全 文 ：生物杖术通报
· 研究报告 · 丑了口了百付口乙口 年增干」
卫氏并殖吸虫 和实时荧光 快速检测方法的建立
赵听‘, 郑秋月’ 曹际娟 , 赵前程
大连水产学院食品工程学院 , 辽宁省水产品加工与综合利用重点开发实验室 , 大连
辽宁进出人境检验检疫局 , 大连
摘 要 目的 建立快速 、灵敏 、特异的分子生物学检测卫 氏并殖吸虫的方法 。 方法 根据卫氏并殖吸虫的
特异性基因序列 ,设计适合于 检测的特异性引物及实时荧光 特异性引物和探针 , 并进行灵敏性和特异性
试验 。 结果 设计的引物和探针特异性强 , 所建立的检测方法灵敏度高。 应用实时荧光 方法的检测灵敏度可
达到 留林 , 比 方法 的灵敏度高三 个数量级 。 结论 本研究所建立的 和实时荧光 技术检测卫
氏并殖吸虫方法的特异性强 , 灵敏度高 , 为卫氏并殖吸虫感染的诊治提供了快速的检测技术手段 。
关键词 卫氏并殖吸虫 实时荧光 检测
一
。 , , , , ,
’ 咭 咭 , 动 了, 天匀即 加 叮 叮 咭
咭 , ’ 咭 仃一 砧尸 ,
,
即
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林L , a n d t h e s e n s i t i v i t y o f r e al t i m e P C R w as h i g h e r t h a n t h a t o f
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K ey w o rd s : P ara 即nirn us w esterm ani PC R R ea l tim e P C R D eteetion
卫氏并殖吸虫 (paragonim us w esterm ani) , 又称
肺吸虫 , 是人体并殖吸虫 (Pa ra gon im us )的重要虫种
之一 , 是引起肺型并殖吸虫病(para gonim iasis)的主
要病原川 。 并殖吸虫病是常见的人兽共患性寄生
虫病 , 全世界 30 多个国家均有该病流行 , 但主要分
布在亚洲 , 我国则主要分布在东北 、西南 、华东 、华南
等 14 个省 、 自治区 。 引起并殖吸虫病的虫种主要有
卫氏并殖吸虫 、 宫崎并殖吸虫 、 墨西哥并殖吸虫
等〔’〕。 由于并殖吸虫的成虫 、囊蝴 、虫卵等形态较
一致 ,很难从形态上区别并殖吸虫不同的品系 , 给其
检测带来了困难〔’〕。 利用寄生虫核糖体非转录区
基因内转录间隔区(Intern al tra nseri bed sp aeer , I T S )
I
Ts
Z 区域高度可变的性质 , 设计特异性引物和探
针 , 建立 PC R 和实时荧光 PCR 技术快速检测水产
品中卫氏并殖吸虫的方法 , 并比较了该两种方法的
检测灵敏度。
1 材料与方法
1.1 材料
卫氏并殖吸虫(Paragonim us westerm ani) 、宫崎
并殖吸虫 (Para gonim us m iyasaki) 、墨西哥并殖吸虫
基金项 目:辽宁出人境检验检疫基金课题;“水产品中寄生虫(卵)地理分布和季节变化的研究及检测技术体系建立 ” 的部分研究内容
作者简介:赵听(19 72 一 ) , 女 , 硕士研究生 , 从事食品微生物及寄生虫检测方面的研究
通讯作者:赵前程 (1966一 ) , 男 , 副教授 , E 一m ai l : q e z h a o @ d iru . e d u . c n
年增刊 赵听等:卫氏并殖吸虫 PCR 和实时荧光 PC R 快速检测方法的建立 359
(P aragonim u s m exieo ) 、肝片形吸虫(Faseiola hepat-
iea) 、 肝 吸虫 (Clonorehis Sinensis) 、 日本 血吸 虫
(sehistosom a japonieum )和布氏姜片吸虫(Faseiolop-
515 bu sk i) 。 所有寄生虫样本均来由大连医科大学
寄生虫实验室提供 。
1
.
2 仪器和试剂
仪器 :实时荧光 Pen 仪 (AB I pR ISM 7500 ) ;
PcR 仪(PE24 0 );台式高速离心机 ;凝胶成像系统 。
主要试剂:蛋 白酶 K ;10 x Bufe r, d N TP s , Ta 叮
酶:Real一T i m e E x 几 , 酶 , R o x l 。 上述试剂均购 自
宝生物工程(大连)有限公司 。
1
.
