全 文 ：第 １３卷第 １期
２０１５年 １月
生　 物　 加　 工　 过　 程
Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｐｒｏｃｅｓｓ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ
Ｖｏｌ􀆰 １３ Ｎｏ􀆰 １
Ｊａｎ􀆰 ２０１５
ｄｏｉ：１０􀆰 ３９６９ ／ ｊ􀆰 ｉｓｓｎ􀆰 １６７２－３６７８􀆰 ２０１５􀆰 ０１􀆰 ０１３
收稿日期：２０１３－０６－０９
基金项目：教育部新世纪优秀人才支持计划（ＮＣＥＴ １０ ０４５６）；江苏省杰出青年基金（ＢＫ２０１２００２）；中组部首批青年拔尖人才支持计划
作者简介：刘　 婷（１９８８—），女，江苏淮安人，硕士研究生，研究方向：工业微生物；史仲平（联系人），教授，Ｅ⁃ｍａｉｌ：ｚｐｓｈｉ＠ ｊｉａｎｇｎａｎ．ｅｄｕ．ｃｎ
基于基因组序列的树干毕赤酵母生理特性解析
刘　 婷１，２，刘立明１，史仲平２
（１􀆰 江南大学 食品科学与技术国家重点实验室，江苏 无锡 ２１４１２２；
２􀆰 江南大学 工业生物技术教育部重点实验室，江苏 无锡 ２１４１２２）
摘　 要：树干毕赤酵母作为一种潜在的纤维素乙醇生产菌株，有其独特的生理优势。 然而与酿酒酵母生产乙醇相
比，树干毕赤酵母生产纤维素乙醇还存在着诸多阻碍。 为了从细胞整体水平进一步解析树干毕赤酵母的生理代谢
特征，基于树干毕赤酵母的全基因组序列，利用生物信息学的分析算法，分别解析了树干毕赤酵母与酿酒酵母代谢
网络的异同；利用流量平衡分析（ＦＢＡ）验证了 Ｃ源生长表型；预测了 １５８个生长必需反应；鉴定了 ３６４个转录因子
并对重要调控蛋白的功能进行了分析。
关键词：树干毕赤酵母；基因组序列；生理特性；流量平衡分析
中图分类号：Ｑ７８　 　 　 　 文献标志码：Ａ　 　 　 　 文章编号：１６７２－３６７８（２０１５）０１－００７５－０７
Ｍｅｔａｂｏｌｉｃ ｔｒａｉｔ ｏｆ Ｓｃｈｅｆｆｅｒｓｏｍｙｃｅｓ ｓｔｉｐｉｔｉｓ ｂａｓｅｄ ｏｎ ｇｅｎｏｍｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ
ＬＩＵ Ｔｉｎｇ１，２，ＬＩＵ Ｌｉｍｉｎｇ１，ＳＨＩ Ｚｈｏｎｇｐｉｎｇ２
（１􀆰 Ｓｔａｔｅ Ｋｅｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｏｆ Ｆｏｏｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｊｉａｎｇｎａｎ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｗｕｘｉ ２１４１２２，Ｃｈｉｎａ；
２􀆰 Ｔｈｅ Ｋｅｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｏｆ Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｍｉｎｉｓｔｒｙ ｏｆ Ｅｄｕｃａｔｉｏｎ，Ｊｉａｎｇｎａｎ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｗｕｘｉ ２１４１２２，Ｃｈｉｎａ）
Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ａｓ ａ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｃｅｌｌｕｌｏｓｉｃ ｅｔｈａｎｏｌ ｐｒｏｄｕｃｅｒ， Ｓｃｈｅｆｆｅｒｓｏｍｙｃｅｓ ｓｔｉｐｉｔｉｓ ｈａｓ ｉｔｓ ｕｎｉｑｕｅ ｍｅｔａｂｏｌｉｃ
ｔｒａｉｔｓ． Ｈｏｗｅｖｅｒ， ｐｒｏｂｌｅｍｓ ｎｅｅｄ ｔｏ ｂｅ ｓｏｌｖｅｄ ｆｏｒ Ｓｃｈｅｆｆｅｒｓｏｍｙｃｅｓ ｓｔｉｐｉｔｉｓ ｃｅｌｌｕｌｏｓｉｃ ｅｔｈａｎｏｌ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ
ｃｏｍｐａｒｅｄ ｗｉｔｈ Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ｅｔｈａｎｏｌ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ． Ｂａｓｅｄ ｏｎ ｔｈｅ ｇｅｎｏｍｅ ｄａｔａ ｏｆ Ｓｃｈｅｆｆｅｒｓｏｍｙｃｅｓ
