全 文 ：收稿日期:2007-10-08
基金项目:国家自然科学基金(No.30671454)、教育部“新世纪优秀人才支持计划”(NCET-04-0905)、高等学校全国百篇优秀博士学位论文作
者专项基金(No.200253)
作者简介:张杰(1982-),男,四川巴中人,在读硕士研究生,主要从事生物技术在果树上的应用研究
通讯作者:汤浩茹,教授,博士,Tel:0835-2882515;E-mail:htang@sicau.edu.cn
低温是限制作物生长、分布和产量的最重要的环境因子之一[1]。许多植物经过一段时间的非冻低温锻
炼后抗冻性增强的现象称为冷驯化[2](coldacclimation,CA)。自 Guy等[3]首次报道植物在冷驯化中基因表
达发生改变以后,冷诱导基因(cold-regulatedgene,COR)的克隆及其功能、表达、调控遂成为植物抗寒研究
热点[4]。迄今,已从拟南芥、油菜、苜蓿、菠菜、小麦等作物中分离鉴定出大量的冷诱导基因[5]。1994年,
Yamaguchi等[6]在研究拟南芥 COR78/RD29a的启动子时鉴定出一个 9bp(TACCGACT)顺式作用因子 CRT
(C-repeat),能诱导 COR基因的表达,与 Baker等[7]从 RD29a鉴定出的脱水响应元件(dehydration-responsive
element,DRE)具有同样的核心序列 CCGAC,合称 CRT/DRE元件。研究表明,CRT/DRE元件以单拷贝或多
拷贝形式存在于许多 COR基因的启动子中[7,8]。利用酵母单杂交法,从拟南芥中分离鉴定出一编码 CRT/
DRE结合蛋白的基因家族[9,10],其成员编码冷响应转录激活因子,包括 CBF1、CBF2和 CBF3[9,11]或叫 DREB1b、
DREB1c、DREB1a[10,12]。
CBF转录因子是 AP2/EREBP类转录因子[9,10],它们特异地结合到含有 CRT/DRE元件的 COR基因启动
子区,从而激活 COR基因的表达进而提高植物的抗寒性。组成型表达 CBF基因导致拟南芥多个含有 CRT/
枳壳CBF转录激活因子基因片段的克隆
张杰 汤浩茹 罗娅 张勇
(四川农业大学林学园艺学院,雅安 625014)
摘 要: 根据不同植物CBF同源基因的保守区设计合成简并引物,采用PCR技术首次从枳壳基因组中分离出一
个DNA片段并克隆到pMD18-T载体中。序列测定和分析表明,该片段长464bp,与拟南芥3个CBF基因的核酸序列及
其推导的氨基酸序列分别具有79%和67%～69%的同源性,而且推导的氨基酸序列含有同源性更高的AP2DNA结合域
和CBF蛋白的两段特征序列PKK/RPAGRxKFxETRHP和DSAWR。结果表明,本研究克隆的片段为枳壳CBF基因片
段。
关键词: 枳壳 CBF转录激活因子 CBF基因 克隆
MolecularCloningofaGeneFragmentEncodingCBF
TranscriptionalFactorfrom Poncirustriforliata
ZhangJie TangHaoru LuoYa ZhangYong
(ColegeofForestryandHorticulture,SichuanAgricultureUniversity,Ya’an625014)
Abstract: ADNAfragmentwasamplifiedfrom geomeofPoncirustriforliatabypolymerasechainreactionusing
apairofprimersdesignedfrom theconservedsequencesofreportedCBFgenes,andclonedintothevectorpMD18-T.
Sequencemeasurementandanalysisshowedthatthenucleotideanddeducedaminoacidsequenceofthecloned464bp
fragmentwere79%and67%~69%identicaltothethreeArabidopsisCBFgenesrespectively.Moreover,therewereanAP2
DNA-bindingdomainofhigheridentityandtwosignaturesequencesofCBFproteins,PKK/RPAGRxKFxETRHPand
DSAWR,inthededucedaminoacidsequence.TheseresultindicatedthataPoncirustriforliataCBFgenefragmentwas
obtainedinthisstudy.
