全 文 ：第 １２卷第 ５期
２０１４年 ９月
生　 物　 加　 工　 过　 程
Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｐｒｏｃｅｓｓ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ
Ｖｏｌ􀆰 １２ Ｎｏ􀆰 ５
Ｓｅｐ􀆰 ２０１４
ｄｏｉ：１０􀆰 ３９６９ ／ ｊ􀆰 ｉｓｓｎ􀆰 １６７２－３６７８􀆰 ２０１４􀆰 ０５􀆰 ００７
收稿日期：２０１３－０４－１５
基金项目：江苏省自然科学基金（ＢＫ２０１１１５３，ＢＫ２０１２３６３）；教育部“新世纪优秀人才支持计划”（ＮＣＥＴ １１ ０６６５）
作者简介：傅　 静（１９８７—），女，江苏宜兴人，硕士研究生，研究方向：工业微生物育种；张 　 梁（联系人），教授，Ｅ⁃ｍａｉｌ：Ｚｈａｎｇｌ＠ ｊｉａｎｇｎａｎ．
ｅｄｕ．ｃｎ
Ｃｒｅ ／ ＬｏｘＰ重组系统的改造及在树干毕赤酵母中的应用
傅　 静１，２，张　 梁１，２，薛　 卫３，石贵阳１，２
（１􀆰 江南大学 工业生物技术教育部重点实验室，无锡 ２１４１２２；
２􀆰 江南大学 粮食发酵工艺与技术国家工程实验室，无锡 ２１４１２２；
３􀆰 南京农业大学 信息科技学院，南京 ２１００９５）
摘　 要：为了实现在 Ｐ􀆰 ｓｔｉｐｉｔｉｓ 中进行无痕基因敲除，以 Ｃｒｅ ／ ＬｏｘＰ 系统为研究对象，首先通过同源重组构建尿嘧啶
营养缺陷型树干毕赤酵母（ｕｒａ３－）；同时通过定点突变 ｐＳＨ４７ Ｈｐｔ质粒的 ｈｐｔ基因和 ｃｒｅ基因，将 ＣＤＳ区 ＣＴＧ突变
为 ＴＴＧ；最后以乙醛脱氢酶基因为靶基因，验证突变后的 Ｃｒｅ ／ ＬｏｘＰ 系统在 Ｐ􀆰 ｓｔｉｐｉｔｉｓ 进行无痕基因敲除的可行性。
结果表明：本文在 Ｐ􀆰 ｓｔｉｐｉｔｉｓ中成功使用潮霉素 Ｂ抗性标记，经过修饰后的 Ｃｒｅ ／ ＬｏｘＰ 敲除系统能够在 Ｐ􀆰 ｓｔｉｐｉｔｉｓ中无
痕敲除目的基因，为后续研究 Ｐ􀆰 ｓｔｉｐｉｔｉｓ功能基因和改造代谢途径提供了一种试验方法和筛选标记。
关键词：树干毕赤酵母；基因敲除；Ｃｒｅ ／ ＬｏｘＰ 重组；潮霉素 Ｂ
中图分类号：Ｑ８１２　 　 　 　 文献标志码：Ａ　 　 　 　 文章编号：１６７２－３６７８（２０１４）０５－００３９－０７
Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｃｒｅ ／ ＬｏｘＰ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ ａｎｄ ｉｔｓ
ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｉｎ Ｐｉｃｈｉａ ｓｔｉｐｉｔｉｓ
ＦＵ Ｊｉｎｇ１，２，ＺＨＡＮＧ Ｌｉａｎｇ１，２，ＸＵＥ Ｗｅｉ３，ＳＨＩ Ｇｕｉｙａｎｇ１，２
（１􀆰 Ｔｈｅ Ｋｅｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｏｆ Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｍｉｎｉｓｔｒｙ ｏｆ Ｅｄｕｃａｔｉｏｎ，Ｊｉａｎｇｎａｎ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｗｕｘｉ ２１４１２２，Ｃｈｉｎａ；
２􀆰 Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｆｏｒ Ｃｅｒｅａｌ Ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｊｉａｎｇｎａｎ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｗｕｘｉ ２１４１２２，Ｃｈｉｎａ；
３􀆰 Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｎａｎｊｉｎｇ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｎａｎｊｉｎｇ ２１００９５，Ｃｈｉｎａ）
Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ ｇｅｎｅｓ ｒｉｃｈ ｉｎ ＣＴＧ ｃｏｕｌｄ ｎｏｔ ｅｘｐｒｅｓｓ ｉｎ Ｐ􀆰 ｓｔｉｐｉｔｉｓ． Ａ ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｃｒｅ ／ ＬｏｘＰ
ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ ｗａｓ ｄｅｖｅｌｏｐｅｄ ｔｏ ｋｎｏｃｋ ｏｕｔ ｔｈｅ ｇｅｎｅｓ ｉｎ Ｐ􀆰 ｓｔｉｐｉｔｉｓ ｗｉｔｈ ｎｏ ｔｒａｃｅ． Ｆｉｒｓｔｌｙ，ｕｒａ３ ｗａｓ
ｄｅｌｅｔｅｄ ｔｏ ｏｂｔａｉｎ ａ ｕｒａｃｉｌ ａｕｘｏｔｒｏｐｈ； Ｓｅｃｏｎｄｌｙ， ＣＴＧ ｃｏｄｏｎｓ ｉｎ ｈｐｔ ａｎｄ ｃｒｅ ｏｆ ｐＳＨ４７⁃Ｈｐｔ ｗｅｒｅ
ｍｕｔａｇｅｎｉｚｅｄ ｔｏ ＴＴＧ； Ｆｉｎａｌｌｙ，ｔｈｅ ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｃｒｅ ／ ＬｏｘＰ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ ｗａｓ ａｐｐｌｉｅｄ ｔｏ ｋｎｏｃｋ ｏｕｔ ｔｈｅ
ｇｅｎｅｓ ｗｉｔｈｏｕｔ ｔｒａｃｅ ｉｎ Ｐ􀆰 ｓｔｉｐｉｔｉｓ ｕｓｉｎｇ ａｃｅｔａｌｄｅｈｙｄｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ ｇｅｎｅ ａｓ ａ ｔａｒｇｅｔ ｇｅｎｅ． Ｉｎ ｔｈｉｓ ｓｔｕｄｙ，
Ｈｙｇｒｏｍｙｃｉｎ Ｂ ｒｅｓｉｓｔａｎｔ ｍａｒｋｅｒ ｗａｓ ｒｅｆｅｒｒｅｄ ｔｏ，ａｎｄ ｔｈｅ ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｃｒｅ ／ ＬｏｘＰ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ ｃｏｕｌｄ
ｋｎｏｃｋ ｏｕｔ ｔｈｅ ｔａｒｇｅｔ ｇｅｎｅ ｗｉｔｈ ｎｏ ｔｒａｃｅ ｉｎ Ｐ􀆰 ｔｓｉｐｉｔｉｓ，ｗｈｉｃｈ ｐｒｏｖｉｄｅｄ ａ ｍｅｔｈｏｄ ａｎｄ ａ ｎｅｗ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ
ｍａｒｋｅｒ ｆｏｒ ｔｈｅ ｆｕｒｔｈｅｒ ｓｔｕｄｙ ｏｆ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｇｅｎｅｓ ａｎｄ ｍｅｔａｂｏｌｉｃ ｐａｔｈｗａｙ ｉｎ Ｐ􀆰 ｓｔｉｐｉｔｉｓ．
Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ：Ｐｉｃｈｉａ ｓｔｉｐｉｔｉｓ； ｇｅｎｅ ｋｎｏｃｋｏｕｔ； Ｃｒｅ ／ ＬｏｘＰ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ； ｈｙｇｒｏｍｙｃｉｎ Ｂ
　 　 树干毕赤酵母（Ｐｉｃｈｉａ ｓｔｉｐｉｔｉｓ）具有将木糖发酵 生成乙醇的能力［１－２］，已经成为研究的热点。 现阶
段相关研究主要集中在树干毕赤酵母木糖发酵乙
醇的发酵条件的优化，提高乙醇产率［３］；利用树干
毕赤酵母的木糖代谢相关基因在酿酒酵母中搭建
木糖代谢途径等方面［３－５］。 利用树干毕赤酵母生长
速度快、底物利用谱宽等优势，通过改造其代谢途
径提高自身乙醇产率，或者以木糖为 Ｃ 源生产重要
生物基产品（如氨基酸、酶等），这使树干毕赤酵母
有可能成为一种新的工业优势酵母。
基因敲除作为一种常用的 ＤＮＡ遗传操作技术，
在微生物代谢工程研究中广泛应用［６］。 酵母中常
用的基因敲除技术有 Ｃｒｅ ／ ＬｏｘＰ 系统、ＦＬＰ ／ ＦＲＴ 系
统和 Ｒ ／ ＲＳ 系统等，其中 Ｃｒｅ ／ ＬｏｘＰ 应用更为普
遍［７］。 Ｃｒｅ ／ ＬｏｘＰ 敲除系统由 Ｃｒｅ 重组酶和含 ＬｏｘＰ
位点的标记基因两部分组成，Ｃｒｅ 重组酶识别同向
