全 文 ：
研究报告

生物技术通报
BIOTECHNOLOGY
BULLETIN 2010年第 12期
甘肃现代肉羊新品种群羊 GH基因
外显子 1多态性与体重关联分析
张浩
朱爱文
马友记
李发弟
陈国宏
(甘肃农业大学动物科学与技术学院, 兰州 730070)


摘
要:
根据 GenBank发表的绵羊生长激素 ( GH )基因外显子 1的序列设计一对引物, 采用 PCR
SSCP技术分析 GH基
因外显子 1在甘肃现代肉羊新品种选育群羊中的单核苷酸多态性, 并与 3月龄前的体重进行关联分析。结果表明, GH 基因
外显子 1在新品种群羊中存在多态性, 检测到两种基因型 ( AA、AB), 其 301 bp处有一个 T /A突变和 305 bp处有一个 G /A突
变, 初生重、1月、2月、3月龄体重 AA、AB型都无显著性差异 (P > 0
05), 但 3月龄 AB型个体的体重相对于 AA型偏高, 由此
初步推断 GH基因可能是影响绵羊体重性状的主基因或与主基因相连锁,可用以对绵羊体重性状进行标记辅助选择。
关键词:
生长激素基因
绵羊
PCR
SSCP
遗传多态性
体重
Polymorphism of Exon 1 ofGrowthHormoneGene and ItsRelationship
with BodyWeight of the GansuModernMeat Sheep New Breed Population
ZhangH ao
Zhu A iw en
M aYouji
L i Fadi
Chen Guohong
(College of A nimal Science and T echno logy, Gansu Agricultural University, Lanzhou 730070)


Abstrac:t
A pa ir o f pr im ers was designed according to the sequence o f exon 1 of g row th horm one ( GH ) gene published in Gen

Bank. S ing le nuc leo tide po lymo rph ism ( SNPs) o f exon 1 of GH genew as detected in Gansu m odern mea t sheep new breed popu la tion
by po lym erase cha in reaction ( PCR )
sing le strand con fo rm ation po lymo rph ism ( SSCP) . The resu lts showed tha t the po lym orph ism w as
detected and had tw o geno type( AA, AB) in Gansu modern m eat sheep new breed popu la tion, wh ich have aT /A mutation in 301 bp and
G /A m utation in 305 bp o f exon 1 o f GH Gene. The co rre lation between these two genotypes w ith body w e ight w as ana lyzed, show ing
tha t the body w eigh t of b irth, onem onth, two m on th and threem onth w ere not sign ifican t w ith different geno types(P > 0
05), in add i

tion, AB a re h ighe r than AA. W e conc luded that GH gene possibly is m a jo r g ene or linked to am a jo r gene that effect the sheep body
w e ight tra its, and carries on them arker
assisted se lection to body w e ight tra its in sheep.
Key words:
G row th horm one gene
Sheep
PCR
SSCP
Genetic po lymo rph ism
Body we ight
收稿日期: 2010
04
21
基金项目:甘肃省自然科学基金 ( 096RJZA008) ,甘肃省农业生物技术项目 (GNSW
2007
04)
作者简介:张浩,男,硕士,研究方向:动物生产系统与工程; E
m ai:l haozh ang1972@ 163
com
通讯作者:马友记,副教授,研究方向:绵羊生产与畜禽生态; E
m ai:l yjm a@ gsau. edu. cn
生长激素 ( grow th hormone, GH )是由动物垂体
前叶分泌的一种蛋白类激素,由 190- 191个氨基酸
残基组成,其作用是促进动物生长和碳水化合物代
谢,促进葡萄糖的吸收、脂肪分解及核酸、蛋白质的
合成 [ 1, 2]。迄今为止, 已先后报道了大鼠、人、牛和
猪 [ 3]等动物的 GH基因或 cDNA克隆。成熟 GH分
子 N端氨基酸序列和 GH的 cDNA序列分析表明,
GH前体是由成熟激素及其 N端共价连接着 26个
左右氨基酸残基的疏水信号肽所构成, 编码 GH前
体的 mRNA约为 800个核苷酸,新合成的无活性的
GH前体必须除去 N端信号肽后才成为成熟分子而
显示生物学活性 [ 4 ]。生长激素 ( GH )基因作为生长
速度的候选基因,国内外学者已进行了不少的研究。
Yao等 [ 5]用 SSCP法在牛 GH 基因上检测到 6个突
变位点,其中两处突变与泌乳量显著相关; 王文君
等 [ 6]采用 PCR
RFLP法分析南昌白猪、大约克夏猪
生物技术通报 B iotechnology
Bulletin 2010年第 12期
GH基因的遗传变异,发现大约克夏猪 Apa
酶切突
变不同基因型与体重性状呈显著相关。Malveiro
等 [ 7]用 SSCP法检测到安哥拉山羊 GH基因 5个外
显子均存在多态性,其中外显子 4和 5中,不同基因
型与产奶量显著相关。有关牛、猪 GH 基因的研究
报道较多,但在甘肃现代肉羊新品种群羊中的研究
尚未见报道。
甘肃现代肉羊新品种选育群羊是用国外优质肉
羊品种无角陶赛特或波德代作父本, 小尾寒羊作母
本进行复杂育成杂交获得的适应甘肃地区生态环境
的新品种选育群羊,此类群羊具有生长发育快、繁殖
率高、肉用体型明显、耐粗饲、抗逆性强、适应性好等
特点。本研究根据绵羊 GH基因序列外显子 1设计
1对引物, 以甘肃现代肉羊新品种选育群羊为试验
材料, 采用单链构象多态 ( sing le strand conformat ion
po lymorph ism, SSCP)方法对在生长发育中起重要作
用的 GH基因进行单核苷酸多态性 ( sing le nuc leo

