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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2011 年第 9 期
刺参管足 SMART cDNA文库构建及 EST分析
李栋 常亚青 王玉丹 丁君
(大连海洋大学 农业部海洋水产增养殖学重点开放实验室，大连 116023)
摘 要: 以大连广鹿岛野生刺参的管足 mRNA 为材料，利用 SMART cDNA Construction Kit 构建了表达型 cDNA 文库。
初始文库的滴度为 1． 3 × 106PFU /mL，蓝白斑估测重组率合格。扩增后获得 96 mL 文库，滴度为 1． 8 × 1010 PFU /mL，从扩增文
库中随机挑取 200 个噬菌斑进行 PCR检测，电泳检测结果表明重组率大于 90%，片段大小在 0． 25 － 2． 0 kb之间的插入片段占
80． 4%，文库构建成功。随机选择 122 个噬菌斑转化为质粒 pTriplEx2 并测序，测序成功率 83． 6%，软件处理后 100 bp以上的
clean ESTs有 72 条，测通的为 65 条，占成功测序样品的 63． 7%。72 条序列经 SeqMan软件拼接，获得 48 条 contig /singletons，
在线 Blast比对发现其中 26 条具有同源序列并获得注释，另外 20 条可能为新基因，其功能和结构有待进一步利用生物信息学
的方法进行分析和研究。
关键词: 刺参 管足 cDNA文库 EST分析
Construction of SMART cDNA Library from Tube Foot of Sea
Cucumber(Apostichopus japonicus)and EST Analysis
Li Dong Chang Yaqing Wang Yudan Ding Jun
(Ministry of Agriculture Key Laboratory of Mari Culture，Dalian Ocean University，Dalian 116023)
Abstract: We constructed the full-length cDNA library from the tube foot of adult sea cucumber(Apostichopus japonicus)captured
from Guanglu Island in Dalian，China． Poly-A RNA of high quality was used as starting material，and double strand cDNA was synthe-
sized following the Long-Distance PCR protocol provided by SMART cDNA library construction kit(Clontech)． The primary cDNA li-
brary constructed had a titer of 1． 3 × 106 PFU /mL，and the 96 mL amplified library has a titer of 1． 8 × 1010 PFU /mL． Random PCR
screening of 200 plaques indicated that 80． 4% of the inserts scattered between 0． 25 － 2 kb and the recombination efficiency was about
90% ． 122 plaques were randomly selected and converted to plasmid pTripIEx2 for sequencing，and after further procession 72 clean
ESTs were obtained from which we got 48 contig /singletons after assembling with software SeqMan． 26 of these contig /singletons were
