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研究报告

生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2010年第 10期
牦牛 ZP3基因的克隆及蛋白质结构的预测
徐华伟  字向东  黄磊  陈达文  穆晓琨  王红梅
(西南民族大学高原动物遗传育种与繁殖教育部共建重点实验室,成都 610041 )
  摘  要:  本研究对牦牛 ZP3基因的编码区进行了克隆, 在此基础上对 ZP3蛋白的分子结构预测, 为研究牦牛受精生物
学提供基础。根据 GenBank中普通牛的 ZP3核苷酸序列设计特异性引物, 以牦牛卵巢组织总 RNA为模板, 通过 RT
PCR技术
扩增牦牛 ZP3基因 cDNA序列 ( GenBank登录号为 GQ856646),利用 DNAMAN生物软件进行核苷酸和氨基酸序列分析、蛋白
质专家系统 ExPASy进行 ZP3蛋白质分子结构预测。结果表明, 扩增出的牦牛 ZP3基因编码序列长 1 266 bp, 编码 421个氨基
酸。牦牛与牛、猪、狗、人、鼠和鸡 ZP3基因核苷酸相应序列的同源性分别为 98. 42%、96. 73%、79. 67%、78. 71%、69. 15%和
56. 61% , 氨基酸同源性分别为 98. 10%、83. 85%、74. 24%、70. 26%、62. 62% 和 46. 12% , 符合物种进化规律。预测的 ZP3蛋白
二级和三级结构显示它是一个具有 22个氨基酸信号肽的亲水性

桶状跨膜蛋白。牦牛 ZP3基因编码区的成功克隆, 为进一
步研究该基因的结构与功能及其在受精过程中的作用提供了基础。
关键词:  牦牛  ZP3基因  克隆  分子结构
Cloning of ZP3 Gene and Prediction of ZP3 Protein Structure in Yak
Xu Huaw ei Z iX iangdong Huang L ei Chen Dawen M u X iaokun W angH ongm ei
(TheK ey Laboratory of P lateau Animal Genetics and Breeding, M inistry of Education,
Southw est University forN ationalities, Chengdu 610041)
  Abstrac:t  The objectives o f this studyw ere to clone the coding reg ion of ZP3 gene and to pred ic t ZP3 pro te in structure in o rde r to
prov ide a theoretical bas is for the study of fertiliza tion b io logy in the yak. The spec ific prim ers w ere designed accord ing to reference se

quence o fBo s taurus in GenBank. U s ing the tota lRNA extrac ted from yak ovar ian tissue as temp la te, cDNA sequence o f ZP3 gene of
yak was cloned by RT
PCR. The nuc leo tide and am ino ac id sequences w ere ana lyzed using DNAMAN softw are and the structure of ZP3
prote in was predicted using ExPASy. The cod ing reg ion of ZP3 gene in yak was 1 266 bp long and encoded 421 am ino ac ids. Nuc leo tide
sequence sim ilarities o f the ZP3 gene in yak compared to cattle, p ig, dog, hum an, m ouse and chicken w ere 98. 42% , 96. 73% ,
7967% , 78. 71% , 69. 15% and 56. 61% , respectiv ely. Am ino ac id sequence sim ilarities o f the ZP3 prote in in yak w ere 98. 10% ,
8385% , 74. 24% , 70. 26% , 62. 62% and 46. 12% , respectiv ely, o f tho se in cattle, p ig, dog, hum an, m ouse and chicken, which w ere
in the evo lutionary order of these spec ies. The predicted secondary and te rtiary structures showed that ZP3 pro tein was a hydroph ilic
transm em brane

