全 文 ：生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN·研究报告· 2008年第3期
收稿日期:2007-12-17
基金项目:国家自然科学基金(30600520)
作者简介:崔静(1982-),在读硕士,主要从事乙肝的临床病毒学研究
通讯作者:张文露,Tel:023-68486780,E-mail:zhangwenlu_430@163.com
自 1973年 StanleyCohen等人首次获得体外重组 DNA的分子克隆[1],分子克隆的方法就广泛的应用于
分子生物学的科学研究中。在分子生物学的实验中筛选阳性克隆是常常碰到的工作,一般常用的方法为酶
切鉴定法和插入片段特异引物 PCR的方法,这两种方法只能筛选出阳性克隆并不能鉴定其插入方向,且
对短插入片段重组子筛选有一定的难度。而测序的方法又比较昂贵,不宜用于筛选实验,尤其筛选大量重
组子时昂贵费力。根据 DooleyS等人[3],Skinner DD等人[4]和 Michael K. Trower[5]介绍的方法加以修改,载体
多克隆位点两端的通用引物结合特异引物进行菌液 PCR方法来快速筛选和鉴定阳性克隆,结果优于传统
方法,并且弥补了传统方法的不足,能够有效鉴定片段插入方向,筛出非单克隆和鉴定短插入片段重组子,
达到节省时间且经济简便的目的。
1 材料和方法
1.1材料
结合通用引物快速简便鉴定阳性克隆的PCR方法
崔静 黄爱龙 张文露
(重庆医科大学病毒性肝炎研究所 感染性疾病分子生物学教育部重点实验室,重庆 400016)
摘 要: 通用引物与载体多克隆位点两端序列互补,将目的片段构建入载体pGEM-T Easy中,利用载体通用引物
M13F和M13R结合片段特异引物进行菌液PCR反应。用PCR产物电泳结果来筛选阳性克隆并鉴定目的片段插入方
向,同时能有效对短插入片段重组子进行筛选与鉴定。最终以 DNA测序结果来验证,与测序结果一致,显示通用引物
PCR方法对阳性克隆的筛选和鉴定优于传统酶切和普通PCR鉴定方法,能够弥补传统方法的不足,且简便快速,可作为
筛选和鉴定阳性克隆的有效手段。
关键词: 通用引物PCR鉴定 插入方向 短插入片段
Rapid and Convenient Method for Positive Clone Screening and
Identifying by PCR Using Universal Primers
Cui Jing Huang Ailong Zhang Wenlu
(Institute for Viral Hepatitis,Key Laboratory Molecular Biology on Infectious Diseases,Ministry of Education,Chongqing
Medical University,Chongq ng 400016)
Abstract: Constructing target gene into E.coli vector pGEM-T Easy and amplifying bacterium liquid PCR
reaction with universal primers,M13F and M13R,which are complemented with two terminal of vector multiple clone
site. The electrophoresis result can be used to screen positive clone and identify the orientation of inserted fragment,
especially to efficiently screen and identify short inserted fragment recombinants. Based on DNA sequencing method,
compared and checked the result with enzyme digestion and common PCR. Comparing with the traditional enzyme
digestion and common PCR,this new method can compensate the deficient of traditional methods. A rapid and simple
PCR-based method for screening and identifying positive clone is described.
Keywords: UniversalprimersPCR Identification Define orientation ofinserted fragment Short inserted fragment
生物技术通报Biotechnology Buletin 2008年第3期
1.1.1 质粒和菌种 pGEM-TEasy载体购自 promega公司;感受态 E.coliJM109由本实验室保存制备
1.1.2 引物 由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。多克隆位点两端的通用引物分别为:上游
M13F:5-TGTAAAACGACGGCCAGT-3,下游 M13R:5-GAGCGGATAACAATTTCACACAGG-3,插入片段 Insert200