annotated through online BLAST，while others remained for further study of its function．
Key words: Apostichopus japonicus Tube foot cDNA library EST analysis
收稿日期:2011-02-18
基金项目:国家”863”计划项目(2006AA10A411，2010AA10A401)
作者简介:李栋，男，硕士研究生，研究方向:刺参遗传育种;E-mail:ld2343@ 163． com
通讯作者:常亚青，男，教授，博士生导师，研究方向:海洋动物遗传育种与养殖;E-mail:yqchang@ dlou． edu． cn
刺参(Apostichopus japonicus)具有较高的营养和
药用价值，是我国北方重要的养殖海珍品;而且刺参
进化地位独特，具有夏眠、排脏再生等独特的生命现
象，国内外学者对刺参的生态、生理及生物学等进行
了大量研究［1］。管足是刺参主要的运动器官，刺参
的神经系统和水管系统都经分支而向管足延伸，同
时管足可以进行气体交换，具有辅助呼吸的功
能［1，2］。在生产上，刺参管足的吸附能力被作为反
应参体健康状况，评定刺参等级优劣的重要指标。
构建 cDNA文库是研究生物体功能基因组的重
要技术手段，尤其全长 cDNA文库的构建可以高效、
大规模获得基因序列，并且序列大多数包括 3和 5
端的非编码区，对基因组庞大和尚未获得全基因组
序列的物种而言，是进行基因组研究的一条重要途
径。在刺参遗传背景并不完全清楚情况下，科研人
员积极开展了刺参 cDNA 文库的构建工作，推动了
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2011 年第 9 期
刺参功能组学的研究进展。陈璐等［3］利用&Trip-
lEx2 载体构建了刺参肌肉组织的 cDNA文库。周遵
春等［4］构建了刺参体壁、肠和呼吸树全长 cDNA 文
库并进行了大规模测序和数据初步分析。郑法
新［5］、Rojas-Cartagena 和 Ortíz-Pineda 等［6，7］构建了
海参肠组织及再生肠组织的 cDNA文库并对可能与
再生相关的基因进行了筛选，而 Ramírez-Gómez
等［8］则利用海参 Holothuria glaberrima cDNA 文库对
可能与免疫相关的基因进行了发掘。
本研究以野外采捕健康刺参的管足为试验材
料，构建表达型 SMART cDNA 文库，随机挑选重组
克隆进行测序并对获得的 EST 序列进行拼接、比对
和分析，以期为对这一重要器官的基因表达进行
探索。
1 材料与方法
1． 1 材料
1． 1． 1 材料来源 刺参 10 头，取自大连广鹿岛海
域，平均体重 430 g，暂养于大连海洋大学农业部海
洋水产增养殖学重点开放实验室。暂养条件:水温
18 － 20℃，盐度 30‰，隔日换水 100%，24 h充气，投
喂刺参配合饲料。
1． 1． 2 主要试剂 RNA提取 RNAiso Plus 及 DNA/
RNA marker 为 TaKaRa 公司产品，mRNA 分离试剂
盒 Oligotex mRNA Mini Kits 为 Qiagen 公司产品，文
库构建及 PCR 检测试剂盒 SMARTTM cDNA Library
Construct Kit和 AdvantageTM cDNA PCR Kit 为 Clon-
tech 公司产品，文库噬菌体包装蛋白 MaxPlaxTM
Lambda Packaging Extracts 为 Epicentre公司产品，质
粒提取使用天根质粒小提试剂盒。其他常用药品均
为上海生工分析纯试剂。
1． 2 方法
1． 2． 1 总 RNA 提取、mRNA 分离及浓缩 从活体
海参上剪取海参管足，用滤纸吸干海水，液氮速冻并
研成粉状，加入适量 RNAiso Plus 提取总 RNA。琼
脂糖电泳检测，紫外分光光度计扫描，计算浓度。用
Oligotex mRNA Mini Kit分离 mRNA，紫外分光光度
计扫描，计算浓度。用 NH4Ac-乙醇沉淀法浓缩。
1． 2． 2 cDNA 文库的构建及扩增 以 SMART IV
Oligonucleotide及 CDS III /3PCR Primer为引物合成