barre l prote in w ith a signa l peptide of 22 am ino acids. The coding reg ion of ZP3 gene in yak was successfully c loned,
wh ich prov ides a theoretical bas is for further study on its struc ture and function and its ro le in the fertilization process.
Key words:  Yak ZP3 gene C lone M olecular structures
收稿日期: 2010
07
13
基金项目:四川省科技厅应用基础项目 ( 07JY029
128)
作者简介:徐华伟,男,硕士生,研究方向:动物遗传学; E
m a i:l hanhan ru@i yahoo. com. cn
通讯作者:字向东,教授, E
m ai:l zixd@ s ina. com
卵透明带 ( zona pellucida, ZP)是所有哺乳动物
卵外周的厚层质膜 [ 1 ] ,绝大多数由 ZP1、ZP2和 ZP3
三种糖蛋白组成 [ 2, 3]。透明带具有卵巢组织的物种
特异性,在受精过程中起着非常重要的作用。其中
ZP3蛋白在精卵识别和结合以及诱发精子顶体反应
等生殖事件中起着重要的作用。 ZP3蛋白与精子质
膜上的 ZP3蛋白受体 ( RZP)结合从而介导精子与卵
子透明带之间的初级识别和结合, 而顶体反应的精
子和 ZP2相互作用则促成了精子与卵子透明带之
间的次级识别和结合。同时, ZP3蛋白像配体一样
2010年第 10期 徐华伟等:牦牛 ZP3基因的克隆及蛋白质结构的预测
与精子上的受体结合后, 触发精子引起顶体反应。
基因敲除研究表明, 缺少 ZP3基因的小鼠卵母细胞
不能形成 ZP[ 4 ]。牦牛是分布在青藏高原及其毗邻
高山不可替代的重要畜种, 具有耐寒、耐低氧等特
点,是青藏高原人民赖以生存的主要生产资料和生
活资料 [ 5]。然而牦牛产奶性能和产肉性能低下,用
奶牛或肉牛品种杂交改良牦牛,可以大幅度提高其
后代生产性能, 但是种间杂交受胎率低 [ 5, 6]。本研
究对牦牛 ZP3基因编码区序列进行克隆分析, 根据
预测的氨基酸序列, 利用生物信息学方法预测 ZP3
蛋白的结构, 并对其功能域进行分析, 以期为牦牛
ZP3蛋白的研究和牦牛及其异种受精生物学机制的
研究奠定基础。
1 材料与方法
1. 1 材料
在四川省广汉市屠宰场采集 1头成年纯种牦牛
卵巢, 液氮冻存备用。 pMD18
T Vector克隆载体和
DL
2000为 TaKaR a产品; 反转录试剂盒购自 Fer

mentas(M B I)公司; 感受态细胞 DH5和 Taq DNA
聚合酶购自北京全式金公司; DNA凝胶回收纯化试
剂盒购自 AXYGEN; DNA质粒提取试剂购自 T ian

gen; T rizo l购自 Invitrogen。
1. 2 方法
1. 2. 1 引物设计与合成  根据 GenBank收录的牛
ZP3基因 mRNA序列 ( NM 173974) , 利用 primer5. 0
设计特异性引物,由上海英骏公司合成,扩增长度为
1 303 bp。上游引物: 5
AGG TGG GAG TGG CTT
CGT
3 ; 下游引物: 5
CAC TTT CTT CTT TTA TTG
GGA
3 。
1. 2. 2 总 RNA的提取和 RT
PCR 以成年纯种牦牛
的卵巢组织为材料,采用 Trizol一步法提取总 RNA。
按 Fermentas(MBI)试剂盒说明书进行反转录,反应体
系 20 L。以反转录合成的 cDNA为模板进行 PCR,反
应体系 25 L: 10 ! Buffer 2. 5 L, dNTPs ( 10mmo l/L )
2 L,模板 0. 7 L,上、下游引物 ( 15 mo l/L )各 1 L,
Taq酶 0. 3 L, ddH2O 17. 5 L。扩增程序: 95∀ 预变性
4m in;以 95∀ 35 s、48∀ 35 s和 72∀ 1m in 45 s, 32个
循环; 72∀ 10m in。产物以 1%琼脂糖凝胶电泳检测。
1. 2. 3 ZP3基因的克隆与鉴定  PCR产物纯化后
与 pMD18
T载体在 16∀ 下连接过夜。转化大肠杆
菌 DH5中,涂布于含 Amp、X
ga l和 IPTG的 LB固
体培养基上, 37∀ 培养 12- 14 h。挑取白色阳性菌
落, 接种于含 Amp的 LB液体培养基中,过夜振荡培
养。菌液 PCR鉴定后,筛选阳性转化子, 送上海英
骏公司测序。
1. 2. 4 ZP3基因的生物信息学分析  利用生物软件
DNAMAN将扩增获得的牦牛 ZP3基因序列与 Gen

