全 文 ：核 农 学 报 2015，29 ( 2 ) : 0290 ～ 0295
Journal of Nuclear Agricultural Sciences
收稿日期: 2014-01-27 接受日期: 2014-11-05
基金项目:国家“973”计划课题 ( 2012CB723004 )
作者简介:熊冬梅，女，主要从事生物质能源研究。E-mail: xiatian4545@ 163． com
通讯作者:苏小军，男，副研究员，主要从事生物质能源研究。E-mail: suxiaojun5606@ 163． com
文章编号: 1000-8551 ( 2015 ) 02-0290-06
基于60 Co-γ射线辐照的木糖乙醇发酵差异性突变
菌株筛选及其发酵特性
熊冬梅1 曾 璐1 熊兴耀1，2 田开忠1 刘 阳3 石 琢3 苏小军1，3，4
( 1 湖南农业大学 /湖南省作物种质创新与资源利用重点实验室，湖南 长沙 410128 ;
2中国农业科学院蔬菜花卉研究所，北京 100081 ; 3 湖南农业大学食品科技学院，
湖南 长沙 410128 ; 4 湖南省植物功能成分利用协同创新中心，湖南 长沙 410128 )
摘 要:本研究利用60 Co-γ 辐射源对树干毕赤酵母 CICC1960 进行辐照诱变，获取木糖乙醇发酵优良菌株
和差异性突变菌株群体，为进一步利用比较基因组学方法深入研究木糖乙醇代谢机制提供菌种材料。
经筛选获得 7 株木糖乙醇转化差异性突变菌株，以乙醇木糖比为指标，可将各突变菌株的发酵能力由高
到低排列为 : a1、X4、i11、K2、X21、CICC1960、a11、c10，乙醇木糖比均值分别为 0. 3143、0. 3037 ; 0. 2911、
0. 2678、0. 2578、0. 2311、0. 2230、0. 1220。其中菌株 a1、X4、i11 为优良菌株，菌株 a1 在发酵 72h 时乙醇
产量达到顶峰 15. 6 g·L － 1，高出出发菌株 140%，乙醇木糖比高出出发菌株 37. 9% ; 菌株 X4 在发酵 60h
时乙醇产量达到顶峰 15. 4 g·L － 1，高出出发菌株 234. 8%，乙醇木糖比高出出发菌株 33. 1% ;菌株 i11 在
发酵 60h 时乙醇产量达到顶峰 14. 8 g·L － 1，高出出发菌株 221. 7%，乙醇木糖比高出出发菌株 29%。
关键词:树干毕赤酵母 ; 60 Co-γ 射线辐照;木糖 ;乙醇 ; 突变菌株 ; 发酵
DOI: 10. 11869 / j． issn． 100-8551. 2015. 02． 0290
以纤维生物质为原料生产的燃料乙醇是目前被认
为有极大发展前景的可再生能源之一［1 － 4］。地球上有
丰富的木质纤维素资源，主要由纤维素、半纤维素和木
质素 3 大组分构成。纤维素的水解产物以葡萄糖为
主，而半纤维素的水解产物则以木糖等五碳糖为
主［5 － 6］。在传统发酵工艺中，微生物仅能利用葡萄糖
等六碳糖生产乙醇。将其水解产物中的木糖等五碳糖
充分转化为乙醇，则乙醇产量可在原来的基础上增加
25%［7］。因此，获得转化性能优良的菌株是实现木质
纤维素原料全糖高效利用和提高乙醇产量的先决条
件。
由于从自然界中直接获得的野生型菌株利用木糖
生产乙醇的能力较弱，不适于工业化应用，因此需对其
进行改良以获得发酵性能优良的菌株。实践证明，射
线辐照诱变是一种非常有效的微生物突变选育手
段［8 － 12］。本文以树干毕赤酵母 CICC1960 为出发菌
株，采用60 Co-γ 辐射源对其进行辐照诱变处理，以期获
得优良菌株和构建木糖乙醇代谢差异群体，为木糖乙
醇发酵或进一步采用比较基因组学的方法研究其代谢
途径和进行定向遗传改良提供菌种资源。
1 材料和方法
1. 1 菌株
树干毕赤酵母 CICC1960 ( 购自中国微生物菌种资
源库)
1. 2 主要试剂与仪器
主要试剂 : D-木糖 ( 上海国药集团化学试剂有限
