全 文 ：·研究报告·
生物技术通报
B IO TECHNOLOGY　BULL ETIN 2009年第 8期
基于核糖体基因序列快速鉴定产脂肪酶微生物
徐莉　杨江科　刘云　闫云君
(华中科技大学生命科学与技术学院 分子生物物理教育部重点实验室 ,武汉 430074)
　　摘 　要 : 　利用含罗丹明 B的橄榄油检测平板从中国各省市油污土壤中分离、筛选产脂肪酶微生物菌株 ,扩增细菌的核
糖体基因 16S rDNA序列和真菌的 ITS2序列 ,分析核糖体基因簇 DNA,并结合形态学特征从而对产脂肪酶菌株进行分子生物
学鉴定。核糖体基因 16S rDNA序列分析及系统发育分析表明 ,分离得到的产脂肪酶细菌分别属于枯草芽孢杆菌 (B acillus
subtilis)、产碱假单胞菌 ( Pseudom onas alcaligenes)、洋葱伯克霍尔德氏 (B urkholderia cepacia)、琼氏不动杆菌 (A cinetoba ter jurii)、
嗜麦芽窄食单孢菌 (S tenotrophom onas m altophilia)和荧光假单胞菌 ( Pseudom onas sp. ) ;真菌核糖体基因转录间隔区 ( ITS2)序列
及同源性分析表明产脂肪酶真菌分别属于黑曲酶 (A spergillus niger)、白地酶 (Galactom yces geotrichum )、解脂耶氏酵母 ( Yarrow ia
lipolytica)、丝孢酵母 ( Trichosporon guehoae)和假丝酵母 (Candida sp. )。研究结果表明 ,核糖体基因簇的 DNA分析技术为从自然
界分离、鉴定产脂肪酶菌种提供了一种快速有效的手段 ,为产脂肪酶微生物资源开发利用奠定了技术基础。
关键词 : 　产脂肪酶微生物 　16S rDNA　 ITS　系统发育
M olecular Identif ication of L ipase Production
M icroorgan ism s by Analyz ing rDNA Sequences
Xu L i　Yang J iangke　L iu Yun　Yan Yunjun
( Key Laboratory of M olecular B io2physics, College of L ife Science and Technology,
Huazhong University of Science and Technology, W uhan 430074)
　　Abs trac t: 　11 lipase2p roducing strains of fungi and bacteria were isolated from oil2stained soil samp les, and p relim inary classified
by their morphological characteristics. The 16S rDNA or ITS2 sequences were amp lified by PCR methods, and phylogenetically ana2
lyzed. Combined with morphological characteristics, these strains were identified as B acillus subtilis, Pseudom onas a lcaligenes, B urk2
holderia cepacia, A cinetoba ter jurii, S tenotrophom onas m altophilia, Pseudom onas sp. , A spergillus niger, Galactom yces geotrichum , Yar2
row ia lipolytica, Trichosporon sp. , and Candida sp. , respectively. The results showed that sequences, character of PCR2amp lified 16S
rDNA and ITS2 region DNA is a rap id and reliable molecular method to identify lipase2p roducing bacterial and fungal isolates from nat2
ural environments, which p rovides a basic technique to exp loit lipase2p roducing m icrobial resources.
Key wo rds: 　L ipase p roduction strains　16S rDNA　 ITS2　Phylogenetic
收稿日期 : 2009203226
基金项目 :国家“863”计划资助项目 (2006AA020203, 2007AA05Z417) ,武汉市攻关项目 (200720422138)
作者简介 :徐莉 (19712) ,女 ,湖北人 ,博士 ,从事微生物分子生物学研究 ; E2mail: xuli1881@yahoo. cn