5端完整的单链 cDNA。以 5 PCR Primer 和 CDS
III /3PCR Primer为引物，确定最佳循环数后在 Ad-
vantage 2 PCR Kit作用下 PCR 反应合成 cDNA 第 2
链，并取 5 #L凝胶电泳检测。双链 cDNA 经蛋白 K
消化、Sfi I酶切及片段分级分离和纯化后，连接到&
TripIEx2 载体上。连接产物由 MaxPlax Lambda
Packaging Extract进行噬菌体包装，形成初始文库。
检测初始文库滴度，蓝白斑估测重组率。质量
合格后，将文库与感受态 E． coli XL-Blue 和 1 × &稀
释缓冲液混匀，37℃培养 15 min 后加入 LB /MgSO4
表层琼脂，倒在 37℃预热的 LB /MgSO4平板上，使均
匀分布。37℃培养，到噬菌斑开始互相接触为止，向
每个平板加入 12 mL 1 × &稀释缓冲液，4℃过夜，收
集合并缓冲液形成扩增文库。检测文库滴度，PCR
检测重组率，加入 7%的 DMSO，混匀后放入冰箱 －
80℃保存。
1． 2． 3 cDNA文库的质量鉴定 文库滴度检测:1 #
L噬菌体 10 倍稀释液加到 200 #L 感受态 XL-Blue
E． coli菌液中，37℃，10 － 15 min，噬菌体吸收。加
入 2 mL熔化的的表层琼脂混匀，倾倒在 37℃预热
的 LB /MgSO4 平板上，37℃培养 6 － 18 h，计数噬菌
斑。
文库滴度(PFU /mL)= 透明噬斑数 × 稀释倍
数 × 103 /铺平板的稀释噬菌体的体积(#L) ;库容量
=库包装体积 ×滴度［9］。
cDNA文库重组率测定:随机挑取分离好的噬
菌斑到 100 #L 1 × &稀释缓冲液中，4℃过夜。分别
取 5 #L作为模板，用试剂盒说明书中提供的引物和
条件进行 PCR扩增。1%琼脂糖凝胶电泳检测插入
片段的大小，计算重组率。
1． 2． 4 噬菌体的质粒化及质粒提取 挑分离好的
单斑到 350 #L 1 × &稀释缓冲液中。涡旋，4℃过夜
溶解。在无菌小管内加入 200 #L 感受态 E． coli
BM25． 8，150 #L 噬菌斑溶解液，31℃，静置 30 min。
加入 400 #L LB 培养基，31℃，225 r /min，60 min。
取 10 #L 涂布 LB /carbenicillin 平板，31℃培养。每
个平板挑取几个分离好的单菌落为模板 PCR检测，
用天根质粒小提试剂盒提取含有插入片段的质粒。
质粒样品 － 20℃暂存，送上海生工用 T7 测序，
根据测序结果对部分质粒反向测序。
1． 2． 5 EST序列分析 首先根据 Bioedt 软件及人
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工鉴别去除信号模糊和长度小于 150 bp 的低质量
EST序列，用 VecScreen 在线载体序列比对工具寻
找并去除插入片段两端的载体序列及 poly-A 尾，将
获得的 clean ESTs序列提交国际生物技术信息中心
(NCBI)。利用 SeqMan 软件进行拼接，获得重叠群
(contigs)或单一的 EST 序列(singletons) ，利用在线
核苷酸序列比对程序 Blastn、Blastx 对 Nucleotide
collection(nr /nt)、Non-human，non-mouse ESTs(est
others)和 Non-reduntant protein sequences(nr)数据
库进行同源搜索。参数设置为默认。根据比对结
果，对 ESTs进行功能注释。对没有显著同源性的序
列进行开放阅读框和蛋白结构域的查找。
2 结果
2． 1 总 RNA、mRNA质量鉴定
总 RNA甲醛变性琼脂糖电泳检测，条带清晰，
28S条带亮度约为 18S 的 2 倍，表明完整且无污染
(图 1)。浓缩 mRNA 紫外扫描曲线特征明显，
OD260 /OD280在 2． 0 以上，表明纯度很高，mRNA计算
浓度为 0． 4 #g /#L(图 2)。起始材料满足 cDNA 文
库构建的要求。
M． DL2000;1 － 10．刺参管足总 RNA
图 1 刺参管足总 RNA甲醛变性琼脂糖凝胶电泳
图 2 刺参管足 mRNA紫外扫描曲线
2． 2 双链 cDNA质量鉴定