排列的 ３４ ｂｐ ＬｏｘＰ 序列，将两个位点之间的序列删
除，留下一个 ＬｏｘＰ 位点，删除标记基因，实现目的基
因的敲除和标记基因的删除，可以重复利用标记
基因［８－１０］。
目前，已发现有七十多种酵母具有基因编码偏
好性，识别密码子 ＣＵＧ 为 Ｓｅｒ，而不是常用的 Ｌｅｕ，
如 Ｄｅｂａｒｙｏｍｙｃｅｓ ｈａｎｓｅｎｉｉ 和 Ｃａｎｄｉｄａ ｇｕｉｌｌｉｅｒｍｏｄｉｉ
等［１０－１２］，在对树干毕赤酵母遗传转化研究过程中也
发现具有该特性［１３］，且该特性限制了富含 ＣＴＧ 的
外源基因在树干毕赤酵母中的表达，对遗传转化的
操作有一定限制作用。 因此，笔者针对这一特性，
构建适合于 Ｐ􀆰 ｓｔｉｐｉｔｉｓ的无痕敲除系统，以乙酸合成
中的关键酶乙醛脱氢酶 ａｌｄ５ 为靶基因，以验证修饰
后的 Ｃｒｅ ／ ＬｏｘＰ 系统在树干毕赤酵母基因敲除中应
用的可行性。
１　 材料与方法
１􀆰 １　 材料
１􀆰 １􀆰 １　 菌株
大肠杆菌 Ｅ􀆰 ｃｏｉｌ ＪＭ１０９、树干毕赤酵母（Ｐｉｃｈｉａ
ｓｔｉｐｉｔｉｓ） ＮＲＲＬ Ｙ ７１２４（ ＣＢＳ５７７３）、质粒 ｐＳＨ４７
Ｈｐｔ，由粮食发酵工艺与技术国家工程实验室保藏；
ｐＭＤ１９ Ｔ ｓｉｍｐｌｅ ｖｅｃｔｏｒ，ＴａＫａＲａ公司。
１􀆰 １􀆰 ２　 培养基
ＬＢ培养基（ｇ ／ Ｌ）：蛋白胨 １０、酵母膏 ５ 、ＮａＣｌ １０。
用于固体培养基时添加 ２０ ｇ ／ Ｌ 琼脂粉；筛选转化子
时添加终质量浓度为 １００ μｇ ／ ｍＬ的氨苄青霉素。
ＹＥＰＤ培养基（ ｇ ／ Ｌ）：蛋白胨 ２０、酵母提取物
１０、葡萄糖 ２０。 用于固体培养基时添加 ２０ ｇ ／ Ｌ琼脂
粉；筛选转化子时添加终质量浓度为 ２５０ μｇ ／ ｍＬ 的
潮霉素 Ｂ。
ＭＤＵ 培养基：无氨基酵母氮源 （ ＹＮＢ） １３􀆰 ４
ｇ ／ Ｌ、葡萄糖 ２０ ｇ ／ Ｌ、尿嘧啶 １００ μｇ ／ ｍＬ、５ 氟乳清
酸（５ ＦＯＡ） １ ｇ ／ Ｌ。 固体培养基添加 ２０ ｇ ／ Ｌ 琼
脂粉。
ＭＤ基本培养基（ ｇ ／ Ｌ）：ＹＮＢ １３􀆰 ４、葡萄糖 ２０。
固体培养基添加 ２０ ｇ ／ Ｌ琼脂粉。
Ｃｒｅ重组酶诱导表达培养基（ｇ ／ Ｌ）：蛋白胨 ２０、
酵母膏 １０、 Ｄ 半乳糖 ２０。 固体培养基添加 ２０ ｇ ／ Ｌ
琼脂粉。
１􀆰 １􀆰 ３　 引物
根据 ＮＣＢＩ 中报道的树干毕赤酵母 ＣＢＳ６０５４ 的
ｕｒａ３ 基因序列，设计上下游同源臂片段引物
ＵＲＡ３ １、ＵＲＡ３ ２、ＵＲＡ３ ３ 和 ＵＲＡ３ ４ 以及
ｌｏｘｐＵＦ、ｌｏｘｐＵＲ；根据乙醛脱氢酶基因 ａｌｄ５ 设计上下
游同源臂片段引物 ＡＬＤ １、ＡＬＤ ２、ＡＬＤ ３ 和
ＡＬＤ ４；根据质粒 ｐＳＨ４７ Ｈｐｔ 中 ｈｐｔ 基因和 ｃｒｅ 基
因中需要突变的碱基序列设计引物。 所有引物见
表 １。
１􀆰 ２　 方法
１􀆰 ２􀆰 １　 酵母基因组提取及 ＰＣＲ扩增
基因组提取及 ＰＣＲ 操作参照文献 ［ １３ － １４］
进行。
１􀆰 ２􀆰 ２　 ｕｒａ３基因同源重组片段的获得及敲除载体
构建
以 Ｐ􀆰 ｓｔｉｐｉｔｉｓ 基因组为模板，用引物 ＵＲＡ３ １ ／
ＵＲＡ３ ２ 和 ＵＲＡ３ ３ ／ ＵＲＡ３ ４ 分别 ＰＣＲ 扩增
ｕｒａ３基因上下游同源片段 ＵＲＡＦ 和 ＵＲＡＲ，用重叠
延伸 ＰＣＲ扩增 ｕｒａ３ 基因同源重组片段 ＵＲＡＦ Ｒ，
ｕｒａ３ ＧｅｎＢａｎｋ登录号 ＮＣ＿００９０４８。
１􀆰 ２􀆰 ３　 尿嘧啶营养缺陷型的构建
将 Ｐ􀆰 ｓｔｉｐｉｔｉｓ ｕｒａ３ 基因同源重组片段 ＵＲＡＦ Ｒ
采用醋酸锂转化法转入 Ｐ􀆰 ｓｔｉｐｉｔｉｓ 感受态细胞中，
涂布选择培养基，３０ ℃培养 ４ ～ ５ ｄ。 挑选长出的
单菌落，用牙签点种于基本培养基，３０ ℃培养４ ～ ５
ｄ，然后选择在 ＭＤＵ 培养基上生长良好而在 ＭＤ
培养基上不能生长的菌株，反复筛选 ３ 轮至性状
稳定，提取基因组用引物 ＵＲＡ３ １ 和 ＵＲＡ３ ４ 进
行 ＰＣＲ 鉴定，筛选出尿嘧啶缺陷型，命名为
Ｐ􀆰 ｓｔｉｐｉｔｉｓ（ｕｒａ３－）。
１􀆰 ２􀆰 ４　 ｈｐｔ基因和 ｃｒｅ基因定点突变