公司，分析纯 ) ，无水乙醇 ( 上海国药集团化学试剂有
限公司，分析纯) ，3，5-二硝基水杨酸( 上海国药集团化
学试剂有限公司，化学纯 ) ，Na0H ( 天津市风船化学试
剂科技有限公司，分析纯 ) ，酒石酸钾钠 ( 广东光华科
技股份有限公司，化学纯 ) ，苯酚 ( 上海国药集团化学
试剂有限公司，分析纯 ) ，无水亚硫酸钠 ( 上海西陇化
092
2 期 基于60 Co-γ 射线辐照的木糖乙醇发酵差异性突变菌株筛选及其发酵特性
工有限公司，分析纯) 。
DNS 溶液 :取 3，5-二硝基水杨酸 ( 10 ± 0. 1 ) g，置
于约 600mL 水中，逐渐加入氢氧化钠 10g，在 50℃水浴
中搅拌溶解，再一次加入酒石酸钾钠 200g、苯酚 2g 和
无水硫酸钠 5g，待全部溶解并澄清后，冷却至室温，用
水定容至 1 000mL，过滤。贮存于棕色试剂瓶中，于暗
处放置 7d 后使用。
主要仪器 : 单人单面洁净工作台 SW-CJ-1FD ( 苏
州净化设备有限公司 ) 、恒温培养箱 HPX-300BS-III
( 上海新苗医疗器械制造有限公司 ) 、恒温培养振荡器
ZHWY-2102C( 上海智城分析仪器制造有限公司 ) 、超
低温冰箱 DW-HL ( 中科美菱低温科技有限责任公
司) 、紫外分光光度计 UV-1800PC ( 上海美谱达仪器有
限公司 ) 、高速离心机 Legend Micro 21Ｒ ( 美国赛默飞
世尔公司) 、漩涡混合器 XH-C ( 金坛市医疗仪器有限
公司 ) 、生物传感分析仪 SBA-40E ( 山东省科学院生物
研究所) 。
1. 3 培养基
TTC( 2，3，5-氯化三苯基四氮唑 ) 下层培养基: 1%
木糖、0. 2% 蛋白胨、0. 15% 酵母粉、0. 15% KH2PO4、
MgSO4·7H2O、2%琼脂、121℃、20min 湿热灭菌 ;
TTC 上层培养基: 0. 5% 木糖、1. 5% 琼脂、0. 05%
TTC。( 121℃、20min 湿热灭菌。TTC 在培养基灭菌
后，冷却至 60℃左右加入) ;
木糖固体培养基: 木糖 20g，蛋白胨 15g，酵母粉
10g，( NH4 ) 2 SO4 1g，KH2PO4 1g，MgSO4·7H2O 0. 5g，
CaCl2·2H2O 1g，琼脂 15g，蒸馏水加至 1L; 121℃，
30min 高 温 湿 热 灭 菌。 摇 床 培 养 条 件 : 28℃、
120r·min － 1、pH 值 5. 5 ;
木糖发酵培养基: 木糖 50g，蛋白胨 15g，酵母粉
10g，( NH4 ) 2 SO4 1g，KH2PO4 1g，MgSO4·7H2O 0. 5g，
CaCl2·2H2O 1g，蒸馏水加至 1L; 121℃，30min 高温湿
热灭菌。摇床培养条件 : 28℃、120 r·min － 1、pH 值
5. 5。
1. 4 检测方法
1. 4. 1 乙醇检测 采用生物传感分析仪 SBA-40E 测
定发 酵 液 中 乙 醇 含 量。分 别 取 适 量 发 酵 液
10 000r·min － 1转速离心 10min，取上清稀释 20 倍，作
为样品待测液。配制 1g·L － 1乙醇标准液作为仪器校
正液，以 25μL 的标准液准确校正后取 25μL 待测液进
样检测。
1. 4. 2 木糖检测 采用 3，5-二硝基水杨酸比色法检
测发酵液中的木糖。
分别取适量发酵液 10 000 r·min － 1 转速离心
10min，取上清稀释 50 倍，作为样品待测液。分别取
1mL 待测液置于 25mL 比色管中，各加 3mL DNS 液，置
沸水中煮 10min，冷却，定容摇匀，OD540 测吸光度值，
其中以水取代样品作为对照调零，未进行发酵的灭菌
培养基稀释液为对照组。
1. 5 60Co-γ射线辐照处理
60 Co-γ 射线辐照处理在湖南省核农学与航天育种
研究所进行，辐照剂量为 0、200、400、600、800、1 000、1
