与预期结果一致。
将扩增平末段产物胶回收后在 3-末端加 A
和克隆载体 pGM-T连接，转化大肠杆菌 TOP10，筛
选阳性克隆载体(图 2)。利用限制性内切酶
BamH I，Pst I双酶切阳性克隆载体，酶切的产物经
琼脂糖凝胶电泳鉴定(图 3) ，与预期大小基本相
同。对克隆得到的还原酶基因序列进行测序，基
因序列测序结果与 NCBI中的基因序列一致，证明
克隆成功。
M． marker V;1． PCR-XYLI
图 1 PCR产物的
电泳检测
M． DNA Hind III marker;1，3，4，6．
阳性克隆;2，5．阳性克隆
图 2 阳性克隆载体的筛选
M. DNA/Hind III marker;
1，2．阳性克隆的双酶切检测
图 3 阳性克隆载体的
双酶切检测
2. 2 表达载体 p424GPD-XYL1 的构建
利用 BamH I和 Pst I 双酶切克隆载体和表达载
体 p424GPD，胶回收表达载体和克隆载体的 998 bp
的目的片段(图 4)。胶回收连接转化后筛选阳性转
化子(图 5)。部分阳性转化子双酶切鉴定，酶切结果
与预期结果相符(图 6)。
2. 3 木糖还原酶的电泳分析
将 E． coli(p424GPD-XYL1)的总蛋白进行 SDS-
PAGE电泳分析，结果(图 7)表明，重组菌株在大约 36
kD处有很明显蛋白质特征条带出现，该蛋白质分子量
与基因序列推测所得理论分子量 35. 79 kD 大小基本
一致，可认为该蛋白质即为表达的木糖还原酶。
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生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2011 年第 4 期
M． DNA /Hind III marker;1．表达载
体 p424GPD 双酶切;2． 阳性克隆
载体的双酶切
图 4 表达载体的构建
M． DNA /Hind III marker;1，2，3，4，6． 阳
性克隆;5．阴性克隆
图 5 p424GPD-XYL1 表达载体的筛选
M． DNA /Hind III marker;1，2，3．
p424GPD-XYL1 双酶切检测;4，5．
p424GPD阴性对照
图 6 p424GPD-XYL1 的双酶切鉴定
1，2． E． coli(p424GP D-XYL1)表达蛋白
图 7 E． coli(p424GPD-XYL1)的双酶切鉴定
2. 4 木糖还原酶基因在大肠杆菌中的表达及木糖
还原酶酶活的测定
将 E． coli(p424GPD-XYL1)接入 LB培养 37℃培
养过夜，超声破碎制备粗酶液，测定其酶活，木糖还原
酶粗酶液中蛋白质的浓度为 2. 058 mg /mL，木糖还原
酶酶活为 0. 0334 U/mg，证明表达载体构建成功。
3 讨论
本研究根据 NCBI公布的木糖还原酶基因序列
设计引物，利用高保真酶进行扩增，保证碱基的准确
性。将克隆得到的木糖还原酶基因与带有强启动子
GPD 的穿梭载体 p424GPD 融合，构成表达载体
p424GPD-XYL1，并将其转化大肠杆菌表达，SDS-
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2011 年第 4 期 麻慧明等:树干毕赤酵母木糖还原酶基因的克隆及在大肠杆菌中的表达
PAGE电泳检测木糖还原酶分子量大小，经酶活测
定确定木糖还原酶基因 XYL1 在大肠杆菌中得到活
性表达，表达载体构建成功。
通过 SDS-PAGE电泳检测和酶活测定可知木糖
还原酶在大肠杆菌中表达量很低，分析可能是如下
两个原因:(1)穿梭载体所带有的强启动子 GPD 为
真核启动子，在大肠杆菌中未起到增强基因表达的
作用;(2)大肠杆菌缺少真核基因翻译后加工机制，
无法将木糖还原酶基因表达的多肽链折叠成具有生
理活性的高级结构，所以表达蛋白活性很低。因此，
要使木糖还原酶基因获得高量表达，需要将其克隆
入酿酒酵母中，但是若将表达载体导入酵母中表达，
酵母经过若干代繁殖后，质粒容易丢失。所以，下一
步研究是将表达载体上的调控元件和木糖还原酶基
因通过酶切酶连方法连接到整合载体上，通过整合
载体将木糖还原酶基因整合到酵母染色体上，使之
成为酵母染色体 DNA 的一部分，增强其遗传稳定
性，从而使其在酿酒酵母中高效稳定地表达。
参 考 文 献
［1］Walfridsson M，Bao X，Anderlund M，et al． Ethanolic fermentation of
xylose with Saccharomy cescerevisiae harboring the Thermus ther-
mophilus xylA gene which expresses an active xylose(glucose)
isomerase． Appl Environ Microbiol，1996，62:4648-4651．
［2］Tantirungkij M，Nakashima N，Seki Y，et al． Construction of xylose-as-
similating Saccharomy cescerevisiae． Ferment Bioeng，1993，75:83-88．