的引物序列分别为:上游 P200F:5-TAACCCCTCAAGACCCGTTT-3,下游 P200R:5-CTCGGAAGGCTGAGGCAAGA-
3,短插入片段 Insert60的引物序列分别为:上游 P60F:5-CTCAGCCTTCCGAGCAGCTG-3,下游 P60R为:5-ACAA
AAATTAGCTGGGCGTG-3
1.1.3 主要试剂 dNTPs,TaqDNA聚合酶等 PCR反应试剂、DNAMarkers购自 takara公司;T4DNA连接酶
购自 NEB公司;SphⅠ和 SalⅠ限制性核酸内切酶购自 NEB公司,其他常规试剂按分子克隆实验指南(第 3
版)配制。
1.1.4 主要仪器 MastercylerPCR仪(德国 eppdorf公司);DYY-6C电泳仪(北京市六一仪器厂);Bioimaging
system凝胶成像系统(英国 Syngene公司);3100型测序仪(ABI公司)
1.2 方法
1.2.1 构建克隆 将目的片段和 pGEM-TEasy载体利用 T-A克隆原理[6,7]构建两种重组子 R200(插入片段
200bp)和 R60(插入片段 60bp)转化入感受态 JM109中涂布到含 Amp的 LB营养琼脂板,37℃培养 12h,随
机挑取 10个单克隆分别接种到含 Amp的 LB培养液中,37℃培养 12h。
1.2.2 筛选阳性克隆并筛出非单一克隆 用通用引物 M13F和 M13R的反应体系进行 PCR扩增。PCR反
应体系[2]:25μl反应体系中,10×Bufer1/10体积,dNTPs各 0.2mmol/L,引物各 10pmol,TaqDNA聚合物 1U,
MgCl22.5mmol/L,模板 0.3μl菌液。循环参数:94℃预变性 5min,94℃30s,56℃30s,72℃1min,经 30个循环
后,再 72℃延伸 10min。同时用环化空载体 pGEM-TEasy进行相同 PCR反应作为阴性对照。PCR反应产物
进行 1%琼脂糖凝胶电泳(3~5V/cm,30min),EB染色 20min,紫外灯下照相。并挑取其中一个阳性单克隆送
测序进行验证。
1.2.3 鉴定阳性克隆目的片段的插入方向 用通用引物 M13F和片段特异引物 P200F或 P200R的反应体系
进行 PCR扩增。PCR反应体系[2]:25μl反应体系中,10×Bufer1/10体积,dNTPs各 0.2mmol/L,引物各 10pmol,
TaqDNA聚合物 1U,MgCl22.5mmol/L,模板 0.3μl菌液。循环参数:94℃预变性 5min,94℃30s,56℃30s,
72℃1min,经 30个循环后,再 72℃延伸 10min。同时用环化空载体 pGEM-TEasy进行相同 PCR反应作为阴
性对照。PCR反应产物进行 1%琼脂糖凝胶电泳(3~5V/cm,30min),EB染色 20min,紫外灯下照相。
1.2.4 对短插入片段阳性克隆的筛选与鉴定 分别用通用引物 M13F和 M13R的反应体系和片段特异引
物 P60F和 P60R的反应体系进行 PCR扩增。PCR反应体系[2]:25μl反应体系中,10×Bufer1/10体积,dNTPs
各 0.2mmol/L,引物各 10pmol,TaqDNA聚合物 1U,MgCl22.5mmol/L,模板 0.3μl菌液。循环参数:94℃预变
性 5min,94℃30s,56℃30s,72℃1min,经 30个循环后,再 72℃延伸 10min。同时用环化空载体 pGEM-TEasy
进行相同 PCR反应作为阴性对照。将克隆的菌液提取质粒,用 SphⅠ和 SalⅠ限制性核酸内切酶 37℃酶切
1h。将 2种 PCR产物和酶切产物进行 1%琼脂糖凝胶电泳(3~5V/cm,30min),EB染色 20min,紫外灯下照
相。
2 结果与分析
2.1 筛选阳性克隆并筛出非单克隆
用通用引物进行菌液 PCR,空载体阴性对照扩增条带 253bp,阳性克隆扩增的条带应为 453bp,第 1泳
道模板为测序验证的阳性克隆,第 2泳道模板为环化空载体 pGEM-TEasy阴性对照。扩增产物与空载体扩
增条带相同的为阴性克隆。第 3泳道用通用引物进行菌液 PCR扩增出两条条带分别与阳性克隆和阴性对
照相同,表明该克隆为双克隆,可能是阴性克隆的污染。第 4泳道与测序验证的阳性克隆扩增条带相同为
阳性克隆(图 1)。
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2.2阳性克隆目的片段插入方向的鉴定
第 1,2泳道可见环化空载体 pGEM-T Easy用两种不同的引物组合 PCR(通用引物 M13F+特异引物
P200F或通用引物 M13F+特异引物 P200R)都不能扩增出条带,第 3泳道显示该克隆用通用引物 M13F+特异
引物 P200R结合可以扩增出约 300bp的产物,第 4泳道同一克隆用通用引物 M13F+特异引物 P200F组合扩增
时无扩增产物,说明为正向插入。经测序验证,结果完全一致(图 2,图 3)。
图 1 筛选阳性克隆并筛出非单克隆的电泳图
M:DL2000 DNA Maker 1:模板为为测序验证的阳性克隆
2:模板为环化空载体 pGEM-T Easy阴性对照 3:模板非单
一克隆 4:模板为阳性克隆 引物:M13F和 M13R
图 2 阳性克隆目的片段插入方向的鉴定