按照 Ａｇｌｉｌｅｎｔ 公司 Ｑｕｉｃｋｃｈａｎｇｅ Ｌｉｇｈｔｎｉｎｇ Ｍｕｌｔｉ
０４ 生　 物　 加　 工　 过　 程　 　 第 １２卷　
Ｓｉｔｅ⁃Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔ 操作说明书，用表 １ 中
的 Ｈｐｔ １至 Ｈｐｔ ９ 和 Ｃｒｅ １ 至 Ｃｒｅ １５ 引物，以
ｐＳＨ４７ Ｈｐｔ为模板进行 ＰＣＲ，ＤｐｎⅠ酶消化 ３０ ｍｉｎ，
转化感受态细胞 Ｅ􀆰 ｃｏｉｌ ＪＭ１０９，用含氨苄青霉素的
ＬＢ固体培养基筛选突变子，并测序比对潮霉素 Ｂ基
因 ｈｐｔ和重组酶基因 ｃｒｅ ２个序列。
表 １　 本实验所用引物
Ｔａｂｌｅ １　 Ｐｒｉｍｅｒｓ ｕｓｅｄ ｉｎ ｔｈｉｓ ｒｅｓｅａｒｃｈ
引物 引物序列 （５ ¢– ３ ¢） 大小 ／ ｂｐ
ＵＲＡ３ １ ＴＣＡＡＧＣＡＴＴＧＧＣＡＣＡＣＣ １７
ＵＲＡ３ ２ ＧＧＣＧＡＴＴＴＣＣＡＣＡＧＴＴＴＣＣＡＣＴＣＣＡＣＴＧＡＡＧＣＡＣＡＣ ３６
ＵＲＡ３ ３ ＧＴＧＴＧＣＴＴＣＡＧＴＧＧＡＴＧＴＧＧＡＡＡＣＴＧＴＧＧＡＡＡＴＣＧＣＣ ３７
ＵＲＡ３ ４ ＴＴＣＧＴＣＡＡＧＡＣＴＣＡＡＧＧＣＴ １９
ｌｏｘｐＵＦ ＧＡＡＧＡＴＣＴＡＴＡＡＣＴＴＣＧＴＡＴＡＡＴＧＴＡＴＧＣＴＡＴＡＣＧＡＡＧＴＴＡＴＴＣＧＴＴＣＡＡＡＧＡＡＧＣ（ＢｇｌⅡ） ４８
ｌｏｘｐＵＲ ＧＡＡＧＡＴＣＴＡＴＡＡＣＴＴＣＧＴＡＴＡＡＴＧＴＡＴＧＣＴＡＴＡＣＧＡＡＧＴＴＡＴＴＣＡＡＴＡＣＡＡＴＡＣＣＣＡＡＴＣＡＣＣ（ＢｇｌⅡ） ５５
ＡＬＤ １ ＣＡＴＧＣＣＡＴＧＧＣＧＡＴＡＧＧＡＡＣＴＧＴＴＧＧＧＡＣ （ＮｃｏⅠ） ２９
ＡＬＤ ２ ＡＴＴＧＡＧＡＧＧＴＴＴＧＧＧＣＡＡＴＣＴＧＧＣＣＡＣＡＡＡＣＡＣＣ ３４
ＡＬＤ ３ ＧＧＴＧＴＴＴＧＴＧＧＣＣＡＧＡＴＴＧＣＣＣＡＡＡＣＣＴＣＴＣＡＡＴ ３４
ＡＬＤ ４ ＣＡＴＧＣＣＡＴＧＧＡＡＧＴＧＡＴＧＣＴＣＧＴＡＴＧＧＣ （ＮｃｏⅠ） ２８
ＡＬＤ ５ ＣＡＡＡＣＧＧＣＡＣＴＡＣＣＴＡＴＧＡＧ ２０
Ｈｐｔ １ ＧＡＧＡＡＧＴＴＴＴＴＧＡＴＣＧＡＡＡＡＧＴＴＣＧＡＣＡＧＣ ３０
Ｈｐｔ ２ ＧＡＣＡＧＣＧＴＣＴＣＣＧＡＣＴＴＧＡＴＧＣＡＧＣＴＣＴＣＧ ３０
Ｈｐｔ ３ ＧＧＧＣＧＴＧＧＡＴＡＴＧＴＣＴＴＧＣＧＧＧＴＡＡＡＴＡＧ ２９
Ｈｐｔ ４ ＡＡＴＴＣＡＧＣＧＡＧＡＧＣＴＴＧＡＣＣＴＡＴＴＧＣＡＴＣＴ ３０
Ｈｐｔ ５ ＴＴＧＣＡＡＧＡＣＴＴＧＣＣＴＧＡＡＡＣＣＧＡＡＴＴＧＣＣＣＧＣＴＧＴＴ ３６
Ｈｐｔ ６ ＡＡＴＴＧＣＣＣＧＣＴＧＴＴＴＴＧＣＡＧＣＣＧＧＴ ２５
Ｈｐｔ ７ ＡＧＧＣＴＣＴＣＧＡＴＧＡＧＴＴＧＡＴＧＣＴＴＴＧＧＧＣＣＧＡＧ ３２
Ｈｐｔ ８ ＧＣＴＣＣＡＡＣＡＡＴＧＴＣＴＴＧＡＣＧＧＡＣＡＡＴＧＧ ２８
Ｃｒｅ １ ＧＡＣＡＧＣＡＡＴＧＣＴＧＴＴＴＣＡＴＴＧＧＴＴＡＴＧＣＧＧＣＧＧＡＴＣ ３６
Ｃｒｅ ２ ＧＧＧＡＴＴＧＣＴＴＡＴＡＡＣＡＣＣＴＴＧＴＴＡＣＧＴＡＴＡＧＣＣＧＡＡＡＴＴＧＣ ４１
Ｃｒｅ ３ ＧＧＣＡＧＡＡＣＧＡＡＡＡＣＧＴＴＧＧＴＴＡＧＣＡＣＣＧＣＡＧＧＴＧＴＡＧＡＧ ３９
Ｃｒｅ ４ ＴＧＧＴＣＡＧＡＧＡＴＡＣＴＴＧＧＣＣＴＧＧＴＣＴＧＧ ２７
Ｃｒｅ ５ ＧＧＣＡＡＴＧＧＴＧＣＧＣＴＴＧＴＴＧＧＡＡ ＧＡＴＧＧＣＧＡＴＴＡＧ ３４
Ｃｒｅ ６ ＴＧＴＴＡＡＡＴＧＴＣＣＡＡＴＴＴＡＴＴＧＡＣＣＧＴＡＣＡＣＣＡＡＡＡＴＴＴＧ ３９
Ｃｒｅ ７ ＡＴＧＡＧＧＴＴＣＧＣＡＡＧＡＡＣＴＴＧＡＴＧＧＡＣＡＴＧＴＴＣＡＧＧＧ ３６
Ｃｒｅ ８ ＧＡＧＣＡＴＡＣＣＴＧＧＡＡＡＡＴＧＣＴＴＴＴＧＴＣＣＧＴＴＴＧＣＣＧＧＴＣＧＴＧＧ ４２
Ｃｒｅ ９ ＣＴＴＣＡＧＧＣＧＣＧＣＧＧＴＴＴＧＧＣＡＧＴＡＡＡＡＡＣＴＡＴＣ ３３
Ｃｒｅ １０ ＣＡＴＣＧＴＣＧＧＴＣＣＧＧＧＴＴＧＣＣＡＣＧＡＣＣＡＡＧＴＧＡＣ ３３
Ｃｒｅ １１ ＧＧＡＴＡＴＡＣＧＴＡＡＴＴＴＧＧＣＡＴＴＴＴＴＧＧＧＧＡＴＴＧＣＴＴＡＴＡＡＣ ４０
Ｃｒｅ １２ ＧＧＣＡＣＴＴＡＧＣＴＴＧＧＧＧＧＴＡＡＣＴＡＡＡＴＴＧＧＴＣＧＡＧＣＧＡＴＧＧＡＴＴＴＣ ４５