琼脂糖电泳检测表明双链 cDNA 主要分布于
0． 3 － 6 kb(图 3) ，蛋白酶 K消化，Sif I酶切后片段
分级分离，收集到 16 个离心管内。电泳检测，其
中第 7 － 10 管分布于 500 bp以上。合并后加入醋
酸钠、糖原、乙醇，过夜沉淀，加 7 #L 去离子水
溶解。
M1． λ-Hind III digest DNA Marker;M2． Wide Range DNA
Marker(1000 － 6000 bp) ;1．刺参管足 ds-cDNA
图 3 刺参管足双链 cDNA 1%琼脂糖凝胶电泳
2． 3 cDNA文库质量鉴定
经鉴定，初始文库滴度为 1． 3 × 106 PFU /mL，库
容量为 7． 2 × 105。库容量扩增后文库 96 mL，滴度
为 1． 8 × 1010PFU /mL。挑取 200 个噬菌斑单斑作为
模板，PCR结果表明重组率大于 90%，片段大小在
0． 25 － 2． 0 kb之间的插入片段占 80． 4%，片段主要
集中在 0． 3 － 1． 8 kb(图 4)。各方面指标达到文库
构建的要求。
M． DL 2000 marker;1 － 10．插入片段 PCR产物检测
图 4 文库插入片段 PCR检测
2． 4 随机质粒化及测序
文库侵染宿主菌 E． coli XL1-Blue，培养形成噬
菌斑，采用随机选择的方法挑取噬菌斑并化为质粒
pTripIEx2，挑取宿主 E． coli BM25． 8 单菌落进行
PCR检测，将包含 0． 25 － 2． 0 kb 插入片段的 122 个
菌落进行质粒提取并测序，测序成功 102 个，成功率
为 83． 6%。
2． 5 EST序列分析
随机挑取噬菌斑并转化为质粒 pTriplEx2，根据
菌落 PCR结果选择插入条带在 250 bp 以上的菌落
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生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2011 年第 9 期
培养并提取质粒。先后将 112 个质粒样品送上海生
物工程有限公司用 T7 引物物测序，根据测序结果对
需要反向测序的按照 SMART cDNA 文库构建试剂
盒体构引物序列进行反向测序，测序成功 102 条，测
序成功率 83． 6%。软件处理后 100 bp 以上的 clean
ESTs有 72 条，提交到国际生物技术数据中心(NC-
BI) ，其 GenBank 登录号:HS975108-HS975179。检
测到 5端载体序列，即测通的有 65 条，占成功测序
样品的 63． 7%。72 条序列经 SeqMan 软件拼接，获
得 48 条 contig / singletons，将 contig / singleton 统一看
作独立的转录本(tentative unique transcript，TUT) ，
其表达丰度统计如表 1 所示。
利用在线 Blast程序寻找同源序列，blastx认为
得分大于 80，相似度大于 35% 的序列相似性显
著，blastn得分大于 150，E 值小于 － 30 认为高度
相似［10］。
表 1 刺参管足 EST测序丰度统计
表达丰度 TUTs数目 /比重(%) EST数目 /比重(%)
1 38 /79． 17 38 /52． 78
2 5 /4． 17 10 /13． 89
3 2 /4． 17 3 /4． 17
4 1 /2． 08 4 /5． 55
5 1 /2． 08 5 /6． 94
12 1 /2． 08 12 /16． 67
合计 48 /100 72 /100
结果发现高度同源序列的有 26 条，与海参已知序列
同源的占 61． 5%，其中 TUT7 为刺参 nad2 基因、
TUT33 为刺参铁蛋白基因、TUT43 为刺参室管膜相
关蛋白前体基因，部分获得注释的 TUTs 如表 2 所
示。未发现高度同源序列的有 20 条，可能为新基
因，其结构和功能有待进一步利用生物信息学的方
法进行分析和研究。
表 2 部分刺参管足 EST序列拼接后 Blast比对结果
转录本 长度(bp) 功能注释 E值 相似度(%)
2 1381 果糖二磷酸醛缩酶 A(Homo sapiens) 8e-83 87
