全 文 ：技术与方法
生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2010年第 8期
生物技术在黄瓜研究中的应用
韩建明 王颖
(洛阳师范学院生命科学系,洛阳 471022)
摘 要: 从组织培养、相关基因分子标记、遗传图谱构建、种质资源亲缘关系、品种纯度鉴定和基因工程等方面, 综述了
黄瓜生物技术应用研究进展,并对存在的问题和应用前景进行了讨论。
关键词: 生物技术 黄瓜 应用研究
Application of B iotechnology on Cucumber
Han J ianm ing W ang Y ing
(D epartm ent of Life Science, Luoyang N ormal University, Luoyang 471022)
Abstrac:t This paper rev iew ed the progress in study o f tissue cu lture, relative g ene mo lecu la rm arkers, genetic map, ge rmp lasm,
genetic re lations, identification o f seed pur ity and gene eng ineering in cucum ber, and the ex isting prob lem s and prospects w ere a lso dis
cussed.
Key words: B iotechno logy Cucumber Application
收稿日期: 20100511
作者简介:韩建明,男,博士,主要从事遗传育种及生物技术研究; Em ai:l lyh jm 2000@ yahoo. com. cn
黄瓜栽培面积大, 分布地域广, 鲜食加工咸宜,
是人们喜食的主要蔬菜之一,在蔬菜周年生产中占
有重要地位。黄瓜育种从常规品种选育, 有性杂交
育种, 诱变育种到杂种优势利用,使黄瓜品种的生产
潜力不断提高。随着 20世纪 70年代后期生物技术
的迅速发展,作物品种改良获得了前所未有的发展。
利用组织培养技术, 植物细胞工程技术和转基因工
程技术培育的许多农作物品种已经在生产中应用,
为社会和经济的发展做出了重要贡献。现从组织培
养、相关基因分子标记、遗传图谱构建、种质资源亲
缘关系、品种纯度鉴定和基因工程等方面对黄瓜生
物技术的应用研究做简要概述。
1 黄瓜组织培养
在黄瓜器官培养方面以黄瓜子叶为外植体的研
究较多。K im等 [ 1]认为子叶大小可能影响外植体内
的内源激素水平,进而对不定芽的诱导产生影响,而
且黑暗处理可显著降低黄瓜子叶节直接不定芽的诱
导率。而 Curuk等 [ 2]认为黄瓜子叶节不定芽诱导率
在黑暗和光照条件下基本相同,导致研究结果并不
一致的原因可能与不同黄瓜品种的外植体对于光照
条件的要求存在差异有关 [ 3 ]。侯爱菊等 [ 4 ]认为外
植体类型、基因型及植物生长调节剂对再生频率均
有显著影响, 而子叶节是最佳的外植体类型; 6BA
单独存在即可诱导产生丛生芽, 0. 5 mg /L最佳。贾
金生等 [ 5]认为带柄子叶比下胚轴和不带柄子叶的
再生率高,是比较理想的外植体材料;添加 0. 5 mg /
L AgNO3可以促进不定芽发生, 5- 6 d苗龄的外植
体分化再生频率较高;高频率不定芽诱导分化培养
基为 MS+ IAA 0. 6 mg /L+ 6BA 0. 5 mg /L+ AgNO 3
0. 5 mg /L; 不定芽伸长的培养基为 MS + IAA
10 mg /L+ 6BA 1. 0 mg /L + GA 3 1. 0 mg /L + Ag
NO3 0. 5 mg /L; 高效生根诱导培养基为 MS+ IAA
02mg /L+ NAA 01 mg /L。而李永辉等 [ 6 ]认为下胚
轴比子叶效果好,其最佳愈伤组织诱导与生长培养基