Ｃｒｅ １３ ＧＣＴＧＡＴＧＡＴＣＣＧＡＡＴＡＡＣＴＡＣＴＴＧＴＴＴＴＧＣＣＧＧＧＴＣＡＧ ３８
Ｃｒｅ １４ ＴＣＡＡＣＴＣＧＣＧＣＣＴＴＧＧＡＡＧＧＧＡＴＴＴＴＴＧ ２８
Ｃｒｅ １５ ＣＡＴＧＡＡＣＴＡＴＡＴＣＣＧＴＡＣＣＴＴＧＧＡＴＡＧＴＧＡＡＡＣＡＧＧ ３６
Ｈｐｔ Ｆ ＡＣＡＴＴＴＴＧＡＴＧＧＣＣＧＣＡＣＧＧ ２０
Ｈｐｔ Ｒ ＡＡＣＴＣＣＴＴＣＣＴＴＴＴＣＧＧＴＴＡＧＡＧＣＧ ２５
１􀆰 ２􀆰 ５　 同源重组载体 ｐＭＤ ａｌｄ ｌｏｘｐｕｒａ３的构建
以 Ｐ􀆰 ｓｔｉｐｉｔｉｓ基因组为模板，分别用引物ＡＬＤ １ ／
ＡＬＤ ２和ＡＬＤ ３ ／ ＡＬＤ ４ ＰＣＲ扩增 ａｌｄ５基因的上
下游同源重组片段，用重叠延伸 ＰＣＲ 将上下游片段
１４　 第 ５期 傅　 静等：Ｃｒｅ ／ ＬｏｘＰ 重组系统的改造及在树干毕赤酵母中的应用
拼接。 拼接片段连接 ｐＭＤ１９ Ｔ ｓｉｍｐｌｅ ｖｅｃｔｏｒ，转化
感受态细胞 Ｅ􀆰 ｃｏｉｌ ＪＭ１０９，用含氨苄青霉素的 ＬＢ 固
体培养基筛选阳性克隆，命名为 ｐＭＤ ａｌｄ，ａｌｄ５
ＧｅｎＢａｎｋ登录号 ＮＣ＿００９０４２。 质粒 ｐＭＤ ａｌｄ用 ＢｇｌⅡ
酶切，去磷酸化备用。 以 Ｐ􀆰 ｓｔｉｐｉｔｉｓ 基因组为模板，用
引物 ｌｏｘｐＵＦ、ｌｏｘｐＵＲ ＰＣＲ扩增含有 ｌｏｘｐ 位点的 ｕｒａ３
基因片段 ｌｏｘｐｕｒａ３，以 ＢｇｌⅡ酶切备用。 酶切的 ｐＭＤ
ａｌｄ和 ｌｏｘｐｕｒａ３ 用 Ｔ４ 连接酶连接，转化感受态细胞
Ｅ􀆰 ｃｏｉｌ ＪＭ１０９，用含氨苄青霉素的 ＬＢ 固体培养基筛
选、鉴定并保藏，命名为 ｐＭＤ ａｌｄ ｌｏｘｐｕｒａ３，同源重
组载体 ｐＭＤ ａｌｄ ｌｏｘｐｕｒａ３通过 ＮｃｏⅠ酶切后割胶回
收同源重组片段 ａｌｄ ｌｏｘｐｕｒａ３备用。
１􀆰 ２􀆰 ６　 ａｌｄ５基因的敲除
采用醋酸锂转化法将同源重组片段 ａｌｄ
ｌｏｘｐｕｒａ３转入 Ｐ􀆰 ｓｔｉｐｉｔｉｓ，涂布 ＭＤ 培养基，３０ ℃培养
４～５ ｄ，挑选长出的单菌落，用牙签点种于 ＭＤＵ 培
养基上，３０ ℃培养 ４ ～ ５ ｄ，反复筛选 ３ 轮至性状稳
定，提取基因组用引物 ＡＬＤ １ ／ ＡＬＤ ２ 和 ＡＬＤ
５ ／ ＡＬＤ ４进行 ＰＣＲ鉴定，筛选出 ａｌｄ５ 基因缺失的
菌株，命名为 Ｐ􀆰 ｓｔｉｐｉｔｉｓ（ａｌｄ５－）。
１􀆰 ２􀆰 ７　 ｕｒａ３标记基因的删除
定点突变修饰后的 ｐＳＨ４７ Ｈ Ｃ ＴＴＧ 载体
采用醋酸锂转化法转入 Ｐ􀆰 ｓｔｉｐｉｔｉｓ（ａｌｄ－）感受态中，
涂布含 ２５０ μｇ ／ ｍＬ 潮霉素 Ｂ，ｐＨ ８􀆰 ５的 ＹＥＰＤ固体
培养基，３０ ℃培养 ５～６ ｄ。 挑选长出的单菌落划线
含 ３５０ μｇ ／ ｍＬ 潮霉素 Ｂ的 ＹＥＰＤ固体培养基，３０ ℃
培养 ２ ｄ，用引物 Ｈｐｔ Ｆ和 Ｈｐｔ Ｒ进行 ＰＣＲ鉴定。
导入 ｐＳＨ４７ Ｈ Ｃ ＴＴＧ质粒的转化子划线于 Ｃｒｅ
重组酶诱导表达培养基上，３０ ℃培养 ２ ｄ，点种到新
的含 ２５０ μｇ ／ ｍＬ潮霉素 Ｂ 的 Ｃｒｅ 重组酶诱导表达
培养基上，连续传代 ５次后将转化子点种ＭＤＵ培养
基和 ＭＤ培养基，筛选出能够在 ＭＤＵ培养基上生长
而不能在 ＭＤ培养上生长的阳性转化子。 提取阳性
转化子基因组用引物 ＡＬＤ １ 和 ＡＬＤ ４ 进行 ＰＣＲ
鉴定，筛选 ｕｒａ３ 标记基因的删除的菌株，命名为
Ｐ􀆰 ｓｔｉｐｉｔｉｓ（ａｌｄ５－ｕｒａ３－）。
２　 结果与讨论
２􀆰 １　 尿嘧啶营养缺陷型菌株的构建
２􀆰 １􀆰 １　 ｕｒａ３基因同源重组片段的构建与鉴定
从 Ｐ􀆰 ｓｔｉｐｉｔｉｓ基因组 ＰＣＲ扩增得到的 ｕｒａ３ 上下
游同源臂片段 ＵＲＡＦ、 ＵＲＡＲ 和同源重组片段
ＵＲＡＦ Ｒ大小分别为 ９４２、９２３ 和 １ ８６５ ｂｐ，测序结
果表明各序列均正确。
２􀆰 １􀆰 ２　 尿嘧啶营养缺陷型菌株的筛选与鉴定
ｕｒａ３ 基因同源重组片段 ＵＲＡＦ Ｒ 转入
Ｐ􀆰 ｓｔｉｐｉｔｉｓ后，与 ｕｒａ３ 基因发生双交换同源重组，置
换掉 ｕｒａ３基因编码框中约 ３８０ ｂｐ 的序列。 野生型
菌株具有完整的 ｕｒａ３ 基因，能编码乳清苷酸脱羧