3 试验方法
1.3 .1 寄生虫 D N A 的提取 成虫压碎后置适量生
理盐水 、蛋白酶K 、 D N A 提取液 , 60 ℃水浴 30 m in 后 ,
加酚 :氯仿:异戊醇(25 :24 :l) 抽提一次 , ro o o r/
m in 离心 ro m in , 吸取上清液 , 加人 lm L 冷无水乙醇
沉淀 DN A , 一 2 0 ℃放置 3h , 1 2 0 0 0 r/ m i n 离心 15 m in ,
倒去乙醇 , 加人预冷的 70 % 乙醇洗涤 1 次 , 小心倾
倒乙 醇 , 沉淀挥发干燥 , 加约 50 林LT E 溶解沉淀
D N A , 经紫外分光光度计检测其浓度 , 一20 ℃贮存备
用 。
1
.
3
.
2 引物的设计与合成 根据卫氏并殖吸虫rR N A 第二内转录间隔区 (ITS Z )基 因序列 , 应用
prim er expre ss 3.0 软件 , 寻找并设计适合于 PC R 检
测的特异性引物 , 和适合于实时荧光 PC R 检测的特
异性引物和探针 。 将设计的引物和探针在 Gen e-
ban k 中进行 BLAST 比对 ,分析其特异性 。 并经过试
验摸索 , 最终确定本方法所使用的引物和探针序列 。
适合于 PC R 检测的引物序列 :5 忆T A A C G C
C C G T G C C C A A T C 一3 ’ , 5 ‘一 A G G C T C C A G T C C T A T
T A C 竹一3 ‘ , 扩增片段为 363 bp 。
适合于实时 PCR 检测 的引物和探针序列:5 ‘-
A G A T C T A T G C G C G T T C G G T A A C A T
一
3
’ ,
5
’-
T C C G G C T C A A G A C
T’ GCA G 一3 ‘ , 探 针 : 5 ’-
( F A M )
一
T C G G G C G C A C C C A C G 竹G (TAM A-
RA )一3 ‘。
引物和探针由宝生物工程 (大连 )有限公司合
成 。
1
.
3
.
3 P C R 和实时荧光 PCR 反应体系 PCR 反应
体系 :10 x pCR bufe rZ林l , d N
TP
s
Z 林l ,
Ta
g 聚合酶 0.
2 卜l , 上下游引物各 l卜l , 模板 D NA Z林l , 加灭菌超纯
水使总体积为 25 闪。 P C R 反应参数:95 ℃预变性
3m in , 9 4 ℃变性 505, 5 8 ℃ 退火 505 , 7 2 ℃延伸 lm in ,
35 个循环 , 最后 72 ℃延伸 ro m in 。 扩增结束后 , 进
行电泳 。
实时荧光 PCR 反应体系:正反引物各0.5闪 ,探
针 l林l , R e a l 一T i m e E x
Taq
聚合酶 12.5 林l , 模板 DN A
2闪 ,加灭菌超纯水使总体积为 25 闪。 实时 PCR 反
应参数:90℃ 105 ;90℃ 5 5 , 6 0 ℃ 34 5 , 4 0 个循环 。
1
.
3
.
4 特异性试验 应用本研究设计的卫氏并殖
吸虫特异性检测引物和探针 , 针对宫崎并殖吸虫 、墨
西哥并殖吸虫 、肝片形吸虫 、肝吸虫 、 日本血吸虫和
布氏姜片吸虫样本 , 分别用肺吸虫特异性检测引物
和探针在同样反应条件下进行 PC R 和实时荧光
PCR 扩增 , 以确定是否有交叉反应 , 验证所建立方
法的特异性 。
1
.
3
.
5 灵敏性试验 用核酸蛋白分析仪测定所提
取的肺吸虫 D N A 浓度 , 对肺吸虫 DN A 做倍比稀释 ,
得到一系列梯度浓度 D N A , 分别进行常规 PC R 及实
时荧光 PCR 扩增 , 以确定其检测灵敏度 。
2 结果与分析
2.1 PCR 和实时荧光 PCR 检测的特异性分析
PC R 方法的特异性试验结果如图 1所示 ,卫氏并
殖吸虫样品 D NA 经 PCR 扩增和电泳检测 , 出现了明
显的扩增带 ,而宫崎并殖吸虫 、墨西哥并殖吸虫和肝
片形吸虫样品的 D NA 均未见相应的扩增带 。 这表明
本研究所设计的卫氏并殖吸虫 PC R 检测引物的特异
性强 , 能特异性检测出卫氏并殖吸虫 D NA 。
卫
图 1 PCR 特异性检测卫氏并殖吸虫的电泳结果
1.1(X) bp D NA Lad der M ar ker; 2.卫氏并殖吸虫 ;3.宫崎
并殖吸虫;4 .墨西哥并殖吸虫 ; 5 .肝片形吸虫
实时荧光 PCR 方法的特异性试验结果如图 2
所示 , 卫氏并殖吸虫及其虫卵检测出了明显的荧光
生物杖术通报 B io te chnoto 舒 2008 年增刊
扩增曲线 , 而肝吸虫 、 日本血吸虫 、墨西哥并殖吸虫 、
宫崎并殖吸虫 、布氏姜片吸虫 、肝片形吸虫和水(阴
性对照)均未检测出荧光扩增曲线 。 这表明本研究
所设计的卫氏并殖吸虫实时荧光 PCR 检测引物和
探针特异性 强 , 能特异性检测 出卫 氏并殖 吸虫
DN A 。
性结果如图4 所示 。 从图 4 可以看出 , 浓度分别为
10林酬林l、 l 卜岁林I、 l 0() n 岁林l 、 I O n 岁林l 、 I n 岁林I、 0 .