200、1 400、1 600Gy。以 CICC1960 对数生长期菌体
( 18h) 稀释液( 使菌体浓度为 107 个·mL － 1 ) 为辐照处
理样品，每个辐照剂量制备 2 支 10mL 稀释菌液，分别
进行辐照处理。处理后菌液稀释至 10 － 6倍 ～ 10 － 4倍，
平板涂布，28℃恒温培养 1 ～ 3d。
1. 6 突变菌株的筛选
TTC 法初筛 : 配制以 2% 木糖为单一碳源的琼脂
平板下层，将辐照诱变菌株分别点接至平板已标记位
置，28℃恒温培养 24 ～ 48h，将 60℃左右 TTC 上层培养
基覆盖于 TTC 下层平板，冷却凝固后，28℃恒温培养
24h，观察是否发生 TTC 显色，显示红色表示具有产乙
醇能力，反之则无产乙醇能力。随机挑取不同形态菌
株若干进行 TTC 显色筛选，选取发生不同程度红色显
色反应的菌落进行 2% 木糖液体发酵，通过反复继代
获得发酵能力稳定的菌株。
1. 7 突变菌群的发酵动态试验
将各突变菌株按 1%接种量接种于 5%木糖液体
发酵培养基，每株 3 个平行接种，28℃、120r·min － 1恒
温震荡培养，以 36h 为起点，每隔 12h 取样检测。测定
乙醇和木糖的含量，并计算乙醇产率变化。
2 结果和分析
2. 1 差异性突变菌株的筛选
经不同剂量辐照处理后，进行 2%木糖平板涂布，
恒温培养 48h，可观察到辐照后，每个辐照剂量分离出
来的菌落大小、颜色和形状均出现明显差异，但大多数
与出发菌形态相似，为体积较小，颜色纯白的菌落 ( 图
1 ) 。经 TTC 筛选获得大量不同显色程度菌株，辐照后
的菌落形态和 TTC 显色程度与相对应的辐照处理剂
量并未呈现出规律性 ( 图 2 ) 。分别以 8 批次 ( 序号由
字母 a-x 表示，每个字母编号为 1 ～ 20 ) 对 TTC 显色菌
株进行筛选，即 0、200、400、600、800、1 000、1 200、1
400、1 600Gy，每个辐照剂量随机选取 60 株菌株分别
接入 2%木糖发酵液。经反复继代培养淘汰发酵性能
不稳定的菌株，在同等条件下以乙醇产量和木糖消耗
192
核 农 学 报 29 卷
量为检测指标，对发酵性能稳定的菌株进行检测评价，
最终得到乙醇转化能力有差异的稳定突变菌株 : X4、
X21、a1、a11、k2、C10、i11。由图 3 可知，各菌株在发酵
72h 后乙醇产量存在明显差异，其中 X4、a1、K2、i11 乙
醇产量在 13 ～ 16g·L － 1 之间 ; X21 乙醇产 量 为 10
g·L － 1 ; a11、C10 与出发菌株 CICC1960 产乙醇量相近，
为 6 ～ 7. 5 g·L － 1。各菌株乙醇产量由高至低依次为
a1 ＞ X4、i11 ＞ K2 ＞ X21 ＞ a11 ＞ CICC1960 ＞ c10。其中
菌株 a1 的乙醇产量为出发菌株的 2. 4 倍。
Note: A: 0Gy，B: 600Gy，C: 100Gy，D: 2000Gy．
图 1 诱变后菌落形态差异
Fig． 1 The difference of Colony morphology
after mutagenesis
图 2 TTC 显色结果
Fig． 2 The results of chromogenic reaction by TTC
2. 2 突变菌群的发酵动态变化
由图 4 可知，与出发菌株 CICC1960 相对比，经辐
图 3 突变菌群发酵 72h 后乙醇产量及木糖消耗情况
Fig． 3 The ethanol yield and xylose consumption of
mutational strains in fermentation process after 72 hour
照诱变获得的突变菌群在乙醇产量和发酵周期上均发
生了显著变化。一方面，以乙醇产量为指标，可明显区
分各菌株产乙醇能力的差异，以发酵 84h 为标准可将