5 754 细胞周期及凋亡调控蛋白 1(Harpegnathos saltator) 3e-31 40
7 1016 NADH脱氢酶第二亚基(Apostichopus japonicus) 4e-87 88
11 511 BRAFLDRAFT124590(Branchiostoma floridae) 5e-25 49
12 658 XP797802(Strongylocentrotus purpuratus) 2e-85 87
22 813 60S核糖体亚基轻链 L13 蛋白(Danio rerio) 1e-26 83
26 395 BRAFLDRAFT81970(Branchiostoma floridae) 1e-25 69
33 1236 铁蛋白(Apostichopus japonicus) 5e-95 99
38 373 KIAA1450 样蛋白(Strongylocentrotus purpuratus) 3e-18 49
40 291 肠再生表达基因(Holothuria glaberrima) 2e-75 88
43 125 室管膜相关蛋白前体(Apostichopus japonicus) 1e-54 99
46 292 ART3 蛋白(Saccharomyces cerevisiae) 1e-15 82
3 讨论
3． 1 刺参管足 SMART cDNA文库构建
构建表达文库的前提是获得高纯度、完整的
mRNA，而且为了尽可能避免 LD-PCR 合成双链 cD-
NA时对基因表达丰度产生影响，这就要求起始 mR-
NA的浓度应尽量高一些以保证 PCR 循环数较低。
前提则是总 RNA的量要大，完整性要好，而对总 RNA
的纯度要求不是特别高。本研究采用 Trizol 法提
取总 RNA，方法简便快捷，有效避免了 RNA 的降
解，另外，用 RNA 分离柱直接分离 RNA 避免了酚
氯仿抽提和乙醇沉淀，产物纯度较高、完整性好，
产量大，为 mRNA 的分离提供了保障。用 Oligotex
mRNA Mini Kit 分离 mRNA，获得了高纯度的 mR-
NA。经过沉淀法浓缩后 mRNA浓度达到 0． 4 μg /#L，
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在 LD-PCR法合成双链 cDNA 的过程中，最大限度
降低了循环数，降低了扩增反应对真实表达丰度的
影响。
本研究采用了 SMART 逆转录技术，在反转录
进行到 mRNA的 5末端时，Super Script反转录酶促
成“模板跳跃”使特定的 SMART Ⅳ寡核苷酸接头添
加到 mRNA的 5端，逆转录酶跳移并继续转录至该
接头的末端，由于这种跳跃常发生在真核生物的帽
子结构，因此只有 5端完整的 mRNA 才能在文库中
得到富集［11］。cDNA文库的构建是研究生物体功能
基因组的重要技术手段，利用 cDNA 文库获得的
EST数据库在新型分子标记的开发［12 － 14］，新基因功
能研究和系统进化［15，16］中发挥了重要作用。通过
构建不同处理的差减文库，可以有针对性的对在特
定组织特定生理条件下的基因表达进行挖掘［17］。
相对于普通文库，全长 cDNA 文库不仅能提供完整
的 mRNA 信息，而且可以通过基因序列比对得到
mRNA剪接信息，可以对蛋白质序列进行预测以及
进行体外表达的研究。
文库的代表性和重组片段的完整性是影响 cD-
NA文库质量的关键因素，理论上每个 cDNA文库至
少应包含 3． 3 × 105个独立克隆，以保证有 99%的概
率从库中筛选出低丰度 RNA 的 cDNA 克隆［9］。本
研究构建的原始原始文库的滴度为 1． 3 × 106 PFU /
mL，库容量为 7． 2 × 105，扩增后文库滴度为 6． 0 ×
109 PFU /mL。噬菌斑 PCR 鉴定表明，重组率大于
90%，片段大小在 0． 25 － 2． 0 kb 之间的插入片段占
80． 4%。另外，本研究构建的刺参管足文库以 &
TriplEx2 为载体，除了具有噬菌体文库库容量大，代
表性强，易检测等优点，还保证了插入片段有以 3 个
不同的阅读框获得表达的机会。
3． 2 刺参管足 cDNA文库测序 EST分析
表达序列标签(expressed sequence tag，EST)是
指从特定组织来源的 cDNA文库中随机挑选克隆进