ｓｔｉｐｉｔｉｓ， ｗｅ ｄｉｄ ａ ｆｕｒｔｈｅｒ ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃａｌ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｔｈｅ ｍｅｔａｂｏｌｉｃ ｔｒａｉｔｓ ｏｆ Ｓｃｈｅｆｆｅｒｓｏｍｙｃｅｓ ｓｔｉｐｉｔｉｓ ｗａｓ ｂｙ
ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃ ａｌｇｏｒｉｔｈｍ． Ｇｅｎｏｍｅ⁃ｓｃａｌｅ ｍｅｔａｂｏｌｉｃ ｍｏｄｅｌ （ ＧＳＭＭ） ｓｉｍｉｌａｒｉｔｙ ａｎｄ ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ ｂｅｔｗｅｅｎ
Ｓｃｈｅｆｆｅｒｓｏｍｙｃｅｓ ｓｔｉｐｉｔｉｓ ａｎｄ Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ｗａｓ ｃｏｍｐａｒｅｄ． Ｃｅｌｌ ｇｒｏｗｔｈ ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ ｏｎ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ
ｃａｒｂｏｎ ｓｏｕｒｃｅｓ ｗａｓ ｖａｌｉｄａｔｅｄ ｗｉｔｈ ｆｌｕｘ ｂａｌａｎｃｅ ａｎａｌｙｓｉｓ． Ｆｕｒｔｈｅｒｍｏｒｅ， １５８ ｇｒｏｗｔｈ ｅｓｓｅｎｔｉａｌ ｒｅａｃｔｉｏｎｓ ｗｅｒｅ
ｐｒｅｄｉｃｔｅｄ ｏｎ ｇｌｕｃｏｓｅ ｍｉｎｉｍａｌ ｍｅｄｉｕｍ． Ｆｉｎａｌｌｙ， ３６４ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒｓ ｗｅｒｅ ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄ ａｎｄ ｔｈｅ ｆｕｎｃｔｉｏｎ
ｏｆ ｉｍｐｏｒｔａｎｔ ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｗｅｒｅ ｄｉｓｃｕｓｓｅｄ．
Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：Ｓｃｈｅｆｆｅｒｓｏｍｙｃｅｓ ｓｔｉｐｉｔｉｓ；ｇｅｎｏｍｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ；ｍｅｔａｂｏｌｉｃ ｔｒａｉｔ；ｆｌｕｘ ｂａｌａｎｃｅ ａｎａｌｙｓｉｓ
　 　 传统的酿酒酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ） 由于
具有较高的乙醇产率、成熟的分子改造手段等一系列
优点而成为乙醇工业化生产的最佳模式微生物［１］。
乙醇生产的另一种优势菌株是运动发酵单胞菌
（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ ｍｏｂｉｌｉｓ），其最高乙醇得率可达理论得率
的 ９７％，且对乙醇的耐受性高达 １２０ ｇ ／ Ｌ［２］。 但对于
纤维素乙醇的生产，上述 ２种微生物均存在的一个难
以克服的缺陷，即不能天然发酵戊糖（半纤维素的主
要成分）。 尽管大量代谢工程改造工作以尝试导入木
糖代谢途径，但是效果却不够理想［３］。
树干毕赤酵母 （ Ｓｃｈｅｆｆｅｒｓｏｍｙｃｅｓ ｓｔｉｐｉｔｉｓ），又名
Ｐｉｃｈｉａ ｓｔｉｐｉｔｉｓ［４］，是一种单倍体同宗配合的半子囊酵
母，最早从腐木和寄生于林木的甲虫幼虫中分离得
到［５］。 树干毕赤酵母因其广泛的 Ｃ 源代谢能力而
成为纤维素乙醇的潜在生产菌，在细胞中广泛存在
的糖类分解酶系使得树干毕赤酵母能够代谢各种
糖类分子。 在所有从自然界中筛选出的木糖乙醇
生产菌株中，树干毕赤酵母的代谢优势也十分显
著：①木糖发酵能力强。 单独发酵木糖生产乙醇的
产率高达 ５７ ｇ ／ Ｌ［７］，得率达 ０􀆰 ４７ ｇ ／ ｇ［８］；②代谢副产
物少。 控制溶氧在一定水平内几乎检测不到木糖
醇、甘油、乙酸等代谢物；③营养物质的需求简单。
在无维生素的培养基中也能正常发酵；④对杂质的
抵抗能力强；⑤能够代谢木质纤维素降解物中的毒
性物质［６］。
与现今较为成熟的酿酒酵母乙醇发酵技术相比，
树干毕赤酵母生产纤维素乙醇还存在着诸多阻碍：
①与酿酒酵母的无氧发酵（ｃｒａｂｔｒｅｅ⁃ｐｏｓｉｔｉｖｅ）生产乙
醇的代谢方式不同，树干毕赤酵母在溶氧充足的条件
下不能合成乙醇，只有控制溶氧在较低的水平（＜１
ｍｍｏｌ ／ （Ｌ·ｈ））此菌株才能高效的生产乙醇［９］，对溶氧