t ide po lymorph ism, SNP)检测, 拟检测该基因在新品
种群羊中是否存在多态性, 并对具有 SSCP多态性
的 DNA片段进行测序比较分析, 旨在寻找与生长发
育性状相关的遗传标记, 为提高新品种群绵羊的分
子标记辅助选择提供科学依据。
1
材料和方法
1
1
试验材料
试验动物来自甘肃省永昌肉用种羊场, 随机选
取具有生长发育记录的羔羊 82只。静脉取血
10 mL置于已经加入肝素的管中低温带回实验室,
- 20
保存备用。用苯酚 - 氯仿抽提法提取 DNA
干燥后并溶于 50
L TE溶液。放入冰箱 4
保存。
1
2
试剂
Taq DNA聚合酶、蛋白酶 K、dNTP、1
TBE、1

TAE、10% AP、TEMED和丙烯酰胺等均购自上海生
物工程有限公司; 100 bp DNA LadderM arker购自北
京鼎国生物技术发展中心。
1
3
引物设计及 PCR扩增
参照绵羊 GH 基因序列 ( GenBank 登录号:
X12546),按照引物设计的一般原理,利用 Prmi e5
0和
O ligo6
0软件设计引物, 由上海生物工程有限公司合
成。F: 5

CCAGTGGTCCTTGCATAAA
3
, R: 5

GTTCA

CATTCAGAAGCCCTA
3
。片段大小为 277 bp。PCR反
应体系为 20
L,包含: ddH 2O 14
4
L, 10
buffer 2
0

L, dNTP 0
4
L,上下游引物 1
0
L,基因组 DNA 1
0

L, Taq DNA聚合酶 0
2
L。PCR反应程序: 95
变性
5 m in, 94
45 s, 57
45 s, 72
45 s,共 35个循环,
72
延伸 10m in, 4
保存。PCR产物于 1%的琼脂糖
凝胶电泳检测,紫外成像系统观察。
1
4
SSCP分析
取 1
5
L PCR产物与 6
0
L的上样缓冲液
( 98%的甲酰胺, 0
025%的溴酚蓝, 0
025%的二甲
苯青, 10mmol /L EDTA, pH8
0, 2%甘油 )混合, 98

变性 10m in,迅速插入冰盒 5m in,于 12%非变性聚
丙烯酰胺凝胶 ( Acr
B is= 49
1 )电泳, 电压 120 V
过夜银染显色。
1
5
测序及序列分析
经 SSCP分析后, 选取纯合型个体的 PCR扩增
产物送上海生物工程有限公司测序, 测序结果采用
DNA star等软件进行分析比对。
1
6
数据统计
利用 SPSS 11
5软件统计各种基因型的分布
情况, 并检验基因型分布是否符合 H ardy
W einberg
平衡。同时, 调用 GLM程序, 利用最小二乘法拟
合线性模型,比较绵羊 GH基因不同基因型间体重
差异。
2
结果与分析
2
1
绵羊 GH基因 exon
1 PCR结果
PCR扩增绵羊 GH 基因 exon
1片段, 长度为
277 bp与预期的大小相符 (图 1), 且特异性良好, 可
以进行 SSCP分析, SSCP电泳结果见图 2。从图 2
可以看出, GH 基因 exon
1扩增片段存在单链核苷
酸多态性,产生 A和 B两个等位基因, 具有两种基
因型,依次为 AA、AB。
2
2
序列分析结果
为了确保测序碱基序列的正确性和一致性, 每
种基因型个体各测两次。如果两次结果完全一致就
可以确认测序的结果。利用 A lign、DNA star软件进
行序列比对,结果显示 GH基因 exon
1AA型与 Gen