Bank中检索到的牛 (NM _173974)、猪 ( NM _213893)、
狗 (NM _001003224)、人 ( NM _001110354)、鼠 ( NM _
011776)和鸡 (NM _204389)的相应区域进行核苷酸和
氨基酸序列的多重比对、构建物种分子进化树。利用
蛋白质专家系统 ExPASy ( http: / /www. expasy. org)对
ZP3蛋白分别进行亲水性预测 ( P rotScale的 Ky te

Doo little方法 )、信号肽预测 ( S igna lP3. 0)、跨膜预测
( TMHMM )和二级结构预测 [ 7] ( Phyre) ,最后利用在
线软件 ( http: / /www. ics. uc.i edu /~ ba ld ig / tmb. htm l)
进行蛋白质三级结构建模 [ 8]。
2 结果
2. 1 ZP3基因的克隆和序列分析
通过 RT
PCR最终得到约 1 300 bp的特异性带
(图 1)。进行蓝白斑筛选, 菌液 PCR鉴定, 证实克
隆片段与预期大小一致 (图 2)。测序后序列分析证
实该 DNA片段大小为 1 303 bp,其中 ZP3基因编码
区全长 1 266 bp, 碱基组成为 A ( 18. 73% )、T ( 20.
88% )、C( 32. 12% )、G ( 28. 28% ), 共编码 421个氨
基酸,其中亮氨酸 ( Leu )所占比例最高 ( 974% , 图
3)。
M. DL 2000m arker; 1, 2. PCR产物
图 1 ZP3基因 RT
PCR产物扩增结果
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生物技术通报 B iotechnology  Bulletin 2010年第 10期
M. DL 2000 m arker; 1- 5.阳性克隆
图 2 重组子阳性鉴定的扩增结果
2. 2 牦牛和普通牛 ( Bos taurus ) ZP3基因和蛋白的
序列比对
  将扩增得到的牦牛 ZP3基因编码区与牛的相应
区域进行比对。结果发现,序列长度一致,但存在 20
个碱基变异; ZP3蛋白序列比对,发现 20个碱基的变
异,其中 12个为同义突变, 8个为错义突变 ( 4C R,
75D H, 116L P, 219S T, 268R H, 302S R,
372V A, 411S A )。
2. 3 分子进化树的构建
牦牛 ZP3基因的核苷酸序列与普通牛、猪、狗、
人、鼠和鸡的同源性分别为 98. 42%、96. 73%、
7967%、78. 71%、69. 15%和 56. 61%,氨基酸同源性
分别为 98. 10%、83. 85%、74. 24%、70. 26%、6262%
和 46. 12%,说明 ZP3蛋白是进化上相对保守的蛋白
质。同时利用 DNAMAN做进化树分析发现, 牦牛与
牛的亲缘关系最近,符合进化关系 (图 4)。
划线部分为 ZP3基因扩增引物
图 3 牦牛 ZP3基因核苷酸序列及由其推到的氨基酸序列
2. 4 ZP3蛋白二级结构预测分析
应用蛋白质专家系统 ExPASy分析 ZP3蛋白,
显示 ZP3蛋白分子量为 46. 62 kD, pI为 8. 17, 该蛋
白为弱碱性蛋白。具有 3个 O
糖基化位点, 2个
PKA磷酸化位点, 17个 PKC磷酸化位点, 1个 PKG
磷酸化位点, 12个 Ser磷酸化位点, 5个 Thr磷酸化
位点和 1个 Tyr磷酸化位点。 ZP3蛋白疏水性预测
(图略 ) , 显示大多数氨基酸为亲水性氨基酸, 可认
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2010年第 10期 徐华伟等:牦牛 ZP3基因的克隆及蛋白质结构的预测
图 4 不同物种 ZP3蛋白进化树分析
为 ZP3蛋白为亲水性蛋白。用 SignalP3. 0中的 NN
( neura l netwo rks)和 HMM ( hidden markov mode ls)
两种方法进行信号肽预测的结果相同: 第 1 - 22个
氨基酸为信号肽,信号肽裂解点位于第 22个氨基酸
Pro和第 23个氨基酸 G ln之间。通过 TMHMM在线
软件进行蛋白质跨膜螺旋结构分析, 结果表明检测
到的信号为跨膜信号,可认为该蛋白是一种跨膜蛋
白 (表 1)。用 Phyre预测 ZP3蛋白的二级结构表明
该蛋白主要含有 
螺旋、
链和卷曲等, 其中主要
为卷曲,其余含量相对较少 (图 5)。
表 1 牦牛 ZP3基因跨膜螺旋结构分析结果
Facts Number
Sequen ce L ength 421
 Sequence Number of p red icted TMH s 1
 Sequence Exp number ofAAs in TMH s 22. 50789
 Sequence Exp num ber, f irst 60 AA s 0. 17319
 Sequence Total prob of N
in 0. 01261
 Sequence TMHMM2. 0 ou tside 1- 380
 Sequence TMHMM2. 0 Tm helix 381- 403
 Sequence TMHMM2. 0 ins ide 404- 421
ps ipred, jnet, ssp ro.三种二级结构预测方法 ( h