精确的要求为工业化生产控制带来了难度；②树干毕
赤酵母的底物发酵速率过低，以葡萄糖为例，酿酒酵
母发酵速率达 １􀆰 ７８ ｇ ／ （ｇ·ｈ），而树干毕赤酵母葡萄糖
发酵速率仅有 ０􀆰 ３９ ｇ ／ （ｇ·ｈ） ［１０］，木糖的发酵速率则
更低，仅为 ０􀆰 ２３ ｇ ／ （ｇ·ｈ） ［１１］，过低的糖耗速率延长了
发酵周期，提高了生产成本，不利于工业化生产；③与
酿酒酵母相比，此菌株的遗传和生化背景不够清晰，
代谢改造的成功率低。 上述这些瓶颈问题需要一个
系统水平的平台加以理解和解决，而微生物基因组规
模代谢网络模型 （ ｇｅｎｏｍｅ⁃ｓｃａｌｅ ｍｅｔａｂｏｌｉｃ ｍｏｄｅｌ，
ＧＳＭＭ）提供了这样一个契机。
ＧＳＭＭ的一般研究思路是根据公布的测序结
果进行基因组注释，建立详细的生化反应列表后
转换为计算机可读的语言格式，再运用各种模拟
算法对模型进行模拟预测和验证。 自 １９９９ 年流
感嗜血杆菌的 ＧＳＭＭ 构建完成至今，相关研究工
作广泛地在原核、真核微生物甚至人类基因组中
开展，由此获得的数百个 ＧＳＭＭ 在生物、医药、食
品等行业的基础研究方面产生良好效果［１２］ 。 基于
约束的分析算法（ ｃｏｎｓｔａｉｎｔ⁃ｂａｓｅｄ ｍｏｄｅｌｉｎｇ，ＣＢＭ）
为 ＧＳＭＭ提供了一个模拟平台，最大限度地了解
微生物细胞的生理和代谢功能；通过流量平衡分
析（ ＦＢＡ）、不同底物生长表型分析、基因敲除分
析、流量可变分析、系统鲁棒性分析等不同的模拟
算法，对细胞的表型进行量化预测［１３］ 。 笔者在前
期研究中通过对树干毕赤酵母基因组注释并结合
生物化学数据库和文献信息建立了以基因 蛋白
质（酶） 生化反应关联为核心的基因组规模代谢
网络模型 ｉＴＬ８８５［１５］ 。 该模型从糖类转运、Ｃ 源代
谢途径注释、溶氧角度阐述乙醇生成的影响因素，
并提出了潜在的基因敲除靶点提高乙醇的生成速
率。 本文借助于树干毕赤酵母的基因组信息，利
用生物信息学的分析算法，在细胞整体水平上进
一步解析树干毕赤酵母的代谢特征。
１　 材料与方法
１􀆰 １　 基于 ＣＯＢＲＡ工具箱的分析算法
从 Ｉｎ Ｓｉｌｉｃｏ Ｏｒｇａｎｉｓｍｓ 数 据 库 （ ｈｔｔｐ： ／ ／
ｇｃｒｇ􀆰 ｕｃｓｄ􀆰 ｅｄｕ ／ ＩｎＳｉｌｉｃｏＯｒｇａｎｉｓｍｓ ／ ＯｔｈｅｒＯｒｇａｎｉｓｍｓ）中
下载最近发表（截至 ２０１３年 ６月 １０日）的树干毕赤
酵母基因组规模代谢网络模型 ｉＴＬ８８５。 在 Ｍａｔｌａｂ
平台上利用 ＣＯＢＲＡ （ｃｏｎｓｔｒａｉｎｔ⁃ｂａｓｅｄ ｒｅｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ
ａｎｄ ａｎａｌｙｓｉｓ） ［１６］进行模拟分析。 作为目前应用最广
泛的代谢网络模型分析手段，ＣＯＢＲＡ工具箱包含很
多常用的分析算法。 如流量平衡分析（ ｆｌｕｘ ｂａｌａｎｃｅ
ａｎａｌｙｓｉｓ，ＦＢＡ）主要用于预测细胞最大比生长速率
和产物合成速率，而 ｏｐｔｉｍｉｚｅＣｂＭｏｄｅｌ 是 ＣＯＢＲＡ 工
具箱中最常用的 ＦＢＡ 算法。 生长必需反应是指对
细胞生长必需的、敲除则导致细胞不能存活的代谢
反应，是一定生长条件下合成细胞组分所必需的反
应集。 生 长 必 需 反 应 的 预 测 原 理 是 运 用
ｓｉｎｇｌｅＲｘｎＤｅｌｅｔｉｏｎ依次限制通过每个反应的流量为
０，考察此时细胞最大比生长速率的变化。 如果反应
敲除后的比生长速率小于原菌的 １􀆰 ０×１０－６，则被敲
除的反应是必需反应，否则为非必需反应。
１􀆰 ２　 模拟条件选择与设定
对细胞生长表型的模拟需要预先设定模拟条
件。 模拟条件是实际生物学实验中细胞的培养环
境。 参考酿酒酵母等真核微生物的模拟条件，设置
树干毕赤酵母模拟的基本培养基组分，包含基本营
养元素（ＮＨ＋４、ＳＯ２
－
４ 、ＰＯ３
－
４ 、Ｎａ
＋、Ｋ＋和 Ｆｅ２＋ ）、Ｃ 源和
Ｏ２。 其中，对基本营养元素的供给没有限制，即对
它们的交换反应的上下界分别设置为 － １ ０００ 和
１ ０００ ｍｍｏｌ ／ （ｇ·ｈ），而对 Ｃ源和 Ｏ２则依据不同的培
养条件需要限制它们所对应的不同的吸收速率。
６７ 生　 物　 加　 工　 过　 程　 　 第 １３卷　
１􀆰 ３　 转录因子（ＴＦ）的鉴定
①真菌转录因子数据库 （ Ｆｕｎｇａｌ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ
Ｆａｃｔｏｒｓ Ｄａｔａｂａｓｅ， ＦＴＦＤ， ｈｔｔｐ： ／ ／ ｆｔｆｄ􀆰 ｓｎｕ􀆰 ａｃ􀆰 ｋｒ ／
ｉｎｄｅｘ􀆰 ｐｈｐ？ ａ＝ｖｉｅｗ）运用标准的注释程序注释真菌