Bank(登录号: X12546)公布的 GH基因碱基序列一
致, AB型与 AA型相比, 在 301 bp处 T突变为 A,
305 bp处 G突变为 A (图 3) ,该突变未引起氨基酸
变化,为沉默突变。
164
2010年第 12期 张浩等 :甘肃现代肉羊新品种群羊 GH基因外显子 1多态性与体重关联分析
图 1
GH基因 exon
1 PCR扩增产物
1, 2, 3, 5, 6, 7
AA型; 4
AB型
图 2
GH基因 exon
1的 SSCP电泳结果
图 3
GH基因 exon
1位点 AA和 AB
基因型核苷酸序列比对结果
2
3
基因型 (基因 )频率的分布
GH基因 exon
1基因型和等位基因频率以及适
合性 x2检验结果见表 1。由表 1可见, 等位基因 A
为优势等位基因。适合性 x2检验结果显示绵羊群
体未偏离 H ardy
Weinberg平衡 (P > 0
05)。
表 1
GH基因的等位基因频率和基因型频率
样本数 基因型频率 基因频率 x2 P
82
AA AB BB A B
0
9146
( 75)
0
0854
( 7)
0
0000 0
9573 0
0427 1
08 > 0
05
2
4
基因型与生产性能的关系
将扩增片段的不同基因型与初生重、1月龄重、
2月龄重、3月龄重性状进行关联分析。结果见表
2,初生重、1月龄重、2月龄重、3月龄重不同基因型
间的差异均不显著 (P > 0
05)。
表 2
不同基因型对体重的影响
基因型
样本量
体重 ( kg)
初生 1月龄 2月龄 3月龄
AA 75 3
33
0
62 8
57
1
05 16
68
1
064 22
73
0
56
AB 7 3
28
0
71 8
29
0
6 16
51
0
33 24
01
0
34
3
讨论
GH是动物体内重要的调节因子之一。国内许
多学者已对其做了大量的研究, 一些研究表明, GH
具有加快促进肌肉和骨骼的生长、降低脂肪沉积、增
加产乳量、提高瘦肉率等功能,特别是对哺乳动物生
长发育具有重要的影响。闵令江等 [ 8]对山羊 GH基
因 26- 239 bp扩增片段进行了多态性分析,结果表
明, 不同基因型与山羊体重存在一定的联系,由此初
步推断该位点可能与山羊体重性状的主效基因或
QTL相连锁,对山羊体重性状可以进行标记辅助选
择。刘铮铸等 [ 9]试验表明, 仔鹅 GH基因内含子 3
存在 7个位点,不同基因型与体重和屠体性状具有
关联, BB基因型为优势基因型。赵丽莉等 [ 10]试验
表明, GH基因 Apa I酶切位点多态性对金华猪产胎
的总产仔数、产活仔数和初生窝重都有极显著的影
响 (P < 0
05)。利用分子标记技术对此基因与重要
经济性状相关性的研究。由此初步推断绵羊生长激
素基因可能是影响绵羊体重性状的主基因或与主基
因相连锁的基因。
研究发现绵羊生长激素基因在第 1外显子存在
多态性,基因型效应对绵羊不同月龄的体重没有显
著的影响,但 3月龄 AB型个体的体重相对于 AA型
偏高,由此推断生长激素基因可能是影响绵羊体重
165
生物技术通报 B iotechnology
Bulletin 2010年第 12期
性状的主基因或与主基因相连锁, 可用以对绵羊体
重性状进行标记辅助选择。当然, 据其它报道资料
来看, GH基因多态性还与其它经济性状有一定的
关联, 如产奶量、屠宰率、瘦肉率、料肉比等。因此,
还有待扩大绵羊的样本量,并结合屠宰性能测定,分
析影响绵羊生长发育性状和肉质性状的其它遗传标
记位点,为分子标记辅助选择提供可靠的依据。
对于绵羊种群的产肉性能未进行量化研究,是
本研究存在的不足之处,以后应补充产肉指标,同时
增加产奶量、体质量、抗逆性、产羔数等相关的经济
性状, 开展重要经济性状与不同种群在此生长激素
片段上优势基因频率的相关性研究, 以期挖掘此位
点,将其作为绵羊重要分子标记,在绵羊育种实践中
得以应用。
参 考 文 献
[ 1] 王旭东,侯金琼,何振东. GH系统对动物代谢调节的研究进展
(上 ) .草食家畜, 1991 ( 1) : 49
52

[ 2] 王旭东,侯金琼,何振东. GH系统对动物代谢调节的研究进展
(下 ) .草食家畜, 1991 ( 2) : 56
59

[ 3] Woych ick RP, Cam per SA, Lyon s RH, et a.l C lon ing and nucleotide
sequencing of the bovine grow th horm on e gene. Nu cleic Acids Re

search, 1982, 10: 7197
7210

[ 4] L ingappa VR, Devillers A, B lobelG. Nascen t prehorm one are in ter

m ed iates in the biosyn th es is of au thent ic bov ine pitu itary grow th hor

m one and p rolactin. Proc Natl Acad SciUSA, 1977, 74: 242
246

[ 5 ] Yao J, Aggrey SE, et a.l Sequen ce variat ions in the bovine grow th
h orm one gene characterized by s ingle strand con form at ion polym or

ph ism ( SSCP ) analys is and their associat ion w ith m ilk p roduction
tra its inH olsteins. Gen et ics, 1996, 144 ( 4) : 1809
1816