酶，该酶催化 ５ ＦＯＡ 为有毒物质，因此不能在
ＭＤＵ培养基上可以生长［３］，而 ｕｒａ３ 基因缺失的菌
株可在 ＭＤＵ 培养基上生长，尿嘧啶营养缺陷型菌
株由于缺乏生长必需的尿嘧啶不能在 ＭＤ培养基上
生长。 挑选性状稳定的菌株，用引物ＵＲＡ３ １和
ＵＲＡ３ ４进行基因组 ＰＣＲ鉴定，野生型菌株扩增产
物为 ２􀆰 ２ ｋｂ，尿嘧啶营养缺陷型菌株扩增产物为
１􀆰 ８ ｋｂ，电泳结果与理论结果一致（图 １）。 因此，证
明筛选的转化子为尿嘧啶营养缺陷型，命名为
Ｐ􀆰 ｓｔｉｐｉｔｉｓ（ｕｒａ３－），作为基因重组的筛选标记。
Ｍ—１ ｋｂ ｌａｄｄｅｒ ｍａｒｋｅｒ；１、２—Ｐ􀆰 ｓｔｉｐｉｔｉｓ（ｕｒａ３－）；
３、４—Ｐ􀆰 ｓｔｉｐｉｔｉｓ（ｗｉｌｄ ｔｙｐｅ）
图 １　 尿嘧啶营养缺陷型的 ＰＣＲ鉴定
Ｆｉｇ􀆰 １　 Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｕｒａｃｉｌ ａｕｘｏｔｒｏｐｈ ｂｙ ＰＣＲ
近几年来，Ｐ􀆰 ｓｔｉｐｉｔｉｓ 遗传转化方面的研究愈加
受到关注，通过同源重组已经实现 ｌｅｕ２、ｃｙｃ１、ａｄｈ１、
ａｄｈ２、ｘｙｌ２和 ｘｙｌ３ 等基因的敲除［１５－１８］，其中，ｌｅｕ２ 基
因的敲除提供了一种新的筛选标记———亮氨酸营
养缺陷型，ｃｙｃ１基因的敲除证明了该基因是影响乙
醇产率的一个关键基因，这些研究说明基因敲除技
术在微生物生理及代谢工程中的重要性。 但是，一
般的同源重组也有局限性，实现一个菌体中多个基
因的敲除过程比较复杂，需要引进不同的筛选标记。
２􀆰 ２　 定点突变结果
２􀆰 ２􀆰 １　 ｈｐｔ基因定点突变结果
质粒 ｐＳＨ４７ Ｈｐｔ中 ｈｐｔ 基因的 ＣＤＳ 区有 ９ 个
ＣＴＧ，分别在第 ４６、７６、１４５、２６２、３１０、３２５、３３７、５４４
和 ６１６位碱基，分别突变成 ＴＴＧ，根据测序结果挑选
２４ 生　 物　 加　 工　 过　 程　 　 第 １２卷　
正确的突变子，质粒相关信息见表 ２。
２􀆰 ２􀆰 ２　 ｃｒｅ基因定点突变结果
质粒 ｐＳＨ４７ Ｈｐｔ中 ｃｒｅ基因的 ＣＤＳ区有 １８个
ＣＴＧ，分别在第 １４、７９、１３６、２４７、３１０、３４３、４８１、４９０、
５１１、６０７、６４３、６５８、７１２、７８１、８５０、９８２、１ ０１２ 和 １ ０１５
位碱基，分别突变成 ＴＴＧ，根据测序结果挑选正确的
突变子，质粒相关信息见表 ２。
表 ２　 本实验突变质粒的信息
Ｔａｂｌｅ ２　 Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｌａｓｍｉｄｓ ｍｏｄｉｆｉｅｄ
ｉｎ ｔｈｉｓ ｒｅｓｅａｒｃｈ
质粒 结构区别
ｐＳＨ４７ Ｈ Ｃ ＴＴＧ ｃｒｅ基因和 ｈｐｔ 基因经过定点突变修饰
ｐＳＨ４７ Ｃ ＴＴＧ ｃｒｅ基因经过定点突变修饰，ｈｐｔ未修饰
ｐＳＨ４７ Ｈ ＴＴＧ ｈｐｔ基因经过定点突变修饰，ｃｒｅ基因未修饰
２􀆰 ３　 Ｃｒｅ ／ Ｌｏｘｐ重组系统的应用
２􀆰 ３􀆰 １　 ａｌｄ５基因的敲除
Ｃｒｅ ／ ＬｏｘＰ 系统是一种有力的 ＤＮＡ 重组工具，
Ｃｒｅ重组酶识别并结合 ＬｏｘＰ 位点，将位点之间的
ＤＮＡ序列删除。 因此该系统只使用一种标记就能
实现多个基因的敲除，该系统在酿酒酵母、巴斯德
毕赤酵母等酵母菌中已经有较为广泛的应用。
从 Ｐ􀆰 ｓｔｉｐｉｔｉｓ基因组 ＰＣＲ扩增得到的 ＡＬＤ５基因
上下游同源臂片段和拼接片段大小分别为 １ ００５、
８８４和 １ ８８９ ｂｐ，ｌｏｘｐｕｒａ３ 片段大小为 １ ７６８ ｂｐ。 同
源重组载体 ｐＭＤ ａｌｄ ｌｏｘｐｕｒａ３ 酶切验证，结果见
图 ２。 由图 ２可知：ｐＭＤ ａｌｄ ｌｏｘｐｕｒａ３ 通过 ＮｃｏⅠ
酶切得到约 ２􀆰 ７ ｋｂ 的 ｐＭＤ１９ Ｔ ｓｉｍｐｌｅ ｖｅｃｔｏｒ 和
３􀆰 ６ ｋｂ的同源重组片段 ａｌｄ ｌｏｘｐｕｒａ３；通过 ＢｇｌⅡ酶
切得到约 １􀆰 ８ ｋｂ和 ４􀆰 ６ ｋｂ ２个片段，其中酶切得到
的约 １􀆰 ８ ｋｂ大小的片段与 ｌｏｘｐｕｒａ３ 片段大小一致，
证明同源重组载体构建成功，该同源重组载体以