I n 岁林l、 l o p 岁林l 、 l p 留林l、0 . l p 扩林l 的卫氏并殖吸虫
DNA , 经实时荧光 PCR 检测出了明显的荧光扩增曲
线 , 结果表明实时荧光 PCR 检测卫氏并殖吸虫 DN A
的灵敏度可达到0.IPg /闪。
图2 实时荧光 PC R 特异性检测卫氏并殖吸虫
D N A 的荧光扩增结果
1.卫氏并殖吸虫成虫; 2.卫氏并殖吸虫虫卵;3 一 依次
为肝吸虫 、日本血吸虫 、墨西哥并殖吸虫 、宫崎并殖吸虫 、布
氏姜片吸虫 、肝片形吸虫和水
图4 实时荧光 PC R 灵敏性检测结果
I一 依次为:10协g/ 林I , I 卜g/ 卜I , l o n 岁协I , l o n g/ 协l , I n 岁
卜l , 0 . I n留卜l , l o p 留卜l , l p 酬卜l , 0 . l p g/ 卜l
上述结果表明:本研究所设计的卫氏并殖吸虫
的常规 PCR 检测引物 , 以及实时荧光 PC R 检测引
物和探针的特异性均很强 , 适合于对卫氏并殖吸虫
的特异性检测 。
2
.
2 P C R 和 实时荧光 PC R 检测的灵敏性分析
常规 PC R 检测卫氏并殖吸虫 DNA 的灵敏性结
果如图 3 所示 ,浓度分别为 10ng/ 林l、 I n g/ 林l、 l o p g/
闪 的卫氏并殖吸虫 D N A 均检测出了扩增带 , 而浓
度为 Iop酬闪的卫氏并殖吸虫 DN A 没有检测出扩
增带。 可见 , 常规 PCR 检测卫氏并殖吸虫 D N A 的
灵敏度能达到 lo p岁闪 。
图 3 常规 PC R 灵敏性检测结果
1.lo bp DNA 肠(lde: m ar ker; 2一 :肺吸虫 D NA 10ng ,
1
n
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,
l
0()
p g
,
1 0 p岁卜l
实时荧光 PC R 检测卫氏并殖吸虫 D N A 的灵敏
从 PCR 和实时荧光 PCR 两种检测方法的灵敏
度检测结果可以看出 , 实时荧光 PCR 检测方法的灵
敏度要高于常规 PC R 方法的检测灵敏度 , 前者约是
后者的 1 00 倍 , 即高出 3 个数量级 。
3 讨论
目前 , 寄生虫及虫卵的检测以病原学检测为主 ,
主要应用形态学和免疫学技术检测 , 在光学显微镜
或透射电镜下辨别某些寄生虫及虫卵的形态 。 电镜
费时费力且要求很高的专业技术人员 , 而且寄生虫
及虫卵等生物性状的差异不但存在于种间也存在于
种内。 由于自然地理等生态环境因素的长期影响 ,
种群的种株之间也存在不同程度的遗传分化 , 这些
变化用传统的方法很难区分 。 免疫学方法简单快
速 , 但特异性差 , 假阳性高[’] 。 因此 , 传统的生物学
技术不能满足快速 、准确、高灵敏度及特异性检测需
要 。
但目前国内外主要应用 PC R 技术检测卫氏并
殖吸虫仁’一’] , 关于实时荧光 PcR 检测寄生虫的研究
较少 。 实时荧光 PCR 技术已广泛应用于各种基因
成分的检测 。 寄生虫的核糖体非转录区 IT s , 即使
是在寄生虫非常相近的种与种之间 , 也是高度变化
的 。 IT SZ 基因序列反映寄生虫种的水平变异 , 特别
年增刊 赵听等:卫氏并殖吸虫 PC R 和实时荧光 PC R 快速检测方法的建立 36 1
适于种间的差异研究 , 尤其对于亲缘关系较近且形
态非常类似的虫种 , 是检测鉴定寄生虫的理想指
标【’, , , ’”〕。 本文根据卫氏并殖吸虫的第二内转录间
隔区 (ITS 2) 基因序列 , 设计特异性强的引物和探
针 ,应用实时荧光 PCR 技术直接检测卫氏并殖吸虫
的基因 ,故比形态学鉴定和血清学方法可靠 , 重现性
好 ,且检测灵敏度可达到为0.IPg D N A , 比常规 PCR
检测灵敏度高出 10 0 倍 。
本文建立了应用 PC R 和实时荧光 PCR 技术快
速检测水产品中卫氏并殖吸虫的方法 , 弥补了常规
方法检测周期长 、繁琐 、易受人为因素影响等不足 ,
为快速检测水产品中卫氏并殖吸虫提供了很好的分
子生物学鉴别手段 。 尤其是实时荧光 PC R 技术的
高度特异性和检测灵敏度 , 稳定无污染 , 为及时 、准
确地报告寄生虫流行疫情 , 有效遏止疫情提供了快
速检测的技术保障。
参 考 文 献
1 陈心陶主编.(中国动物志》扁形动物门吸虫纲 , 复殖目(一 ) , 北
京:科学出版社 , 1 9 85 , 21 一 24 .