基因组中的转录因子（ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒｓ，ＴＦｓ） ［１７］，
该数据库已收录 １７１ 种真菌的 ６６ ３９２ 个假定转录
因子 （截至 ２０１３ 年 ６ 月 １０ 日）。 在 ＦＴＦＤ 中以
Ｐｉｃｈｉａ ｓｔｉｐｉｔｉｓ 为关键词检索并下载所有的转录因
子，整理包括在 ＦＴＦＤ 数据中的名称（ＦＴＦＤ ｎａｍｅ）、
所属 ＴＦ 家族名称（ＴＦ Ｆａｍｉｌｙ ｎａｍｅ）、基因座位名
（Ｌｏｃｕｓ ｎａｍｅ）、序列长度 （ Ｌｅｎｇｔｈ ） 和蛋白名称
（Ｐｒｏｔｅｉｎ ｎａｍｅ）等信息。 这些转录因子只是基于生物
信息学算法的预测，准确性还有待验证。 ②在公布树
干毕赤酵母测序结果的数据库（ＤＯＥ Ｊｏｉｎｔ Ｇｅｎｏｍｅ
Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）树干毕赤酵母主页 （ ｈｔｔｐ： ／ ／ ｇｅｎｏｍｅ􀆰 ｊｇｉ⁃
ｐｓｆ􀆰 ｏｒｇ ／ Ｐｉｃｓｔ３ ／ Ｐｉｃｓｔ３􀆰 ｈｏｍｅ􀆰 ｈｔｍｌ）中根据 ＧＯ分类，查
找 ＧＯ为 ０００３７００ 的 ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ ａｃｔｉｖｉｔｙ，获得
１３９个比对的潜在转录因子。 ③为获取更加可靠的
转录因子信息，运用本地 ＢＬＡＳＴ 对树干毕赤酵母全
基因组进行比对（图 １）。 酿酒酵母专门的转录因子
数 据 库 ｙｅａｓｔｒａｃｔ （ ｈｔｔｐ： ／ ／ ｗｗｗ􀆰 ｙｅａｓｔｒａｃｔ􀆰 ｃｏｍ ／
ｉｎｄｅｘ􀆰 ｐｈｐ） 收录了酿酒酵母 １１２ 个经过验证的 ＴＦｓ
及其调控的靶基因。 下载该网站上所有酿酒酵母的
转录因子，将该转录因子输入到 Ｕｎｉｐｒｏｔ 中通过 ＩＤ
Ｍａｐｐｉｎｇ 将转录因子名称转化为 Ｕｎｉｐｒｏｔ ＩＤ，再通过
Ｒｅｔｒｉｅｖｅ下载相应 ｆａｓｔａ 格式的蛋白质序列。 将该序
列与树干毕赤酵母的基因组蛋白质序列进行双向比
对 （ＢＬＡＳＴｐ），比对结果的筛选条件设置为氨基酸序
列相似度＞３５％和期望值（Ｅ值）＜１０－１０。
图 １　 树干毕赤酵母转录因子预测的流程
Ｆｉｇ􀆰 １　 Ｆｌｏｗ ｃｈａｒｔ ｏｆ ｔｈｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｆａｃｔｏｒｓ
ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ ｉｎ Ｓ􀆰 ｓｔｉｐｉｔｉｓ
２　 结果与讨论
２􀆰 １　 代谢网络特征分析
树干毕赤酵母基因组规模代谢网络模型
ｉＴＬ８８５ 由 ８８５ 个代谢基因、１ ２４０ 个反应和 ８７０ 个
代谢物构成［１５］（表 １）。 ｉＴＬ８８５ 完整的内容已上传
于 Ｉｎ Ｓｉｌｉｃｏ Ｏｒｇａｎｉｓｍｓ 数据库。 由表 １ 可知：选定
酿酒酵母基因组规模代谢网络模型 ｉＭＭ９０４，比较
２ 个模型注释出的基因总数目，发现 ｉＴＬ８８５ 的开
放阅读框（ＯＲＦｓ）覆盖率是 １５􀆰 ２％，高于 ｉＭＭ９０４
（１３􀆰 ７％），证实了 ｉＴＬ８８５ 采用的整合基因组注释
方法的全面性。 由于酿酒酵母是一种典型的模式
菌株，相关研究较为透彻，故 ｉＭＭ９０４ 包含的基因、
反应、代谢物数目均大于 ｉＴＬ８８５（表 １）。 ｉＴＬ８８５
中约 ９２％的代谢反应有基因关联，在 ７６０ 个有基
因关联的反应中，１１８ 个代谢反应由多酶复合体构
成的蛋白质催化，１９２ 个反应由同工酶催化，其余
的 ４５０ 个反应由单个基因催化。 不同于 ｉＭＭ９０４
中的 ８ 个细胞分区， ｉＴＬ８８５ 中的 ８７０ 个代谢物仅
分布于细胞质（５５２ 个）、线粒体（１４８ 个）和细胞
外（１７０ 个）３ 个区间，其中 ２８１ 个代谢物存在于不
同的细胞区间。
表 １　 树干毕赤酵母和酿酒酵母模型比较
Ｔａｂｌｅ １　 Ｍｏｄｅｌ ｃｏｎｔｅｎｔｓ ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｏｆ Ｓ􀆰 ｓｔｉｐｉｔｉｓ ｉＴＬ８８５
ａｎｄ Ｓ􀆰 ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ｉＭＭ９０４
模型参数 Ｓ􀆰 ｓｔｉｐｉｔｉｓ（ ｉＴＬ８８５） ［１５］
Ｓ􀆰 ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ
（ ｉＭＭ９０４） ［１８］