ｕｒａ３基因作为筛选标记。
同源重组片段 ａｌｄ ｌｏｘｐｕｒａ３ 导入 Ｐ􀆰 ｓｔｉｐｉｔｉｓ
（ｕｒａ３－）细胞后，与 ａｌｄ５基因发生双交换同源重组。
同源重组片段含 ｕｒａ３基因，发生同源重组的菌株能
在 ＭＤ培养基上生长，在 ＭＤ 培养基上筛选 ａｌｄ５ 基
因缺失菌株。 用引物 ＡＬＤ １ ／ ＡＬＤ ２ 和 ＡＬＤ ５
和 ＡＬＤ ４进行基因组 ＰＣＲ 鉴定，结果与理论结果
一样（图 ３）。 由图 ３ 可知：Ｐ􀆰 ｓｔｉｐｉｔｉｓ（ｕｒａ３－）菌株和
Ｍ—１ ｋｂ ｌａｄｄｅｒ ｍａｒｋｅｒ； １—ｐｌａｓｍｉｄ ｄｉｇｅｓｔｅｄ ｗｉｔｈ ＮｃｏⅠ；
２—ｐｌａｓｍｉｄ ｄｉｇｅｓｔｅｄ ｂｙ ＢｇｌⅡ； ３—ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｌｏｘｐｕｒａ３ ｓｉｔｅ ｂｙ ＰＣＲ
图 ２　 同源重组载体 ｐＭＤ ａｌｄ ｌｏｘｐｕｒａ３的鉴定
Ｆｉｇ􀆰 ２　 Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ ｖｅｃｔｏｒ
ｐＭＤ⁃ａｌｄ⁃ｌｏｘｐｕｒａ３
Ｐ􀆰 ｓｔｉｐｉｔｉｓ（ａｌｄ５－）菌株用引物 ＡＬＤ １ 和 ＡＬＤ ４ 扩
增得到的片段大小分别为 ２􀆰 ４ ｋｂ 和 ３􀆰 ７ ｋｂ；再分别
用内部引物 ＡＬＤ ５ 和 ＡＬＤ ４ 进行 ＰＣＲ 扩增，
Ｐ􀆰 ｓｔｉｐｉｔｉｓ（ａｌｄ５－）菌株由于缺失部分 ａｌｄ５ 基因，扩增
不出片段，Ｐ􀆰 ｓｔｉｐｉｔｉｓ（ｕｒａ３－）菌株扩增得到 １􀆰 ８ ｋｂ 片
段，结果表明 ａｌｄ５ 基因敲除成功，命名为 Ｐ􀆰 ｓｔｉｐｉｔｉｓ
（ａｌｄ５－）。
Ｍ—１ ｋｂ ｌａｄｄｅｒ Ｍａｒｋｅｒ；
１～４—ＰＣＲ ｗｉｔｈ ｐｒｉｍｅｒｓ ＡＬＤ １ ａｎｄ ＡＬＤ ４；
１、３—Ｐ􀆰 ｓｔｉｐｉｔｉｓ（ｕｒａ３－）； ２、４—Ｐ􀆰 ｓｔｉｐｉｔｉｓ（ａｌｄ５－）；
５～７—ＰＣＲ ｗｉｔｈ ｐｒｉｍｅｒｓ ＡＬＤ ５ ａｎｄ ＡＬＤ ４；
５、７—Ｐ􀆰 ｓｔｉｐｉｔｉｓ（ｕｒａ３－）； ６— Ｐ􀆰 ｓｔｉｐｉｔｉｓ（ａｌｄ５－）
图 ３　 Ｐｉｃｈｉａ ｓｔｉｐｉｔｉｓ（ａｌｄ５－）菌株的鉴定
Ｆｉｇ􀆰 ３　 Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｉｃｈｉａ ｓｔｉｐｉｔｉｓ （ａｌｄ５－）
２􀆰 ３􀆰 ２　 ｈｐｔ基因突变前后抗性比较
分别将重组质粒 ｐＳＨ４７ Ｈ Ｃ ＴＴＧ 和
ｐＳＨ４７ Ｃ ＴＴＧ 通过醋酸锂转化法转入尿嘧啶营
养缺陷型菌株 Ｐ􀆰 ｓｔｉｐｉｔｉｓ（ａｌｄ５－）感受态细胞中，用含
３４　 第 ５期 傅　 静等：Ｃｒｅ ／ ＬｏｘＰ 重组系统的改造及在树干毕赤酵母中的应用
２５０ μｇ ／ ｍＬ 潮霉素 Ｂ的 ＹＥＰＤ固体平板筛选。 实验
结果发现转化质粒 ｐＳＨ４７ Ｈ Ｃ ＴＴＧ 的平板上
长出 １００多个单菌落，转化质粒 ｐＳＨ４７ Ｃ ＴＴＧ的
平板长出若干个单菌落。 单菌落点种于含 ３５０
μｇ ／ ｍＬ 潮霉素 Ｂ的 ＹＥＰＤ平板培养 ４８ ｈ，进一步排
除假阳性，结果发现转化质粒 ｐＳＨ４７ Ｃ ＴＴＧ的平
板上的单菌落基本不生长，说明为假阳性，未修饰
的 ｈｐｔ基因不能在 Ｐ􀆰 ｓｔｉｐｉｔｉｓ中正确表达。 挑选转化
质粒 ｐＳＨ４７ Ｈ Ｃ ＴＴＧ的平板上长势较好的 ２株
菌进行菌落 ＰＣＲ鉴定。 以 Ｈｐｔ Ｆ ／ Ｈｐｔ Ｒ为引物，
扩增 ｈｐｔ基因。 作为对照，以野生型菌株为模板，同
样条件进行验证，结果见图 ４。 由图 ４ 可知：１、３ 泳
道条带大小与 ｈｐｔ基因一致，２号泳道为未转化质粒
的对照组，没有扩增出任何片段，说明重组载体
ｐＳＨ４７ Ｈ Ｃ ＴＴＧ 已成功转入了 Ｓ􀆰 ｓｔｉｐｉｔｉｓ
（ＡＬＤ５－）中，并能够表达有活动的抗性蛋白，使酵母
具有潮霉素 Ｂ 抗性。 图 ５ 为突变株对潮霉素 Ｂ 抗
性比较结果。 由图 ５可知：已导入质粒 ｐＳＨ４７ Ｈ
Ｃ ＴＴＧ的菌株在抗性平板上生长良好，野生型菌
株基本不生长。 由此，说明突变修饰后的 ｈｐｔ 基因