Keywords: Poncirustriforliata CBFtranscriptionalactivator CBFgene Cloning
2008年第2期
生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN·研究报告·
生物技术通报Biotechnology Buletin 2008年第2期
DRE元件的 COR(如 COR15a,RD29a)基因的表达且不需冷诱导就可以提高拟南芥整株的抗寒性[10,12,13]。植
物 CA存在多个调节途径[14,15],但 CBF途径占据主导地位[16],被称为植物 CA反应的“总开关”[17]。CBF基因
在提高拟南芥抗寒性方面的重要功能促使了在其他植物中分离鉴定 CBF类似基因 (CBF-likegene)的研
究。除拟南芥外,已从油菜、小麦、黑麦[18]、水稻[19]、番茄[18,20]、烟草[21]、草莓[22]、樱桃[22,23]、葡萄[24]、等植物中分
离出 CBF-like基因并被证明具有 CBF相似的功能。越来越多的研究表明,拟南芥 CBF冷响应途径高度保
守地存在于高等植物中。
柑橘是世界上重要的经济作物,但许多柑橘品种都不耐寒,低温常严重地影响其产量[25]。因此,抗寒性
是柑橘育种重要的指标。但由于柑橘类植物的遗传背景复杂、童期长和多胚性等原因,传统柑橘抗寒育种
研究进展十分缓慢[26]。利用基因组学和分子生物学如克隆、基因操作、遗传转化等技术可以克服传统育种
手段的不足,为研究柑橘耐寒机制和抗寒育种提供新的思路和方法[27]。枳壳是常用的柑橘砧木,极耐寒,经
冷驯化后可耐-26℃低温[26],若从中克隆一些抗寒基因导入栽培品种中,较其他植物外源抗寒基因更容易
获得抗寒新品种[28]。本研究首次从枳壳中分离鉴定出 CBF-like基因片段,为研究枳壳抗寒的分子机制和柑
橘作物的抗寒育种奠定了基础。
1 材料与方法
1.1材料
枳壳(Poncirustriforliata)嫩叶采自四川农业大学教学科研园,经液氮速冻后,置-70℃冰箱保存备用。
大肠杆菌 JM109、pMD18-TVector、EcoRⅠ、HindⅢ 购自大连 Takara公司。TIANgelMiniPurificationKitDNA
购自天根生化(北京)。
1.2方法
1.2.1 基因组 DNA的提取 参照程运江等[29]的方法。
1.2.2 引物设计与 PCR扩增 分析 GenBank中登录的拟南芥、油菜、葡萄、甜樱桃 CBF蛋白序列的同源
性设计一对简并引物 PtCBF-f:5-CCNAARARRCCNGCNGGNAG-3PtCBF-r:5-GGNARNARCATNCCYTCNGC
C-3,引物由北京赛百胜公司合成。
PCR反应体系为 25μl反应体系:dNTPs(10mmol/l)0.125μl,MgCl2 (25mmol/l)2.5μl,10×PCRBufer
2.5μl,Taq(2.5U/μl)0.4μl,DNA5μl(100ng),上下游引物各 1μl(10nmol),ddH2O12.475μl。采用热启动降
落 PCR扩增目的片段。扩增程序为:预变性 94℃5min;94℃1min;65℃1min;72℃1min;然后每循环退
火温度降低 1℃,反应 13个循环;再按 94℃1min;52℃1min;72℃1min反应 26个循环;最后 72℃延伸
10min,4℃保存。扩增结束后取 5μl扩增产物在以 5V/cm电压在 1.5%琼脂糖、0.5×TBE电泳缓冲液中电
泳。
1.2.3 目的片段的回收与克隆 PCR产物经 1.5%琼脂糖电泳分析后,用 TIANgelMiniPurificationKit回收
并纯化,以 pMD18-TVector为载体,16℃连接过夜,然后转化 JM109感受态细胞,在加 Amp的 LB平板上选
择培养,挑取单菌落培养,提取质粒进行酶切鉴定和菌液 PCR鉴定。鉴定后的菌液送上海英骏生物技术公
司测序。
1.2.4 序列生物信息学分析 将测序得到的核酸序列和推导的氨基酸序列分别在 NCBI(htp:/www.ncbi.