基因组大小 ／ Ｍｂ １５􀆰 ４ １２􀆰 １
总 ＯＲＦｓ 数 ５ ８４１ ６ ６０７
基因覆盖率 ／ ％ １５􀆰 ２ １３􀆰 ７
总反应数 １ ２４０ １ ５７７
细胞内部反应数 ８３２ １ ０１８
转运反应数 ２５０ ３９５
交换反应数 １５８ １６４
总代谢物数 ８７０ １ ２２８
唯一代谢物数 ５８９ ７１３
模型分区 ３（ｃ，ｅ，ｍ） ８（ｃ，ｅ，ｍ，ｘ，ｎ，ｒ，ｖ，ｇ）
２􀆰 ２　 树干毕赤酵母对 Ｃ源的利用分析
通过 ＦＢＡ模拟了树干毕赤酵母在 ２７种 Ｃ源（１５
种糖类、９种醇类和 ３ 种酸）上的细胞生长表型。 定
性分析发现模拟结果和实际 Ｃ源利用情况完全一致
性（表 ２）。 由表 ２ 可知：其中 ２０ 种能够支持树干毕
赤酵母生物量中所有前体物质的生成，证实了树干毕
７７　 第 １期 刘　 婷等：基于基因组序列的树干毕赤酵母生理特性解析
表 ２　 树干毕赤酵母对不同 Ｃ源底物的利用
Ｔａｂｌｅ ２　 Ｕｔｉｌｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｓｕｂｓｔｒａｔｅｓ ｂｙ Ｓ􀆰 ｓｔｉｐｉｔｉｓ
Ｃ源底物 ｉｎ ｓｉｌｉｃｏ 模拟结果 ｉｎ ｖｉｖｏ 细胞生长∗
葡萄糖 生长 生长
半乳糖 生长 生长
蔗糖 生长 生长
麦芽糖 生长 生长
纤维二糖 生长 生长
海藻糖 生长 生长
乳糖 生长 生长
果糖 生长 生长
木糖 生长 生长
阿拉伯糖 生长 生长
棉子糖 不生长 不生长
核糖 生长 生长
蜜二糖 不生长 不生长
鼠李糖 生长 生长
山梨糖 不生长 不生长
乙醇 生长 生长
甘油 生长 生长
甲醇 不生长 不生长
赤藻糖醇 生长 生长
木糖醇 生长 生长
核糖醇 生长 生长
肌醇 不生长 不生长
甘露醇 生长 生长
半乳糖醇 不生长 不生长
琥珀酸 生长 生长
柠檬酸 生长 生长
乳酸 不生长 不生长
　 注： ∗Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｙｅａｓｔ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ 数 据 库 （ ｈｔｔｐ： ／ ／
ｗｗｗ􀆰 ｎｃｙｃ􀆰 ｃｏ􀆰 ｕｋ ／ ｓｅａｒｃｈ􀆰 ｈｔｍｌ）中报道的底物利用情况。
赤酵母广泛的 Ｃ源代谢能力。 有 ７种（棉子糖、山梨
糖、蜜二糖、半乳糖醇、肌醇、甲醇和乳酸）不能支持生
长，说明相关底物在树干毕赤酵母细胞中缺乏后续的
代谢反应，致使生物量组分不能全部合成。 上述模拟
结果与数据中报道的树干毕赤酵母细胞在不同底物
中的实际生长情况相一致。
选取 ３ 种典型 Ｃ 源（葡萄糖、木糖和鼠李糖），
利用 ｉＴＬ８８５ 定量预测树干毕赤酵母的生长表型。
由于缺乏准确的糖耗速率，在进行模拟时设定糖耗
为相同的碳原子数。 ＦＢＡ 预测的细胞生长和产物
合成见表 ３。 由表 ３可知：无论限制 Ｏ２的吸收与否，
细胞生长速率由大到小顺序为葡萄糖、木糖、鼠李
糖，即葡萄糖为菌株生长最佳 Ｃ源。 当不限制 Ｏ２的
吸收速率时，树干毕赤酵母表现为完全的呼吸代
谢，３ 种 Ｃ 源的代谢产物中除生物量和 ＣＯ２外均没
有其他代谢副产物，生物量生成速率快。 当限制 Ｏ２
的吸收速率为 ４ ｍｍｏｌ ／ （ｇ·ｈ）（以细胞干质量计）时，
利用葡萄糖和木糖为 Ｃ 源可合成产物乙醇，且在模
拟条 件 下 木 糖 生 成 乙 醇 的 速 率 （ ０􀆰 ２５４ ８
ｍｍｏｌ ／ （ｇ·ｈ））比葡萄糖（０􀆰 １３９ ０ ｍｍｏｌ ／ （ ｇ·ｈ））更
快，而鼠李糖则不能生成乙醇，是不可发酵 Ｃ 源，这
与文献［１９］的研究结果一致。
２􀆰 ３　 树干毕赤酵母生长必需反应分析
基于 ｉＴＬ８８５预测在以葡萄糖为 Ｃ 源的基本培
养基上树干毕赤酵母共有 １５８ 个生长必需反应，占
模型代谢反应总数的 １４􀆰 ６％，此数值与报道的相同
条件下酿酒酵母必需反应比例（１３％）较接近［２０］。
树干毕赤酵母中，必需反应在 ６ 亚系统中分布情况
见图 ２。 由图 ２ 可知：氨基酸代谢（６２ 个）、核苷酸
代谢（２２ 个）、脂质代谢（２７ 个）、碳水化合物代谢
（２７个）、转运代谢（１９ 个）辅因子和维生素代谢（１
个）。 其中氨基酸代谢占有的生长必需反应占必需
　 　 　 　 　
表 ３　 在葡萄糖、木糖和鼠李糖 ３种培养基上细胞生长表型
Ｔａｂｌｅ ３　 Ｐｒｅｄｉｃｔｅｄ ｇｒｏｗｔｈ ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ ｏｆ Ｓ􀆰 ｓｔｉｐｉｔｉｓ ｉｎ ｇｌｕｃｏｓｅ，ｘｙｌｏｓｅ ａｎｄ ｒｈａｍｎｏｓｅ