行 3或 5端测序后得到的部分 cDNA 序列，长度一
般在 300 － 500 bp左右，广泛应用于新基因的发现、
基因克隆、功能分析、基因作图等方面。
本研究测序结果处理后获得 72 条干净 EST 序
列，SeqMan 软件拼接获得 48 条 contig / singletons
(TUTs) ，获得注释的序列功能涵盖基础代谢、生长、
通信、蛋白表达、免疫及转运，而以基础代谢和蛋白
表达相关基因最多。其中具有最高表达丰度
(16. 7%)的 TUT2 与人类果糖二磷酸醛缩酶 A基因
(ALDOA)高度同源，ALDOA 的作用是在糖酵解途
径中将 1，6-果糖二磷酸分解为 3-磷酸甘油醛和二
羟丙酮磷酸。另外一个表达丰度较高(6． 9%)的
TUT7 与 NADH 脱氢酶第二亚基基因高度同源，
NADH脱氢酶是电子传递链 3 个质子泵中的第一
个，是一个大的蛋白复合体，在生物氧化的电子传递
中起重要作用，它能与 NADH结合并将 NADH上两
个高势能电子传递给辅酶 Q。这两个基因都参与能
量代谢，反映出在正常生理状态下刺参管足的能量
代谢非常活跃。刺参铁蛋白基因(TUT33)表达丰度
也比较高，铁蛋白的主要生理功能是储存机体中的
过剩铁，避免产生铁中毒和释放铁给需铁的细胞，用
于体内生物合成含铁的蛋白质或酶，同时还可以防
止铁双氧化过程中所产生的自由基带来的伤害。铁
蛋白除了参与体内铁的调节，还在 LPS 应激免疫中
发挥作用。在与刺参进化距离比较接近的海星、文
昌鱼的研究中发现 LPS 刺激可以引起铁蛋白表达
和翻译水平明显的升高［18，19］。但 Ramírez-Gómez
等［8，20］学者的研究发现海参铁蛋白基因的表达不
受 LPS刺激的影响，只是不能排除刺参铁蛋白基因
通过转录后水平的调节参与免疫作用的可能。另
外，刺参管足中铁蛋白表达丰度颇高可能与 NADH
脱氢酶 2(nad2)的高度表达是相关的，因为 NADH
脱氢酶的第二个辅基为含有铁原子的铁硫聚簇，而
刺参铁蛋白的主要作用即为调节铁元素的平衡和抗
氧化。TUT43 为刺参室管膜相关蛋白前体，室管膜
蛋白(Epd)最初在硬骨鱼类脑组织中发现，可能与
神经可塑性和再生相关，随后在两栖类、哺乳类及无
脊椎后口动物和原口动物中陆续发现了室管膜相关
蛋白(Epdrs)［21］。刺参 Epd基因在肠组织及再生肠
组织中获得鉴定［5］，本研究发现这一基因在管足中
同样表达，其功能有待进一步研究。
本研究获得 48 条 TUTs，具有同源性的 26 条序
列中 61． 5%为刺参已知序列，但多数功能并不清
楚，这是因为目前对刺参基因组的研究还处于起步
阶段，信息比较匮乏。虽然，目前刺参 EST 序列已
经有 7 669 条，但尚没有 unigene 基因序列。这也反
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映出刺参表达组学的研究还有很大发展空间，对现
有 EST数据的分析和利用尚不充分，有待进一步开
发。因此本研究中只在其他物种发现同源序列或没
有发现同源序列的刺参 EST 序列，都是寻找刺参基
因的重要资源。本研究对没有高度同源序列的
TUTs利用在线 ORF Finder 预测开放阅读框，并将
翻译产物用 InterproScan 进行功能域的查找，发现
UTU24 具有 60S ribosomal L32e结构特征、UTU34 具
有过氧化物酶活性位点、UTU35 具有 RP436 跨膜结
构域，而其它多数也都完整的 ORF及导肽和疏水区
结构特征。对于比较感兴趣的 UTU34，从序列上判
断具有完整开放阅读框，其 3端具有两个加尾信号
“AATAA”且 poly-A尾完整，5端开放阅读框上游同
一相位存在终止密码子，有可能为全长 cDNA。下
一步将进行 RACE 验证，并进一步预测其编码产物
和基因功能，而新基因的确定还需要 Northern 杂交
及编码产物蛋白分离鉴定等试验的佐证。相信随着
刺参文库构建及基因表达谱研究的深入，将有更多
的基因序列被发现和解释。
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(责任编辑 李楠)
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