螺旋; e.
链; c.卷曲 ) ; Con sensu s.相同预测结果; Con s
prob.预测可靠性分析 ( 0.低
可靠性; 9.高可靠性 )
图 5 牦牛 ZP3蛋白二级结构预测
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2. 5 ZP3蛋白三级结构预测
将氨基酸序列提交到 SW ISS
MODEL进行同源
性建模,结果模板序列同源性低于 30%, 建模模型
不可信。然后将序列提交至 TMBpro进行三级结构
预测, 用 RasM o l软件显示得到 ZP3蛋白的 3D结构
(图 6)。
R ibbons comm and
图 6 牦牛 ZP3蛋白三级结构预测图
3 讨论
哺乳动物的透明带 ( ZP)是一种不均一的纤维
丝状结构 [ 9 ]。由生长中的卵母细胞和颗粒细胞共
同合成和分泌 [ 10- 13] ,然后形成组织有序的海绵状基
质。新生 ZP3蛋白前体包含一段约 22个氨基酸的
N
末端信号肽,高度保守的 ZP序列, 一个 Fur in水
解位点 [ 14] , 以及 C
末端的跨膜区域和序列尾 [ 15 ]。
ZP3蛋白最主要的作用是作为初级精子受体在受精
过程中诱发顶体反应 [ 16, 17]。除此之外还有调解种
属特异性的精卵识别、阻止多精入卵和保护着床前
的胚胎等作用 [ 18, 19]。精子 RZP和卵子 ZP蛋白不能
相互识别是维持种间生殖隔离的主要生物学机
制 [ 20]。目前, ZP3的研究主要集中在受精过程中精
子的特异性位点识别及此过程中涉及的相关分子
机制 [ 21- 24]。
利用自然交配或人工授精, 普通牛与牦牛能发
生受精,并能完成妊娠、繁殖后代, 但牦牛纯种繁殖
的受胎率高达 70% - 80% ,而牦牛与普通牛的受胎
率只有 20% - 30% [ 5, 6]。体外受精研究结果也表
明,普通牛精子对牦牛卵母细胞的受精率及受精后
的卵裂率均显著低于牦牛纯种受精 [ 25, 26 ]。 ZP3在
精卵识别和受精过程中具有重要作用,牦牛与普通
牛 ZP3在基因水平和蛋白水平上是否存在差异对
研究牦牛及其异种受精生物学理论和技术具有重要
价值。
本研究利用 RT
PCR技术首次克隆得到牦牛
ZP3基因的编码区序列共 1 266 bp,编码 421个氨基
酸。通过与其它物种的氨基酸序列的对比, 发现牦
牛与普通牛的相似性最高 ( 98. 10% ), 与鸡的相似
性最低 ( 46. 12% )。构建的进化树也表明不同物种
间的 ZP3蛋白存在较高的保守性, 符合进化关系。
牦牛与普通牛氨基酸序列相应区域,共存在 20个碱
基差异。蛋白质结构和功能主要决定于氨基酸序
列, 氨基酸序列相似的蛋白质具有相似的结构和功
能, 但当蛋白质功能区的个别氨基酸发生改变就可
造成整个蛋白质结构和功能的变化。牦牛与普通牛
氨基酸序列相似性高,两物种间可以受精繁殖后代,
但 ZP3蛋白中 8个氨基酸的差异极有可能导致结构
和功能的变化,这可能是牦牛与普通牛异种受精受
胎率低 [ 5, 6, 25- 27]的重要原因之一。用 ExPASy在线
软件预测牦牛 ZP3蛋白分子量为 46. 62 kD, pI为
817, 为弱碱性蛋白质, 与普通牛 ZP3蛋白分子量
( 46. 55 kD)差异不大。牦牛 ZP3蛋白经过蛋白质
翻译后修饰系统所具有的 O
糖基化位点和 Ser、
Thr、Ty r磷酸化位点等,可能介导了精卵结合过程中
的特异性识别 [ 28- 30]。疏水性和跨膜结构预测结果
显示牦牛的 ZP3蛋白也为一种亲水性跨膜蛋白, 信
号肽预测也发现存在一个 N
端 22个氨基酸的信号
肽, 与疏水性分析结果相吻合, 与鼠的 ZP3蛋白研
究结果相类似 [ 31 ]。另外,普通牛的 ZP3蛋白也显示
相似的结果。牦牛 ZP3蛋白三级结构预测该蛋白
为一类