模拟条件 Ｃ源吸收速率（ｍｍｏｌ·ｇ－１·ｈ－１）
Ｏ２吸收速率 ／
（ｍｍｏｌ·ｇ－１·ｈ－１）
生物量生成速率 ／
ｈ－１
乙醇生成速率 ／
（ｍｍｏｌ·ｇ－１·ｈ－１）
葡萄糖不限氧 １ ０􀆰 ０４４ ７９ ０
葡萄糖限氧 １ ４ ０􀆰 ０４１ ２５ ０􀆰 １３９ ０
木糖不限氧 １􀆰 ２ ０􀆰 ０３８ ６８ ０
木糖限氧 １􀆰 ２ ４ ０􀆰 ０３２ ２０ ０􀆰 ２５４ ８
鼠李糖不限氧 １ ０􀆰 ０２６ ０１ ０
鼠李糖限氧 １ ４ ０􀆰 ０１０ ２７ ０
８７ 生　 物　 加　 工　 过　 程　 　 第 １３卷　
图 ２　 树干毕赤酵母（ａ）和酿酒酵母（ｂ）在葡萄糖基本培养基上细胞生长必需反应分析
Ｆｉｇ􀆰 ２　 Ｐｅｒｃｅｎｔａｇｅ ｏｆ ｅｓｓｅｎｔｉａｌ ｒｅａｃｔｉｏｎｓ ｉｎ ｅａｃｈ ｓｕｂｓｙｓｔｅｍｓ ｏｎ ｇｌｕｃｏｓｅ ｍｉｎｉｍａｌ ｍｅｄｉｕｍ
ｆｏｒ （ａ） Ｓ􀆰 ｓｔｉｐｉｔｉｓ ａｎｄ （ｂ） Ｓ􀆰 ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ
反应总数的 ４０％，它与 Ｃ 源核心代谢途径关联紧
密，因而是最具刚性的代谢亚系统。 树干毕赤酵母
碳水化合物代谢所占生长必需反应的比例（１４％）
比酿酒酵母酿酒酵母比例（１７％）小，表明 ２ 株菌在
代谢特征上的差异，树干毕赤酵母比酿酒酵母拥有
更广泛和活跃的代谢能力，存在较多相连通的支路
途径，故对生长必需的反应数目较少。
图 ３　 ＢＬＡＳＴ、ＧＯ、ＦＴＦＤ预测的转录因子及
转录因子家族数目
Ｆｉｇ􀆰 ３　 Ｎｕｍｂｅｒ ｏｆ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒｓ ａｎｄ
ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒｓ ｆａｍｉｌｉｅｓ ｏｂｔａｉｎｅｄ
ｆｒｏｍ ＢＬＡＳＴ，ＧＯ，ａｎｄ ＦＴＦＤ
２􀆰 ４　 转录因子的鉴定与功能分析
为获取最全面的树干毕赤酵母的转录因子信息、
基于在线数据库和本地 ＢＬＡＳＴ ３处数据来源对树干
毕赤酵母的转录因子进行了预测（图 ３）。 由图 ３ 可
知：在 ＦＴＦＤ中检索获得 ３５０个转录因子，约占基因组
大小 ６％，分布在 ３９个转录因子家族。 同时在 ＪＧＩ树
干毕赤酵母主页中根据 ＧＯ 信息查找获得 １３９ 个转
录因子。 对二者的比较发现，ＧＯ获取的转录因子有
６个不存在于 ＦＴＦＤ中。 运用 ＢＬＡＳＴｐ蛋白质序列双
向比对，获得分布于 １６个转录因子家族的 ８７个转录
因子，比较发现有 ８个是 ＦＴＦＤ未包括在内的。 综合
上述 ３种来源的转录因子，共计获得 ３６４个树干毕赤
酵母转录因子，这为后续相关研究提供了备选转录因
子库。 不同来源获取的转录因子的可信度大小依次
为 ＢＬＡＳＴ、ＧＯ、ＦＴＦＤ。 上述转录因子中还存在诸多
功能未知的假定蛋白（ｐｕｔａｔｉｖｅ ｐｒｏｔｅｉｎｓ），因此对每个
转录因子的准确功能和众多功能不明确的假定蛋白
还需要生物学实验的验证。
图 ４　 预测的转录因子数目及其家族分类
Ｆｉｇ􀆰 ４　 Ｐｒｅｄｉｃｔｅｄ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒｓ ｉｎ ｓｏｍｅ
ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒｓ ｆａｍｉｌｉｅｓ
上述方法获得的是所有可能存在于树干毕赤酵
母中的转录因子，共分布于 ３９个转录因子家族 （ＴＦ
Ｆａｍｉｌｙ），分布范围广。 统计发现其中有 ６ 个转录因
子家族包含的转录因子数目≥１０ 个（图 ４）。 由图 ４
可知：锌簇转录因子（ｚｉｎｃ ｆｉｎｇｅｒ）数目最多，共有 １０
种类型构成的 １５６ 个转录因子。 排在其次的依次是
ＯＢ折叠的核酸结合位点（ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ⁃ｂｉｎｄｉｎｇ，ＯＢ⁃
ｆｏｌｄ）转录因子家族（４２ 个）、同源域（ｈｏｍｅｏｄｏｍａｉｎ⁃
９７　 第 １期 刘　 婷等：基于基因组序列的树干毕赤酵母生理特性解析
ｌｉｋｅ，３０个）、翼状螺旋的 ＤＮＡ 结合结构域（ｗｉｎｇｅｄ
ｈｅｌｉｘ ｒｅｐｒｅｓｓｏｒ ＤＮＡ⁃ｂｉｎｄｉｎｇ， ２０ 个）、 Ｍｙｂ （ １５ 个）、
ｂＺＩＰ（１０个）这 ５个转录因子家族。
进一步对注释的树干毕赤酵母转录因子与酿