为MS+ NAA 04- 0. 5mg /L+ CPPU 005- 020mg /
L;最佳芽诱导培养基为 MS+ CPPU 0. 1mg /L。
不同基因型、不同生长调节剂可能是导致不同
外植体培养结果不一致的原因。赵宇瑛等 [ 7]认为
在以 津春四号 !幼龄子叶为外植体培养再生完整
植株时,只需极低浓度的 NAA即能诱导大量愈伤组
2010年第 8期 韩建明等:生物技术在黄瓜研究中的应用
织;在 0. 05- 0. 10mg /L浓度范围内随 NAA浓度的
提高, 出愈率提高, 愈伤组织增殖加快; M S + 6BA
1. 0mg /L+ NAA 0. 10mg /L为较适宜的愈伤组织诱
导培养基; M S + 6BA 1. 0 mg /L+ IAA 0. 05- 0. 10
mg /L为较适宜的芽诱导培养基; 1 /2M S+ NAA 0. 5
mg /L培养基对生根诱导效果较好。冯嘉玥等 [ 8]认
为 6BA对 农城 3号 !黄瓜子叶节不定芽诱导起关
键作用, IBA不利于黄瓜不定芽的诱导, 且 MS+ 6
BA 2. 0mg /L培养基是 农城 3号!黄瓜通过子叶节
进行不定芽诱导再生植株的最佳培养基。
在诱导离体子叶开花方面, 周俊辉等 [ 9]认为在
1 /2MS培养基中附加 6BA 0. 10 mg /L能显著提高
离体黄瓜子叶的开花率, W hite培养基中附加 2. 00
mg /L的 KT下开花率也有明显提高, 但植株矮小、
瘦弱, 整株变黄,甚至透明化, 长势极差。同浓度的
L丙氨酸和 L酪氨酸均明显促进黄瓜子叶开花,且
开花早;而甘氨酸对黄瓜子叶开花则有一定的抑制,
开花率低。王首锋等 [ 10 ]认为用 10- 5 mo l/L甲硫氨
酸浸种处理显著促进离体子叶成花; 离体子叶培养
物的花芽分化力与子叶离体前的子叶 /苗的鲜重比
呈显著的正相关性。黄作喜等 [ 11]认为在 MS培养
基上培养离体黄瓜子叶时添加 Spd和 IAA对雌花
诱导有显著协同作用,且适当提高昼夜温差、培养基
中 N素和 pH值有利于黄瓜子叶的雌花诱导。
雷春等 [ 12]通过射线辐射花粉授粉并结合胚培
养, 从 3个基因型中获得了单倍体植株。陈劲枫
等 [ 13]研究了异源三倍体黄瓜的离体繁殖; 在 MS+
2. 2 mg /L 6BA和 MS+ 3. 0 mg /L KT + 0. 2 mg /L
NAA培养基上诱导不定芽的增殖系数分别为 6. 53
和 6. 63;丛生芽在 MS+ 0. 2 mg /L 6BA的培养基上
伸长, 大约 10 d后取整齐一致的芽用于生根, 在 1 /2
M S+ 0. 2 mg /L IBA上生根率达 91. 7%。娄丽娜
等 [ 14]以单性结实果实中的种胚进行胚培养时, 发现
果实生长时间、植株单性结实座果率对果实形成种
子及诱导胚成苗均有影响, 并且培养基中高浓度的
6BA对诱导胚产生单倍体植株具有较好的效果。
谢淼等 [ 15]认为黄瓜花药培养中小孢子最佳培
养时期为单核中后期, 取蕾标准为: 花莆长度 0. 90
- 1. 50 cm, 绿色, 瓣尖未张开, 花药白绿色或淡绿
色。刁卫平等 [ 16]采用多种分化培养基对黄瓜未授
粉子房培养形成的胚进行培养, 获得稳定纯合的同
源四倍体黄瓜材料。詹艳等 [ 17]以 10个不同基因型
黄瓜为试材进行游离小孢子培养, 认为低温预处理
有利于胚状体的诱导, 4∀ 预处理 2- 4 d为宜,以处
理 2 d的胚状体产量最高。
2 黄瓜相关基因的分子标记
目前,在黄瓜上相关基因分子标记技术主要有:
RAPD、AFLP、SRAP、SSR和 SCAR。
黄瓜抗病性基因标记方面, Thomas等 [ 18]筛选
出 5个与黄瓜霜霉病基因 ( dm )紧密连锁的 RAPD
标记; G14800、X151100、AS5800、BC5191100和
BC5261000, 其中 G14800与 BC5191100标记距