桶状跨膜蛋白 ( transmembrane

barre l
prote in)。其结构中

折叠结构含量较高,在折叠跨
膜时形成

桶状结构, 可能是由其蛋白质自身的功
能所决定的。从预测结果来看, 其大部分结构位于
细胞膜外侧,推测这种特殊的桶状结构恰能更好的
与精子头部的 RZP相结合, 诱发顶体反应, 从而行
使其在受精过程中的相关功能。而对于这种桶状结
构是否有利于精子与卵母细胞的结合则有待进一步
的研究。
160
2010年第 10期 徐华伟等:牦牛 ZP3基因的克隆及蛋白质结构的预测
参 考 文 献
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2010年第 10期   何建文等 :利用不同方法从深加工牦牛肉产品中提取基因组 DNA效果的比较
核内基因的降解比核外基因更严重,核外基因可以扩
增到 730 bp左右的大片段, 而核内基因不易扩增到
大片段基因,从核内基因的 PCR扩增程度来看,核基
因组 DNA可以扩增到 300 bp左右的基因片段。但从
总体扩增的基因片段大小来看, 300 bp左右的基因片
段足以对深加工肉产品进行检测分析。因此,通过定
量分析、凝胶电泳和 PCR片段大小梯度扩增等手段
对利用这 3种方法提取的基因组 DNA的数量和质量
进行了比较,综合各方面因素考虑, 异硫氰酸胍法简
便、快速、廉价、有效, 为较好从深加工肉产品中提取
基因组 DNA的方法。
参 考 文 献
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