酒酵母相关转录因子的功能进行比较，阐述在树
干毕赤酵母中部分核心转录因子的代谢调控机
制。 按照序列同源相似性由高到低的顺序将不同
转录因子及其调节功能列于表 ４。 由表 ４ 可以发
现：最具保守型的调控蛋白（氨基酸合成转录激活
因子）ＧＣＮ１、ＧＣＮ４ 与酿酒酵母呈现一一对应的关
系；树干毕赤酵母中与葡萄糖浓度感受相关的调
节蛋 白 质 有 ＲＧＴ２、 ＧＲＲ１、 ＳＮＦ１、 ＳＫＳ１、 ＳＮＦ３、
ＭＩＧ２、ＭＩＧ２􀆰 ２ 和 ＮＲＧ１，这些调节蛋白与酿酒酵
母中相对应的蛋白质表现出高度的序列结构相似
性；同样具有高度保守性的有 Ｏ２调节相关的蛋白
质 ＨＡＰ５、ＨＡＰ３ 和 ＨＡＰ２；不具有保守性或者保守
性很低的蛋白质包括 ＭＩＧ１ ／ ＣＲＥＡ、ＡＤＲ１、ＨＡＰ１
和 ＨＡＰ４。
表 ４　 树干毕赤酵母与酿酒酵母同源的调控转录蛋白
Ｔａｂｌｅ ４　 Ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｉｎ Ｓ􀆰 ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ｗｉｔｈ ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｉｎ Ｓ􀆰 ｓｔｉｐｉｔｉｓ
Ｓ􀆰 ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ Ｓ􀆰 ｓｔｉｐｉｔｉｓ 转录因子功能　 　 　 　
ＧＣＮ１ ＧＣＮ１ ＧＣＮ４的转录激活因子
ＨＡＰ５ ＨＡＰ５ ＣＣＡＡＴ结合的转录因子
ＤＡＬ８０ ＧＺＦ３ 多种 Ｎ源降解途径基因的负调节因子
ＳＮＦ１ ＳＮＦ１ ＡＭＰ 激活的丝氨酸和苏氨酸蛋白激酶
ＧＲＲ１ ＧＲＲ１ 参与 Ｃ源代谢抑制效应；葡萄糖依赖的二价阳离子转运；高亲和力葡萄糖转运
ＹＡＰ１ ＹＡＰ１ ／ ＣＡＰ１ 应对氧化压力和氧中毒
ＲＥＢ１ ＲＥＢ１ 参与 ｐｏｌ ＩＩ和 ｐｏｌ Ｉ转录，抑制因子
ＨＡＰ２ ＨＡＰ２ 转录激活因子
ＧＣＮ４ ＧＣＮ４ 氨基酸合成的转录激活因子
ＨＡＰ４ ＨＡＰ４ 细胞色素 ｃ正调节因子
ＭＩＧ１ ＭＩＧ１ 参与葡萄糖抑制的序列特异的 ＤＮＡ 结合蛋白；受 ＳＮＦ１ 激酶和 ＧＬＣ７磷酸酶的调控
ＳＷＩ１４ ＳＷＩ１４ 介导细胞周期依赖的 ＨＯ 的转录
ＳＷＩ１６ ＳＷＩ１６ 与 Ｓｗｉ４ｐ 一起形成 ＳＢＦ因子
ＸＢＰ１ ＸＢＰ１ 压力诱导的抑制因子
ＮＲＧ１ ＮＲＧ１ 葡萄糖抑制效应的转录抑制因子
ＭＳＭ４ ＭＳＭ４ 调节 Ｃ源利用
ＨＡＰ１ ＨＡＰ１􀆰 １，１􀆰 ２，１􀆰 ３ 真菌的转录调控蛋白，与 ＣＹＰ１ ／ ＨＡＰ１ 转录激活因子功能相似
ＨＡＰ３ ＨＡＰ３􀆰 １，３􀆰 ２ ＣＣＡＡＴ结合因子，亚基 Ａ
ＧＡＬ４ ＧＡＬ４，ＬＡＣ９ 激活 ＧＡＬ 基因的 ＤＮＡ结合转录因子
ＭＩＧ２ ＭＩＧ２，ＭＩＧ２􀆰 ２ 葡萄糖抑制效应的转录因子
ＡＤＲ１ ＡＤＲ１􀆰 １，ＺＭＳ１ Ｃ源响应的锌指蛋白
ＧＬＮ３ ＧＬＮ３ 受 Ｎ源抑制效应调控的相关基因的转录激活因子
ＩＮＯ２，ＩＮＯ４ — 磷脂合成基因抑制作用的转录激活因子
ＲＧＴ１ — 调控 ＨＸＴ葡萄糖转运子的葡萄糖响应转录因子
ＧＣＲ１ ／ ＧＣＲ２ — 糖酵解基因的 ＤＮＡ结合二聚体转录激活因子
ＶＩＤ２２ — 参与果糖 １，６ 二磷酸酶的转运和降解的糖基化膜蛋白
　 注：—表示在树干毕赤酵母中没有与酿酒酵母相对应的同源蛋白。
　 　 鉴于酿酒酵母与树干毕赤酵母代谢调节的差
异，部分重要的调节蛋白只存在于酿酒酵母中，而
在树干毕赤酵母中没有相对应的基因。 这些酿酒
酵母独有的调节基因包括 ＩＮＯ２ ／ ＩＮＯ４、ＲＧＴ１、ＶＩＤ２２
０８ 生　 物　 加　 工　 过　 程　 　 第 １３卷　
和 ＧＣＲ１ ／ ＧＣＲ２。 其中，ＩＮＯ２ ／ ＩＮＯ４ 是磷脂代谢的
转录激活因子，与乙醇耐受性相关［２１］；ＲＧＴ１ 诱导葡
萄糖转运蛋白（Ｈｘｔ）表达；ＶＩＤ２２ 参与糖酵解代谢
途径中的果糖 １，６ 二磷酸酶（ＦＢＰ１）的转运和降
解；而 ＧＣＲ１ ／ ＧＣＲ２则能够激活糖酵解相关基因的
表达。 较高的乙醇耐受性和糖酵解流量是酿酒酵
母为适应高糖浓度发酵进化出来的机制。 而树干
毕赤酵母长期生存在低糖浓度环境中，其乙醇耐受
性和糖酵解能力明显不足。
３　 结论
基于作者前期构建的树干毕赤酵母基因组规
模代谢网络模型 ｉＴＬ８８５ 从基因、反应、代谢物 ３ 个
层次对树干毕赤酵母的代谢网络特征进行了分析。
以 ｉＴＬ８８５ 为平台，运用 ＦＢＡ 定性分析了树干毕赤
酵母利用 ２７种不同底物时细胞生长情况，与报道的