离最近, 为 9. 9 cM。 Park等 [ 19]对 Prsv2和 zym两
种抗性位点 (分别抗 PRSVW和 ZVMV )进行标记
筛选, 找到一个与 zym共分离的 AFLP标记 E15 /
M 47F197;另有 3个 AFLP与 zym以 5. 2 cM连锁,
而 Prsv2和 zym相距 2. 2 cM。张桂华等 [ 20]以黄瓜
抗白粉病母本 Q9和感白粉病父本 Q10及组合 (津
春 3号 )的 F2分离群体为试材, 采用 BSA法用 AFLP
标记了抗白粉病相关基因。
黄瓜性别控制方面,陈劲枫等 [ 21 ]利用 RAPD技
术按 BSA法对黄瓜性别表型分离群体进行 PCR扩
增, 检测出约 1 000 bp全雌性的特征带。娄群峰
等 [ 22]筛选了与黄瓜全雌性位点连锁 TG /CAC234,
该标记与全雌性位点的连锁距离在 6. 7 cM,并将该
标记成功转化为 SCAR标记 SA166。陈惠明等 [ 23]
以不同性别类型的黄瓜为研究材料将黄瓜雌性性状
主控基因 CsACS lG特异的 SCAR标记定位在第 10
连锁群上。李效尊等 [ 24]用 RAPD标记把侧枝基因
( lb)定位在 LG2上,全雌基因 ( f)定位在 LG8上。
潘俊松等 [ 25 ]利用 SRAP标记将始花节位性状控制
基因定位在第 1X连锁群上。时秋香等 [ 26]采用 SSR
及 SCAR分子标记技术,获得了 3个与 M基因紧密
连锁的标记 SSR23487、SCAR123和 SSR19914,它们
与 M基因的遗传距离分别为 0. 28、0. 94和 320
cM,两侧标记 SSR23487和 SCAR123将 M基因定位
在 1. 22 cM的遗传区间内。
另外,顾兴芳等 [ 27]运用 AFLP技术, 采用集群
分析法 ( BSA )找到了与苦味基因连锁的两个显性
AFLP标记: E23M 66101和 E25M 65213。
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生物技术通报 B iotechnology Bulletin 2010年第 8期
2. 1 遗传图谱的构建
遗传图谱的构建可为基因定位与克隆及基因组
结构和功能的研究打下基础。Kennard[ 28]等利用
RFLP、RAPD、同工酶、形态和抗病性所产生的标记,
构建了世界上首张黄瓜遗传图谱, 包含 58个位点,
分属 10个连锁群,覆盖的基因组总长度为 766 cM,
标记间平均距离为 21 cM。张海英等 [ 29]利用黄瓜
欧洲温室生态型栽培种 140份重组自交系构建了由
234个标记组成的黄瓜连锁图谱, 其中包括 141个
AFLP标记、4个 SSR标记和 89个 RAPD标记, 覆盖
基因组 727. 5 cM, 平均图距 3. 1 cM。李效尊等 [ 30]
利用 F2代群体,构建了包括 79个 RAPD标记, 分属
9个连锁群, 总长度 1110. 0 cM, 平均间距为 13. 7
cM的黄瓜分子遗传框架图谱。Martin等 [ 31]构建了
包含 30个 ISSR标记 32个 SRAP标记、分属 7个连
锁群、覆盖基因组长度 992. 2 cM, 平均密度 16. 0 cM
的遗传图谱。Nobuko Fukino等 [ 32 ]构建了包含 120
个 SSR标记和 6个 SCAR标记, 覆盖 625. 7 cM, 包
含 8个连锁群的遗传图谱。Ren等 [ 33 ]构建了一张
目前最为饱和高密度黄瓜 SSR遗传图谱,包含 7个
连锁群、995个 SSR标记、覆盖基因组 573 cM、平均
密度为 0. 6 cM,标记基本均匀分布, 只有 4个区域
标记成簇分布。应用 F ISH 分析已确定了各连锁群
间和黄瓜染色体组的关系。
2. 2 种质资源亲缘关系的研究
分子标记所控测的是基因组 DNA水平的差异,
可用于品种资源的鉴定与保存、研究作物起源与发
展进化、亲缘关系等。李锡香等 [ 33]采用 AFLP分子