［3］Kotter P，Ciriacy M． Xylose fermentation by Saccharomy cescerevisi-
ae． Appl Microbiol Biotechnol，1993，38:776-783．
［4］王颖．木糖转化乙醇代谢途径在酿酒酵母工业菌株中的建立
［D］．济南:山东大学，2004．
［5］陈叶福，王正样，方慧英，等．木糖发酵酵母 Pichia stipitis木糖还
原酶基因 XYL1 在酿酒酵母中的表达． 食品与发酵工业，2003，
29:14-17．
［6］Takuma S，Nakashima N，Tantirungkij M，et al． Isolation of a xylose
reductase gene of Pichia stipitis and its expression in Saccharomy ces-
cerevisiae． Appl Biochem Biotechnol，1991，28-29:327-340．
［7］Amore R，Kotter P，Kuester C，et al． Cloning and expression in Sac-
charomy cescerevisiae of the NADPH-dependent xylose reductase en-
coding gene XYL1 from the xylose-assimilating yeast Pichia stipitis．
Gene，1991，109:89-98．
［8］Kotter P，Amore R，Hollenberg CP，et al M． Isolation and character-
ization of the Pichia stipitis xylitol dehydrogenase gene XYL2 and
construction of a xylose-utilizing Saccharomy cescerevisiae． Proc Natl
Acad Sci USA，1990，84:2585-2589．
［9］Rizzi M，Harwart K，Erleman P，et al． Purification and properties of
the NAD + -dependent xylitol dehydrogenase from yeast Pichia stipi-
itis． Ferment Bioeng，1989，67:20-24．
［10］Eliasson A，Christensson C，Wahlbom CF． et al． Anaerobic xylose
fermentation by recombinant Saeeharomyees cerevisiae carrying XY-
Ll，XYL2，and XKSl in mineral medium chemostat cultures． Ap-
plied and Environmental Microbiology，2000，66:3381-3386．
［11］Karhumaa K，Hahn-Hagerdal B，Gorwa-Grauslund MF． Investigation
of limiting metabolic steps in the utilization of xylose by recombi-
nant Saccharomyces cerevisiae using metabolic engineering． Yeast，
2005，22:359-368．
［12］Karhumaa K，Fromanger R，Hahn-Hagerdal B，et al． High activity of
xylose reductase and xylitol dehydrogenase improves xylose fermen-
tation by recombinant Sacchromyces cerevisae． Appl Microbial Bio-
technol，2007，73:1039-1046．
［13］ Jeffries TW，Grigoriev IV，Grimwood J，et al． Genome sequence of
the lignocellulose-bioconverting and xylose-fermenting yeast Pichia
stipitis． Nature Biotechnology，2007，25:319-326．
［14］Walfridsson M，Hallbom J，Penttilla M，et al． Xylose-metaboliz-
ing Saccharomy cescerevisiae strains overexpressing the TKLI and
TALI genes encoding the pentose phosphate pathway enzymes
transketolase and transaldolase． Appl Environ Microbiol，1995，
61:4184-4190 ．
［15］Bradford MM． Photometric methods for protein determination． Anal
Biochem，1976，72:248-254．
(责任编辑 李楠)
571