细胞生长结果完全一致。 选取木糖、葡萄糖和鼠李
糖 ３种典型 Ｃ 源定量分析细胞生长和乙醇生成能
力，发现细胞生长速率由大到小是葡萄糖、木糖、鼠
李糖，且葡萄糖和木糖能发酵生成乙醇，鼠李糖是
不可发酵 Ｃ 源。 单反应敲除共预测到树干毕赤酵
母有 １５８个生长必需反应，与酿酒酵母在同样条件
下的生长必需反应进行比较，证实了 ２ 株菌在代谢
特征上的相同和差异之处。 基于在线数据库和本
地 ＢＬＡＳＴ，获取分布于 ３９个转录因子家族的 ３６４个
树干毕赤酵母转录因子。 通过与酿酒酵母相关转
录因子的功能进行比较，证实酿酒酵母与树干毕赤
酵母代谢调节的异同。
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ｇｅｎｏｍｅ⁃ｓｃａｌｅ ｍｅｔａｂｏｌｉｃ ｒｅｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎｓ ｕｓｉｎｇ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ［Ｊ］ ．
Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，２００８，２６（６）：６５９⁃６６７．
［１５］ 　 Ｌｉｕ Ｔ， Ｚｏｕ Ｗ， Ｌｉｕ Ｌ， ｅｔ ａｌ． Ａ ｃｏｎｓｔｒａｉｎｔ⁃ｂａｓｅｄ ｍｏｄｅｌ ｏｆ
Ｓｃｈｅｆｆｅｒｓｏｍｙｃｅｓ ｓｔｉｐｉｔｉｓ ｆｏｒ ｉｍｐｒｏｖｅｄ ｅｔｈａｎｏｌ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ［ Ｊ ］ ．
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ｍｅｔａｂｏｌｏｍｉｃ ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔｓ ｔｏ ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｆｌｕｘ ｓｔａｔｅｓ ｉｎ ｙｅａｓｔ［Ｊ］ ．
ＢＭＣ Ｓｙｓｔ Ｂｉｏｌ，２００９，３：３７．
［１９］ 　 Ｄｕ Ｐｒｅｅｚ Ｊ， Ｂｏｓｃｈ Ｍ，Ｐｒｉｏｒ Ｂ． Ｔｈｅ ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｅｘｏｓｅ ａｎｄ
ｐｅｎｔｏｓｅ ｓｕｇａｒｓ ｂｙ Ｃａｎｄｉｄａ ｓｈｅｈａｔａｅ ａｎｄ Ｐｉｃｈｉａ ｓｔｉｐｉｔｉｓ［ Ｊ］ ．Ａｐｐｌ
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［２０］ 　 Ｗｉｄｉａｓｔｕｔｉ Ｈ，Ｋｉｍ Ｊ Ｙ，Ｓｅｌｖａｒａｓｕ Ｓ，ｅｔ ａｌ．Ｇｅｎｏｍｅ⁃ｓｃａｌｅ ｍｏｄｅｌｉｎｇ
ａｎｄ ｉｎ ｓｉｌｉｃｏ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｅｔｈａｎｏｌｏｇｅｎｉｃ ｂａｃｔｅｒｉａ Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ
ｍｏｂｉｌｉｓ［Ｊ］ ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｂｉｏｅｎｇ，２０１１，１０８（３）：６５５⁃６６５．
［２１］ 　 Ａｍｂｒｏｚｉａｋ Ｊ，Ｈｅｎｒｙ Ｓ Ａ． ＩＮＯ２ ａｎｄ ＩＮＯ４ ｇｅｎｅ ｐｒｏｄｕｃｔｓ，ｐｏｓｉｔｉｖｅ
ｒｅｇｕｌａｔｏｒｓ ｏｆ ｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐｉｄ ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｉｎ Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ
ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ，ｆｏｒｍ ａ ｃｏｍｐｌｅｘ ｔｈａｔ ｂｉｎｄｓ ｔｏ ｔｈｅ ＩＮＯ１ ｐｒｏｍｏｔｅｒ［ Ｊ］ ． Ｊ
Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ，１９９４，２６９（２１）：１５３４４⁃１５３４９．
（责任编辑　 荀志金）
１８　 第 １期 刘　 婷等：基于基因组序列的树干毕赤酵母生理特性解析