标记技术, 通过聚类分析将 70份种质分为三大组
群,即西双版纳黄瓜 (Cucum is sativus L var. x ishuang
bannanesis Q i etYuan)组群, C. sa tivus var. hardw ickii
野生黄瓜组群和栽培黄瓜组群。西双版纳黄瓜与栽
培黄瓜的距离最远,与野生黄瓜次之。按一定的遗
传距离可以将中国和外来栽培种质分开。大多数华
南型和华北型种质归属于不同的亚组。张桂华
等 [ 34]对 23份不同来源的黄瓜材料进行了 AFLP分
析,认为野生黄瓜和栽培黄瓜之间的亲缘关系较远,
AFLP标记的分类结果与材料的主要性状特点基本一
致。司旻星等 [ 35]利用 18个 SSR标记和 3个 SCAR
共显性标记,把 177份不同生态类型的黄瓜种质资
源聚分为 5大类,大部分旱黄瓜被划分在第 1类中;
多数的华南类型和加工型黄瓜被划分在第 2类中;
Concombre vert long和西双版纳本地山黄瓜被单独
划为第 3类;收集于韩国和美国的种质为第 4类; 大
部分华北类型种质为第 5类。欧洲温室型没有单独
被划出来。王佳等 [ 36 ]利用 ISSR技术对 46份黄瓜
材料分析,认为总体上来自于同一生态型的多数资
源可以聚在不同的类或亚类中。穆生奇等 [ 37]利用
SSR引物把 59份黄瓜材料聚为 7大类群:第 1类包
含 6个欧洲温室型材料,全为无刺瘤类型;第 2类是
4个美国类型种质,属于小果型材料;西双版纳黄瓜
D59单独聚为第 3类;疑为华南型种质的 D38,单独
聚为第 4类,其果实为乳白色;第 5类包括 D13及其
父本 D39,两者含有欧洲和华北血缘; 第 6类为叶色
突变材料 D28, 是欧洲型和华北型黄瓜的后代; 第 7
类包括 33个华北型材料、7个华南型材料和 4个日
本型材料。庄飞云等 [ 38]采用 RAPD方法, 通过 UP
GMA聚类分析, 遗传距离 0. 37为阀值,把 23份黄
瓜材料归为黄瓜、近缘野生种、种间杂交种及甜瓜亚
属种 4类。陈劲枫等 [ 39]采用 SSR和 RAPD两种分
子标记对黄瓜属 22份进行聚类分析, 结果分为两
群: CS群 (黄瓜、西南野黄瓜 C. sativus var. hardw ick
ii、C. hy tivus及野黄瓜 C. hy strix )和 CM 群 (甜瓜、菜
瓜 C. melo var. conomon、野生小甜瓜 C. melo ssp.
agrestis及非洲角黄瓜 C. metu lif erus)。
2. 3 品种纯度鉴定
应用 RAPD技术直接把种子的 DNA作为检测
对象, 具有很高的准确性、稳定性和重复性。同时,
该方法具有快速 (数小时或数天 )、简便、成本低、在
苗期或种子阶段就可以鉴定品种纯度的特点 [ 40]。
Matsuura等 [ 41]发现,利用 RFLP分析可以快速检测
黄瓜杂交一代品种的纯度。邓义才等 [ 42]用 RAPD
技术从 40个随机引物中筛选出 2个引物, 准确、快
速检测了 早春 3号 !黄瓜杂种的纯度。孙敏等 [ 43]
从 102个 RAPD引物中筛选出应用于黄瓜种子纯度
鉴定的引物 32条,并建立了应用于鉴定亲本和杂交
种子的 RAPD指纹图谱。而 Truska等 [ 44]在分析了
3个黄瓜亲本材料的 RAPD多态性后发现黄瓜多态
性差, 认为 RPAD分析不适于验证黄瓜杂交种的
纯度。
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2010年第 8期 韩建明等:生物技术在黄瓜研究中的应用
分子标记技术还可以检测种子活力。黄瑶
等 [ 45]采用 RAPD技术分析了 揭阳大吊瓜 !黄瓜种
子经 ( 58 # 1) ∀ 处理后的活力情况, 认为热水老化
后的种子其 DNA受到损伤, 老化时间越长, DNA损
伤越严重。
3 黄瓜基因工程技术