M:DL2000 DNA Maker 1:环化空载体 pGEM-T Easy用 M13F+
P200R扩增的结果 2:环化空载体 pGEM-T Easy用 M13F+P200F扩增
的结果 3:重组载体 pGEM-T Easy-200用 M13F+P200R扩增的结果
4:重组载体 pGEM-T Easy-200用 M13F+P200F扩增的结果
图 3 正向插入阳性克隆的测序峰图
2.3对短插入片段克隆的筛选和鉴定
第 1,2,3泳道是用载 体 通 用 引 物
M13F和 M13R进行 PCR扩增所得条带,
第 1泳道是空载体扩增产物条带大小约
253bp,第 2泳道扩增条带约 313bp比第 1
泳道大 60bp表明该克隆为阳性。第 3泳
道条带与第 1泳道大小相同,表明为载体
自连的阴性克隆,第 4,5,6泳道直接用特
异引物进行 PCR扩增,只有第 5泳道得到
产物约 60bp在电泳图中与引物二聚体接
近,在实际工作中常常不能辨认,对克隆
的筛选带来困难,用通用引物法扩增 PCR
得到片段可以明显与引物二聚体分开,且
大小与预计结果相符。第 7,8泳道分别为
环化空载体 pGEM-TEasy和重组子 pGEM-
T Easy-60质粒。第 9泳道为重组质粒
pGEM-T Easy-60用 SphⅠ和 SalⅠ酶切后
产物,明显可见载体条带约 3 000bp左右,
而在电泳图中用肉眼无法辨认出 100bp
左右的酶切片段条带(图 4)。
3 讨论
筛选阳性克隆通常需经提取质粒 DNA
后,进一步进行 PCR鉴定和酶切鉴定[1],
图 4 对短插入片段克隆的筛选和鉴定
M1:DL2000 DNA Maker 1:环化空载体 pGEM-T Easy用 M13F和 M13R
的扩增产物 2:阳性克隆用 M13F和 M13R的扩增产物 3:阴性克隆
用 M13F和 M13R的扩增产物 4:环化空载体 pGEM-T Easy用 P60F和
P60R的扩增产物 5:阳性克隆用 P60F和 P60R的扩增产物 6:阴性克隆
用 P60F和 P60R的扩增产物 M2:λ-EcoT14Ⅰdigest DNA Maker 7:环化
空载体 pGEM-T Easy质粒 8:阳性重组子 pGEM-T Easy-60质粒 9:
阳性重组子 pGEM-T Easy-60双酶切后的产物
崔静等:结合通用引物快速简便鉴定阳性克隆的PCR方法 101
生物技术通报Biotechnology Buletin 2008年第3期
一般需要 24h以上。实验证明,利用通用引物扩增重组克隆菌液以筛选阳性克隆是一种简便、快速、切实可
行的方法。可以筛选并鉴定目的基因的插入方向,避免非单一克隆的污染,尤其对短插入片段重组子能达
到有效筛选。其基本策略如图 5,合成两条与载体多克隆位点上游和下游序列互补的通用引物 UPF和
UPR,鉴定插入片段方向时用其中一条通用引物分别与插入片段特异性上下游引物 P1和 P2对重组子进
行 PCR扩增。上游通用引物与插入片段特异性引物组合能在电泳图上观察到扩增产物,由此可确定外源
DNA的插入方向。用本方法确定的阳性克隆及插入方向与测序结果相同可见通用引物法能有效筛选阳性
克隆并鉴定其插入片段的方向。反向引物另外,当挑取单克隆时被污染,如阴性克隆的污染,用特异引物进
行 PCR扩增时能够扩出条带而误认为阳性单克隆。然而用通用引物法则可以扩增出两条条带,可以得出
所挑克隆不纯,其至少含有两种克隆。另外当基因组或 PCR产物
污染时用插入片段特异引物进行 PCR扩增时也能够扩出与阳性
对照相同的假阳性条带,而通用引物法则不能扩增出条带。这就
达到有效的挑取纯的阳性单克隆避从而免污染的目的。对小片段
目的基因的筛选和鉴定方面,当插入片段小于 100bp直接用特异
引物 PCR得到产物在电泳中与引物二聚体接近对克隆的筛选带
来困难,用通用引物法扩增 PCR得到片段可以明显与引物二聚
体分开,清晰可辨。另外用酶切的方法也不能有效筛选短插入片
段重组子,因载体和插入片段分子数量相同时,分子大小决定了
其在电泳图中条带的亮度,短插入片段与载体大小相差悬殊,插
入片段往往从电泳图中无法辨认。
总之,通用引物法在筛选和鉴定阳性克隆上具有很强的现实意义,它使克隆的筛选鉴定工作用简单的
PCR和电泳方法就能完成,是一种简便有效的方法,可以为分子生物学实验带来很大的方便。
参考 文献
1 SambrookJ,RusselDW.分子克隆实验指南(第 3版).北京:科学出版社,2002.
2 CW迪芬巴赫,GS德维克斯勒.PCR技术实验指南(第 2版).北京:科学出版社,2004,6.
3 DooleyS,SeibT,etal.Electrophoresis,1993,14:662~663.
4 SkinnerDD,DenoyaCD.Microbios,1993,75:125~129
5 哈伍德 AJ著.盛小禹,等译.DNA及 RNA基本实验技术.北京:科学出版社,2002,242~244.
6 RoblesJ,DoersM.pGEM(r)-TVectorSystemstroubleshootingguide,PromegaNotes,1994,45:19~20.
7 ZhouMY,ClarkSE,Gomez-SanchezCE.Biotechniques,1995,19:34~35.
图 5 基本策略图
UPF表示上游通用引物 UPR表示下游通用引物
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