可作为 Ｐ􀆰 ｓｔｉｐｉｔｉｓ抗性筛选标记基因。
１、３—Ｐ􀆰 ｓｔｉｐｉｔｉｓ（ａｌｄ５－） ｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄ ｗｉｔｈ ｐＳＨ４７ Ｈ Ｃ ＴＴＧ；
２—Ｐ􀆰 ｓｔｉｐｉｔｉｓ（ａｌｄ５－）； Ｍ—λＤＮＡ ／ ＰｓｔⅠＭａｒｋｅｒ
图 ４　 ＰＣＲ鉴定 Ｐ􀆰 ｓｔｉｐｉｔｉｓ（ａｌｄ５－）中的质粒
ｐＳＨ４７ Ｈ Ｃ ＴＴＧ
Ｆｉｇ􀆰 ４　 Ｉｎｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｌａｓｍｉｄ ｐＳＨ４７ Ｈ Ｃ ＴＴＧ
ｉｎ Ｐ􀆰 ｓｔｉｐｉｔｉｓ（ａｌｄ５－） ｂｙ ＰＣＲ
２􀆰 ３􀆰 ３　 ｕｒａ３基因的删除
分别将质粒 ｐＳＨ４７ Ｈ Ｃ ＴＴＧ和ｐＳＨ４７ Ｈ
ＴＴＧ采用醋酸锂法转入 Ｐ􀆰 ｓｔｉｐｉｔｉｓ（ａｌｄ５－）感受态细胞
后，涂布含有 ２５０ μｇ ／ ｍＬ 潮霉素 Ｂ 的 ＹＥＰＤ 培养基
上筛选转化子，挑选单菌落进行菌落 ＰＣＲ 鉴定，鉴
定方法同 ２􀆰 ３􀆰 １。 挑取已导入质粒 ｐＳＨ４７ Ｈ Ｃ
Ａ—Ｐ􀆰 ｓｔｉｐｉｔｉｓ （ａｌｄ５－） ｗｉｔｈｏｕｔ ｐＳＨ４７ Ｈ Ｃ ＴＴＧ；
Ｂ—Ｐ􀆰 ｓｔｉｐｉｔｉｓ（ａｌｄ５－） ｗｉｔｈ ｐＳＨ４７ Ｈ Ｃ ＴＴＧ􀆰
图 ５　 ｈｐｔ基因定点突变后菌株对 Ｈｙｇｒｏｍｙｃｉｎ Ｂ抗性比较
Ｆｉｇ􀆰 ５　 Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｏｆ ｓｔｒａｉｎｓ ｒｅｓｉｓｔａｎｔ ｔｏ Ｈｙｇｒｏｍｙｃｉｎ Ｂ
ａｆｔｅｒ ｈｐｔ ｇｅｎｅ ｐｏｉｎｔ ｍｕｔａｎｔ
ＴＴＧ和质粒 ｐＳＨ４７ Ｈ ＴＴＧ的 Ｐ􀆰 ｓｔｉｐｉｔｉｓ（ａｌｄ５－）的
单菌落，分别点种 Ｃｒｅ 重组酶诱导表达培养基上诱
导 Ｃｒｅ重组蛋白的表达，重组蛋白能够识别 Ｌｏｘｐ 位
点，切除 ｕｒａ３基因。 经过 ＭＤＵ培养基的筛选，发现
导入质粒 ｐＳＨ４７ Ｈ Ｃ ＴＴＧ 的单菌落筛能够选
出尿嘧啶营养缺陷型菌株，因此，只有经过定点突
Ｍ—１ ｋｂ ｌａｄｄｅｒ ｍａｒｋｅｒ； １、３— Ｐ􀆰 ｓｔｉｐｉｔｉｓ（ａｌｄ５－）；
２、４—Ｐ􀆰 ｓｔｉｐｉｔｉｓ（ａｌｄ５－ｕｒａ３－）
图 ６　 Ｐ􀆰 ｓｔｉｐｉｔｉｓ（ａｌｄ５－ｕｒａ３－）的鉴定
Ｆｉｇ􀆰 ６　 Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｐ􀆰 ｓｔｉｐｉｔｉｓ（ａｌｄ５－ｕｒａ３－）
变修饰后的基因才具有表达活性蛋白的能力，重组
率达到将近 ５０％。 挑选性状稳定的尿嘧啶营养缺
陷型菌株用引物 ＡＬＤ １ 和 ＡＬＤ ４ 进行基因组
ＰＣＲ鉴定，电泳结果见图 ６。 由图 ６ 可知：Ｐ􀆰 ｓｔｉｐｉｔｉｓ
（ａｌｄ５－）菌株扩增得到约 ３􀆰 ７ ｋｂ 大小的片段，阳性
转化子扩增得到约 １􀆰 ９ ｋｂ大小的片段，证明 ｕｒａ３基
因被删除。 传代丢失 ｐＳＨ４７ Ｈ Ｃ ＴＴＧ，命名阳
性转化子为 Ｐ􀆰 ｓｔｉｐｉｔｉｓ（ａｌｄ５－ ｕｒａ３－）。 由此证明经过
修饰的 ｃｒｅ 基因表达的蛋白具有活性，修饰后的
４４ 生　 物　 加　 工　 过　 程　 　 第 １２卷　
Ｃｒｅ ／ Ｌｏｘｐ系统能够在 Ｐ􀆰 ｓｔｉｐｉｔｉｓ中应用。
３　 结　 论
Ｐ􀆰 ｓｔｉｐｉｔｉｓ的基因编码偏好性对该菌的遗传转化
研究造成了一定的阻碍。 Ｃｒｅ ／ ＬｏｘＰ 系统中应用的
外源基因潮霉素抗性基因 ｈｐｔ 及重组酶基因 ｃｒｅ 都
含有一定数量的 ＣＴＧ密码子，笔者对 ｈｐｔ基因和 ｃｒｅ
基因进行突变修饰后能在树干毕赤酵母中较好的
表达，使得 Ｃｒｅ ／ ＬｏｘＰ 系统在树干毕赤酵母中能够应
用。 Ｃｒｅ ／ ＬｏｘＰ 系统在树干毕赤酵母中的成功应用
为研究其代谢途径中的功能基因奠定了良好的实
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（责任编辑　 荀志金）
５４　 第 ５期 傅　 静等：Ｃｒｅ ／ ＬｏｘＰ 重组系统的改造及在树干毕赤酵母中的应用