菌群产乙醇能力区分为 3 个不同层次，X4、a1、K2、i11、
X21 乙醇产量在 13 ～ 16 g·L － 1之间，较出发菌株提高
了 7 ～ 7. 5 g·L － 1，为第 1 层次 ; a11 与出发菌株乙醇产
量相近，分别为 9. 7 g·L － 1和 8. 7 g·L － 1，为第 2 层次 ;
C10 乙醇产量为 6. 0 g·L － 1，为第 3 层次。另一方面，
突变群体的乙醇发酵周期也发生了改变，产乙醇能力
强的菌株，发酵周期缩短。如菌株 X4 和 a11 在 60h 时
乙醇产量达到最大值分别为 15. 4、14. 8 g·L － 1 ; 菌株
a1 和 K2 在 72h 时乙醇产量达到最大值，分别为 15. 6、
13. 2 g·L － 1 ;而出发菌株 CICC1960 在发酵 84h 后仍有
乙醇产生。菌株 c10 产乙醇能力最弱，但在发酵 72h
后，乙醇产量即达到峰值，表现出异于其他菌株的发酵
特点。
木糖残留量随发酵时间的推移而逐渐减少，由图
5 可知，出发菌株 CICC1960 木糖消耗量低于所有辐照
菌株，说明突变菌株木糖的利用能力均得到提高。其
中菌株 c10 在 36 ～ 72h 的乙醇产量与出发菌株相当，
木糖消耗量远远高于出发菌株，说明菌株 c10 的代谢
通量分配已发生较大改变。其它突变菌株的乙醇产量
与木糖消耗量变化趋势相似，各菌株木糖消耗由高至
低依次为 X4 ＞ i11 ＞ a1 ＞ c10 ＞ K2 ＞ X21 ＞ a11 ＞
CICC1960。
乙醇木糖生成比是乙醇生成与木糖消耗的质量
比，即乙醇木糖生成比 = 乙醇生成量 ( g ) /木糖消耗量
( g) ，它是乙醇得率的体现，可作为菌株能否有效将木
292
2 期 基于60 Co-γ 射线辐照的木糖乙醇发酵差异性突变菌株筛选及其发酵特性
图 4 突变菌群发酵过程中乙醇产量的动态变化
Fig． 4 The dynamic change of mutational
strains’ethanol yield of in fermentation process
图 5 突变菌群发酵过程中木糖消耗量的动态变化
Fig． 5 The dynamic change of mutational
strains’xylose consumption in fermentation process
图 6 突变菌群发酵过程中乙醇木糖比的动态变化
Fig． 6 The dynamic change of mutational strains’ethanol
productivity in dynamic fermentation process
糖转化为乙醇的评判标准。由图 6 可知，各菌株乙醇
木糖比均保持着相对稳定的水平，其中 c10 的最低，平
均值为 0. 1220，说明其利用木糖产乙醇的能力最弱，
仅为出发菌株的 51. 9% ; 菌株 a1、X4、i11 乙醇木糖比
最高，平均值分别为 0. 3143、0. 3037、0. 2911 ; 其次为
K2、X21、CICC1960 和 a11，平均值分别为 0. 2678、
0. 2578、0. 2311 和 0. 2230。
3 讨论
60 Co-γ 射线在辐照处理过程中产生具有电离作用
的高能量次级电子，次级电子通过电离辐射产生自由
基，自由基造成 DNA 分子缺失或损伤，因此利用
60 Co-γ射线辐照可获得大量随机突变的菌株。但有研
究表明，60 Co-γ 射线辐照诱发的 DNA 损伤中，几乎不
存在计量效应的影响，即射线剂量率的变化对 DNA 损
伤无明显影响［13］。本试验目的在于获取具有发酵差
异性的突变菌株，对所有辐照剂量的突变菌株进行随
机筛选。目前，60 Co-γ 射线辐照已成为一种常用的有
效生物诱变育种方式。李卫旗等［14］利用60 Co-γ 射线
诱变选育获得 1 株热凝胶多糖高产突变菌株，糖的转
化率提高到 58. 2%。李兴江等［15］通过60 Co-γ 射线诱