nlm.nih.gov)上用 BLASTn和 BLASTp进行序列相似性分析,采用 DNAMAN软件进行多序列比对。
2 结果与分析
2.1 PCR产物的扩增与克隆
以枳壳基因组 DNA为模板,用所设计的一对引物进行 PCR反应,得到三条条带(图 1),其中 A条带
明亮清晰,B和 C条带模糊暗淡。考虑到引物的位置和片段长度等因素,实验选取 A进行回收纯化,将经
纯化后的 PCR产物与 pMD18-TVector(2692bp)载体连接并转化大肠杆菌 JM109感受态细胞,经 LA平板
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筛选 、质粒 PCR和双酶切鉴定,确定克隆成功后(图 2),将菌液送上海英骏生物技术公司测序。
2.2基因序列和同源性分析
枳壳 CBF-Like基因片段测序结果如图 3所示,该片段长 464bp。BLASTn搜索 GenBank默认参数,结果
显示该片段与拟南芥等植物中的 CBF家族基因的保守区有很高的同源性。其与拟南芥 CBF1(AF076155.1)、
CBF2(AF074601.1)、CBF3(AF062925.1)的同源性均为 79%,与木本果树甜樱桃 (AB121674.1)和葡萄
(AY706986.1)CBF基因的同源性分别为 74%,初步表明所扩增的片段枳壳 CBF基因片段,命名为 PtCBF。
该片段不含内含子,编码 154个氨基酸(图 3)。利用 BLASTp搜索 GenBank默认参数,结果表明,推导
的 氨 基 酸 序 列 与 拟 南 芥 CBF1、CBF2和 CBF3(GenBank登 录 号 分 别 为 AAC99369.1,AAD15976.1,
AAC78647.1)氨基酸序列同源性为 69%、68%和 67%,而与葡萄 CBF蛋白(AAW58104.1)序列的同源性达到
了 76%。
进一步分析表明,该氨基酸序
列中存在一个保守的 AP2结构域
和两段特征序列 NLS和 DSAWRL
(图 4),且在 AP2保守区与拟南芥
的同源性高达 94%。比较不同植物
CBF基因 AP2保守区还发现,作为
AP2结构域功能性保守氨基酸第 14
位的缬氨酸(14V)和第 19位的谷氨
酸(19E)也在 PtCBF中保守存在,这
些都符合 CBF类转录因子的特征。
3 讨论
从枳壳基因组 DNA中分离到
了 CBF同源基因的一个片段,序列
分析表明,它的核苷酸序列和氨基
酸序列其他植物的 CBF同源基因
具有较高的同源性。CBF蛋白一级
结构中含有 AP2DNA结合域,推断
的碱性核定位信号区和潜在的酸性
转录激活区[9,10,30],拟南芥、油菜、小
麦、黑麦和番茄CBF蛋白中还存在两
段独特 PKK/RPAGRxKFxETRHP和
DSAWR[18],前者直接位于 AP2DNA
结合域的上游,后者就在 AP2DNA
结合域的下游。分离到的片段具有
除酸性转录激活区外的全部 CBF蛋
白结构特征。因此,判定该片段即为枳壳 CBF同源基因片段。
CBF/DREB转录因子的发现为利用基因工程手段改良植物抗寒性提供了一条全新的技术途径。转基
因实验表明,超表达 CBF基因可以使植物在非冷驯化状态下提高 COR蛋白的含量,提高脯氨酸和可溶性
糖的含量[17,31],产生胚胎发育晚期丰富蛋白(lateembryogenesisabundant,LEA)和亲水性多肽[18],改变细胞
质膜组分[32]。因此,通过转单个 CBF基因就可能启动一组抗性基因的表达,从而提高作物的抗冻性[12]。
图 3枳壳 CBF-Like基因克隆的核苷酸序列和推导的氨基酸序列
着重符号的部分为核定位序列 NLS;黑线部分为 AP2DNA结合域;双划线部分为
特征序列 DASWRL
图1枳壳CBF同源基因的PCR扩
1.DNAmarker2.PCR扩增产物
图2克隆鉴定
1.DNAmarker2.重组质粒PCR
3.重组质粒EcoRⅠ+HindⅢ
张杰等:枳壳 CBF转录激活因子基因片段的克隆 125
生物技术通报Biotechnology Buletin 2008年第2期
图 4 PtCBF与已知 CBF蛋白的 AP2结构域氨基酸同源性比较
从枳壳分离出的 DNA片段与 CBF基因具有结构的相似性,研究表明在枳壳中存在 CBF类似基因。但
枳壳 CBF同源基因是否具有 CBF基因的同样的功能以及枳壳是否存在 CBF冷驯化反应机制还不能确定。
目前,作者正在着手克隆基因的全长并通过转基因等手段对上述问题进行深入研究。
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