2 S o n g , C C
.
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e而010群 an d eont、l of P a ra gon im u ias is in C h in a ·
确H O Stud y G ro u P o n th e C on trD I of F呱】一 B o rne T re m a n tod a I nfe e -
t i o n
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M an i l
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1 9 9 3
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一 9
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3 钱宝珍.热带病与寄生虫学 , 2 0 4 , 2 ( 3 ) : 1 47 一 1 49 .
4 寿干城 , 段云芬 , 汪小卫 , 等.中国寄生虫学与寄生虫病杂志 ,
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7 3
一 7 4
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5 钱宝珍 , 沈琦.中国人兽共患病学报 , 2 0 6 , 2 : 3
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D
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7 S u gi y am
a H , M o ri s h i m a Y , K
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2 3 1
一 2 3 6
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2
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2 7
一 3 0
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9 o liv e ro s R , C u t i l l as C , D e R
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P ar as i t
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2 《拟) , 8 6
(
1 2
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:
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(X)
8
一 1 0 1 3
.
1 0 P ar k G M , I m l , Y o n g 飞.Kore an J Pars itol, 2 (X) 3 , 4 1 ( l ) : 4 7 一 5 5
.
( 上接第357 页)
蛋白质 、 D N A 和有机溶剂如酚等。 针对三角帆蚌等
淡水育珠蚌的外套膜组织韧性 、勃性较强 , 杂蛋白成
分含量较高等特点 , 改 良法中 , 在用异丙醇沉淀
R N A 的同时加人高浓度的盐溶液 , 使赫蛋白依然留
在上清中 , 而不与 R N A 共同沉淀 , 大大降低了勃蛋
白的污染 。 同时用氯仿提取两次 ,尽量吸取上清液 ,
不要吸取中间层的 D N A 及下层的蛋白质等杂质 , 就
可以尽可能的除尽 RN A 溶液中的蛋白质和 D NA ;
但高浓度盐的存在会影响 R N A 的一些操作 , 因此需
用 75 % 乙醇洗涤 2 次以脱盐 。
常规的方法用 O DZ。/ O D 28 。比值判断 R NA 的纯
度 , 但对外套膜这种特殊组织 , 还测定 了 o DZ印 /
0 D 23 。的比值增加实验的可靠性 。 由于抽提 RN A 时
使用的试剂及样品中的杂质都在 260nm 和 280n m
附近有吸收 , 对 O D 260 /O D 28。产生影响 。 改良法所抽
提的R N A 样品 0 D 2。/ O D Zs。的比值介于 1.9 一 2 . 1
之间 , 0 D 2。/ O D 23 。均介于 1.9 一 2 . 2 之间 , 充分证明
了用该法抽提的R N A 样品纯度高 , 无杂质污染 。
参 考 文 献
郑纺 , 王宝利 , 等.天津医药 , 2 0 7 , 1 0 ( 35 ) : 7 53 一 7 5 .
A rn an d T a n邵邓 , 兀而ng G uoa , e t al . G e n e , 2 0(] 4 , 3 3 8 : 1 2 1 一 1 3 1 .
杨受保 , 王建明 , 等.水利渔业 , 2 0 7 , 2 7 ( 3 ) : 10 一 1 .
M 面e一Pi e re D u ha s , F ab i e n B ad ari o t t i , e t al . B i oc h e m ie al an d B i o -
p h y
s
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萨姆布鲁克 , 弗里奇 , 曼尼阿蒂斯.分子克隆实验指南 , 北京:科学
出版社 , 1 9 % , 3 04 一 3 14 .
昊乃虎.基因工程原理 .北京:科学出版社 , 2 0 1 , 3 59 一 3 65 .