变选育获得高产琥珀酸放线杆菌突变株 HF417，其琥
珀酸产量由 45 g·L － 1增加到 67 g·L － 1，而副产物乙酸
浓度大幅降低，进一步基因序列分析发现磷乙酰转移
酶基因片段保守序列中发生 4 处突变，结果表明通过
诱变、代谢特性研究及基因序列检测分析，最终推断出
针对副产物代谢途径的定向阻断选育能够有效提高琥
珀酸产量。本试验通过60 Co-γ 射线对树干毕赤酵母
CICC1960 进行辐照处理，随机获取大量突变菌株，经
历层层筛选，并以代谢底物木糖、代谢生成物乙醇及乙
醇木糖生成比为指标辨别代谢通量存在差异的菌株，
最终获得 7 株木糖乙醇转化差异性突变菌株，与前人
研究相比本研究不仅仅只筛选出优势菌株，而是建立
一个代谢差异菌株群体，差异群体中包含了优、劣势菌
株，为比较基因组学的方法深入研究其代谢机制提供
丰富的变异菌种材料。
研究发现能利用木糖产生大量乙醇的酵母有 6
种，分别为酒香酵母、休哈塔假丝酵母、产朊假丝酵母、
嗜鞣管囊酵母、季也蒙毕赤酵母和树干毕赤酵母，其中
树干毕赤酵母利用木糖产乙醇能力最为突出，其特点
在于能同时利用葡萄糖和木糖进行乙醇发酵，发酵速
率快、乙醇转化率较高，且不易产生大量副产物［16 － 18］。
有研究者利用树干毕赤酵母进行木糖发酵，乙醇产率
392
核 农 学 报 29 卷
几乎接近理论值［19］。因此，目前对木糖乙醇发酵研
究，以树干毕赤酵母为对象的研究较多［20 － 24］。但目前
该菌株离工业化应用还有一定距离，菌株的木糖乙醇
转化性能有待提高，转化机制也有待深入研究。
菌株功能性差异株的筛选是为菌株的代谢途径解
析和遗传改良服务的，以产赖氨酸的谷氨酸棒杆菌为
例，Wittmann 等［25］利用代谢物平衡法，将 5 代随机诱
变筛选获得的产赖氨酸的谷氨酸棒杆菌进行代谢通量
家族谱系研究，获得不同生物系统的代谢功能及调控
方面的知识，为代谢工程菌种改进提供基础。Gill［26］
则利用反向代谢工程技术，将高产赖氨酸的谷氨酸棒
杆菌突变株与谷氨酸棒杆菌野生菌株进行全基因组测
序，找出有可能影响赖氨酸生产的突变基因，再将突变
基因 导 入 野 生 型，最 终 赖 氨 酸 生 产 率 高 达 3
g·L － 1·h － 1。本文通过60 Co-γ 射线辐照的方法进行菌株
的诱变筛选，以尝试构建树干毕赤酵母木糖乙醇代谢
差异菌株群体，为进一步利用比较基因组学的方法深
入研究其代谢机制提供菌种材料。将比较基因组学方
法应用于木糖乙醇发酵微生物的研究是一个很有前景
的新研究领域［27 － 30］。
4 结论
本试验获得的差异菌株，在发酵特性研究中显现
出发酵差异性，其中菌株 a1、X4、i11 为乙醇发酵优良
菌株，乙醇产量和得率均高于出发菌株，a1 在 72h 时
乙醇产量高出出发菌株 140%。而菌株 c10 乙醇产量
与出发菌株相当，乙醇得率仅为出发菌株的 51. 9%，
推其原因，该菌株在代谢通量分配已发生较大改变，在
发酵过程中可能将更多的木糖用于自身生长需要或生
成了其它的产物。本文通过60 Co-γ 射线辐照诱变不仅
获得了利用木糖产乙醇的优良菌株，同时也获得不同
层次木糖乙醇代谢差异菌株，说明60 Co-γ 射线辐照是
获得突变菌株的便捷、环保、有效的方法，适用于本试
验扩充差异菌株群体的目的，能有效为乙醇木糖代谢
机制的研究提供菌种材料。
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Screening of the Diversity Mutational Strains of Converting D-xylose to
Ethanol by 60 Co-γ Irradiation and Its Fermentation
Characterization Ｒeaserch
XIONG Dongmei1 ZENG Lu1 XIONG Xingyao1，2 TIAN Kaizhong3 LIU Yang3