[ 6] 王文君,陈克飞,任军,等.生长激素基因 ( GH )多态性与猪部分
生产性能的关系.遗传学报, 2002, 29 ( 2) : 111
114

[ 7] M alveiro E, Pereira M, et a.l Polym orph ism s at the five exons of the
grow th horm one gen e in the algarvia goat: possib le associat ion w ith
m ilk traits. Sm all Rum inan tR esearch, 2001, 41: 163
170

[ 8] 闵令江,李美玉,孙国强,等.生长激素基因多态性与山羊体重性
状的关系.遗传学报, 2005, 32 ( 6) : 650
654

[ 9] 刘铮铸,陈清,程金花,等.仔鹅 GH内含子 3多态性及其体重和
屠体性状的关联分析.畜牧兽医学报, 2008, 39( 4) : 443
448

[ 10] 赵丽莉,聂光军,郭晓令,等.金华猪生长激素基因的多态性及
其对经济性状的影响.中国畜牧杂志, 2006, 42( 5 ) : 8
10

(上接第 147页 )
[ 11 ] 胡重江,吴风瑞,刘智皓,等. 南方鲇 Vasa基因两种亚型 cDNA
的克隆及其表达.动物学报, 2008, 54( 6 ): 1051
1060

[ 12 ] 隋娟,张志峰,邵明瑜, 等.刺参 V asa
like基因克隆及其在组织
中的表达分析.中国水产科学, 2008, 15 ( 3) : 407
413

[ 13 ] Bust in SA. Absolu te quan tif icat ion ofmRNA us ing real
t im e reverse
transcript ion polym erase chain reaction assays. J M ol Endocrin o,l
2000, 25( 2) : 169
193

[ 14 ] Fab ioux C, Pouvreau S, L eroux F, et a.l Th e oyster vasa
l ike gene: a
specif ic m ark er of the germ l ine in Cra ssostrea g iga s. B ioch em B ioph
Res Co, 2004, 315( 4 ): 897
904

[ 15 ] H alm S, M art inez
Rod rigu ez G, Rodriguez L, et a.l C lon ing, ch arac

terisation, and exp ress ion of th ree oestrogen receptors ( ERa lpha,
ERbeta1 and ERbeta2) in th e Eu ropean sea bass, D icentrarchu s la

brax. Mol C ellEndocrino,l 2004, 223 ( 1
2 ) : 63
75.
[ 16 ] O rd
sM C, Abol lo E, Costa M, et a.l Mo lecular clon ing and exp res

s ion ana lysis of in terferon regu latory factor
1( IRF
1) of turbot and
sea b ream. Mo lecular Imm unology, 2006, 43( 7 ) : 882
890

[ 17 ] Ju liano CE, V oron ina E, S tack C, et a.l Germ l ine determ inan ts are
not localized early in sea urch in d evelopm ent, bu t do accum u late in
the sm allm icrom ere lineage. Dev B io,l 2006, 300( 1) : 406
415

[ 18 ] H amdouna AM, C herr GN, Roepke TA, Epel D. Activation ofm u lt i

drug efflux transporter activity at fert ilization in sea u rch in embryos
(S trongylocentrotu s purpu ratus) . Dev B io,l 2004, 276( 2) : 452
462

[ 19 ] 周遵春,包振民,董颖,等. MYP基因在中间球海胆及杂交海胆
生殖腺不同发育时期的转录表达差异. 遗传, 2008, 30 ( 11 ):
1453
1458

[ 20 ] 段晶晶,李霞,周伯文,等.仿刺参

act in基因的克隆及在各组
织中的表达.大连水产学院学报, 2009, 24 ( 2) : 176
180

[ 21 ] 仲晓丽.皱纹盘鲍 (H a liotis D iscu sH anna i Ino )微量金属元素锌
及其与铜的交互作用的营养生理研究 [ D] .青岛:中国海洋大
学, 2009

[ 22 ] 纪丽凤,程德金,刘长伟,等.用改良的 TRIZOL法快速提取仿刺
参和中间球海胆的总 RNA.大连水产学院学报, 2009, 24( S1 ):
53
55

[ 23 ] O lsen LC, A as land R, Fjose A. A vasa
lik e gen e in zebraf ish ident i

fies pu tat ive prim ord ial germ cel.l M ech an Dev, 1997, 66 ( 1
2 ):
95
105

166