自 1983年首批转基因植物 (烟草、马铃薯 )问
世以来,植物基因工程技术得到了迅速发展。利用
这项技术,可以培育抗病毒、抗虫、抗除草剂、抗逆境
(旱涝、盐碱、低温 )作物品种, 以及进行品质改良,
增加作物可食部分的营养成分。
黄瓜基因克隆方面, R asmussen等 [ 46 ]从黄瓜叶
片中克隆了具有系统获得性抗性的过氧化物酶 ( a
cidic perox idases)基因。李金鑫等 [ 47]克隆出了与黄
瓜抗霜霉病相关的基因片段。杜栋良等 [ 48]从新泰
密刺黄瓜的幼叶中克隆得到长为 1 018 bp的黄瓜磷
脂酶 D基因 cDNA片段。刘春香等 [ 49]从黄瓜叶片
组织中获得脂肪酸去饱和酶基因 ( CsFAD)。江彪
等 [ 50]从黄瓜属野生种酸黄瓜 (Cucum is hy strix Chakr)
和栽培黄瓜 (Cucum is sativus L. )中克隆了 Ty lcop ia
类逆转座子逆转录酶序列。Chen等 [ 51 ]克隆了黄瓜
ACC基因。Wang等 [ 52]克隆了黄瓜果实的脂加氧
酶。同时笔者采用同源克隆法克隆到了黄瓜 Vc合
成关键基因 GLDH (待发表 )。
黄瓜转基因方面, Denn is等 [ 53]把 CMV外壳蛋
白基因转入黄瓜植株后病毒感染率为 35%, 而非转
基因植株感染率为 62%。N ish ibayash i等 [ 54 ]通过导
入 CMVO cp基因, 使黄瓜产生对 CMV 的抗性。
Tabe i等 [ 55]把水稻几丁质酶基因转入黄瓜中, 从而
提高了黄瓜对灰霉病的抗性。金红等 [ 56]获得了具
有抗除草剂基因 bar黄瓜转基因植株。
黄瓜遗传转化其它方面,方丽等 [ 57]建立并优化
了农杆菌介导转化黄瓜炭疽菌 ( Colletotrichum lage
narium )获得 TDNA 插入突变体体系。张文珠
等 [ 58]采用农杆菌介导法和花粉管通道法成功获得
抗虫基因 EQKAM黄瓜。李泠等 [ 59 ]以黄瓜子叶为
外植体,以 pEZTACS1为中间载体,利用优化的 S52
诱导分化培养基 MS+ BA 2. 0 mg /L+ ABA 2. 0mg /
L+ AgNO3 2. 0 mg /L进行农杆菌介导获得抗性再
生苗。
另外, Lee[ 60]等用农杆菌把木薯的 CuZnSOD基
因 (mSOD1)介导转化到黄瓜中, 结果表明, mSOD1
基因在果实中高度表达,而在叶片中表达水平较低,
而且转基因黄瓜中 SOD的活性是非转基因植株中
的 3倍。苏绍坤等 [ 61 ]将单性结实基因 iaaM以农杆
菌介导法导入到东农 649品种黄瓜子叶节中, 经过
不定芽诱导和生根等过程获得了转基因株系。刘爱
荣等 [ 62]以黄瓜品种 中农 15!子叶外植体为试料,
绿色荧光蛋白 GFP基因为报告基因,利用农杆菌介
导的遗传转化法将构建的激活表达标签 pDsBar导
入黄瓜,获得转基因黄瓜群体。赖来等 [ 63 ]通过叶盘
转化法,将从黄瓜中克隆到的 MADSbox同源基因
CSMADS06基因, 转化到不同品系的黄瓜 S06和
S52中。王翠艳等 [ 64]将 floral d ip法用于黄瓜遗传
转化并获得成功。
4 讨论与展望
目前生物技术在黄瓜应用上取得了重大进展,
但还存在一些问题。如黄瓜抗病性标记较少; 黄瓜
遗传图谱使用稳定的、重复性强的分子标记较少,而
稳定性较差的 RAPD标记较多; 利用永久性作图群
体、可通用共享的遗传图谱还较少;遗传图谱还需进
一步整合;商业上应用转基因黄瓜品种还较少。由
于黄瓜的遗传基础狭窄, 还需利用生物技术创造黄
瓜新种质,从而拓宽黄瓜遗传基础。可以预测,现代
生物技术为黄瓜的遗传育种开辟了广阔、诱人的前
景, 它使常规手段在黄瓜品种改良中无法解决的问
题得以解决,将加速黄瓜品种选育的进程。
参 考 文 献
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