SHI Zhuo3 SU Xiaojun1，3，4
( 1Hunan Provincial Key Laboratory of Crop Germplasm Innovation and Utilization /Hunan Agricultural University，Changsha，
Hunan 410128 ; 2 The Institute of Vegetables and Flowers Chinese Academy of Agricultural Sciences，Beijing 100081 ;
3 College of Food Science and Technology，Hunan Agricultural University，Changsha，Hunan 410128 ;
4Hunan Collaborative Innovation for Utilization of Botanical Functional Ingredients，Changsha，Hunan 410128 )
Abstract: In order to lucubrate the metabolic mechanism of D-xylose into ethanol by the method of Comparative
genomics，we used60 Co-γ irradiation to mutagenize Pichia stipitis CICC1960 and obtained some high ethanol conversion
strains and seven mutational strains． Using the ethanol yield as index，the fermentation ability of mutational strains in
descending order was: a1、X4、i11、K2、X21、CICC1960、a11、c10，and the average of ethanol-xylose ratio respectively
was: 0. 3143，0. 3037，0. 2911，0. 2678，0. 2578，0. 2311，0. 2230，0. 1220． The strain a1、X4、i11 were dominant
strains． The ethanol yield of strain a1 was 15. 6 g·L － 1 at 72 h，140% higher than the parent strain，and its ethanol-
xylose ratio 37. 9% higher than the parent strain． The ethanol yield of strain X4 was 15. 4 g·L － 1 at 60h，234. 8%
higher than the parent strain，and its ethanol-xylose ratio 33. 1% higher than the parent strain． The ethanol yield of
strain i11 was 14. 8 g·L － 1 at 60h，221. 7% higher than the parent strain，and its ethanol-xylose ratio 29% higher than
the parent strain．
Keywords: Pichia stipitis，60 Co-γ irradiation，xylose，ethanol，mutational strains，fermentation
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