通讯作者 :闫云君 , Tel: 027287792213, E2mail: yanyunjun@ tom. com　　脂肪酶 (1 ipase, EC3. 1. 1. 3)是一类催化三酰甘油酯分解、合成和酯交换的酶类 ,具有极强的选择性和专一性 ,并具有在水相和有机相界面催化反应的独特性能 ,已被广泛应用于食品、油脂化工等行业。随着应用领域的拓宽 ,已涉及到单细胞蛋白生产、化妆品生产、环境保护、新型生物材料、生物传感器、生物医学及生物能源等新兴领域 [ 1～3 ] ,有着广阔的应 用前景。脂肪酶广泛存在于自然界的动植物 ,尤其是微生物体内。据不完全统计 ,细菌有 28个属、放线菌4个属、酵母菌 10个属、其它真菌 23个属均能产生脂肪酶 ,其中假丝酵母 ( Candida sp. )、假单胞菌( Pseudom onas sp. )和根霉 (R hizopus sp. )的产量最高。鉴于微生物脂肪酶具有重要的工业应用价值和
© 1994-2011 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. http://www.cnki.net
2009年第 8期 徐莉等 :基于核糖体基因序列快速鉴定产脂肪酶微生物
潜在的巨大需求 ,筛选获得高产脂肪酶微生物资源
是研究开发脂肪酶工作基础。
经典微生物鉴定一般依据形态和生理生化特性
进行分类 ,实验繁杂且耗时 ,经验性也很强。近年
来 ,随着分子生物学技术的迅猛发展 ,微生物分类学
已经从表型分型进入了分子 (基因 )分类的新时代。
核糖体作为一类常见细胞器 ,其基因序列被认为是
最能反映物种之间遗传关系的指标之一 ,是一个非
常有用的分子生物学鉴定工具 [ 4～9 ]。
16S rDNA是编码原核生物核糖体 RNA小亚基
16S rRNA的基因 ,长度为 1 540 bp,其序列包含 10
个可变区 ( variable region)和与之相间的 11个恒定
区 ( constant region) ,是细菌分类学研究中最常用、
最有用的“分子钟 ”[ 5 ]。 1990 年 Worse 利用 16S
rRNA同源性研究原核微生物的分类和系统发育 ,
取得了巨大成功。Woese与 O lsen等 [ 6 ]基于对 16S
rDNA的分析构建了现已被公认的全生命系统发育
树。近几年 ,随着核酸测序技术的普及和测序周期
缩短以及成本的降低 ,细菌核酸序列数据库的不断
充实 ,原核生物核糖体 RNA小亚基 16S rRNA的基
因全序列测定已成为细菌的快速鉴定方法 [ 5～9 ]。
在真菌分子生物学鉴定方面 ,由于核糖体 RNA
基因的大、小亚基之间的基因间隔区可变性大 ,可提
供属、种、变种甚至菌株之间的鉴别依据 ,其序列分
析被认为是最直接、最明确的指标。核糖体内转录
间隔区 ITS序列分析法为真菌核糖体基因序列分析
研究提供了可靠的实验手段 [ 10, 11 ]。
本课题组一直从事脂肪酶资源收集、整理和挖
掘应用研究 ,从全国各地积累了大量产脂肪酶微生
物 ,在鉴定和整理这一宝贵资源上面临着一些技术
挑战 ,分别运用 16S rDNA序列分析和 ITS2序列分
析及系统发育分析手段对从油污土壤中分离到的具
有较高活力 11株产脂肪酶细菌和真菌进行了分子
生物学鉴定 ,研究了它们的系统发育关系 ,试图获得
一项快速鉴定产脂肪酶微生物的技术方法。
1　材料和方法
111　材料
11111　试验材料　土样采自全国各地的油污土壤 ,共
36份 ;大肠杆菌 (Escherichia coli)DH5α实验室自备。
11112　试剂 　罗丹明 B,天津天泰精细化学品公
司 ,分析纯 ;橄榄油 ,国药集团上海化学试剂有限公
司生产 ,化学纯 ;聚乙烯醇 ( PEG1750) ,中国启东精
细化工二厂 ; Taq DNA聚合酶、AT克隆试剂盒等分
子生物学试剂购自大连宝生物 ( TaKaRa)生物工程
有限公司 ;引物由上海 Sangon公司合成 ;其他普通
生化试剂均为国产分析纯。
11113　仪器 　摇床、培养箱、精密水浴锅等均由上
海正诚实验设备公司生产。 PCR仪 53333 ( Eppen2
dorf AG 22331 Hamburg) ,电泳仪 DYY25 (北京市六
一仪器厂 ) ,凝胶成像系统 EL Logic200 ( Kodak公
司 , USA )。
11114　培养基 　细菌富集培养基 ( % , w / v) :酵母
膏 0. 3,蛋白胨 0. 3,硫酸铵 0. 1,橄榄油乳化液 1. 5,
磷酸氢二钾 0. 2,硫酸镁 0. 05。细菌平板初筛培养
基 ( % , w / v) :牛肉膏 0. 5,蛋白胨 0. 5,琼脂 1. 5,罗
丹明 B 0. 05。
细菌摇瓶复筛液体培养基 ( % , w / v) :蛋白胨
1. 0,蔗糖 0. 5,橄榄油乳化液 1. 0,硫酸铵 0. 1,硫酸
镁 0. 05,磷酸氢二钾 0. 2。
真菌富集培养基 ( % , w / v ) : 酵母膏 0. 02,
Na2 HPO4 0. 35, KH2 PO4 0. 15, MgSO4·7H2 O 0. 05,
NaCl 0. 05,橄榄油 1. 0 ( v / v) , pH 7. 0。
真菌平板初筛培养基 ( % , w / v) :葡萄糖 1. 0,蛋
白胨 0. 5, KH2 PO4 0. 1,MgSO4·7H2 O 0. 05,琼脂 1.
5,橄榄油 1. 0 ( v / v) ,罗丹明 B 0. 2 ( v / v) , 0. 03%链
霉素 10 ( v / v)。
真菌发酵复筛培养基 ( % , w / v) :黄豆粉 2. 0,玉
米浆 2. 0,蔗糖 1. 0, (NH4 ) 2 SO4 0. 1, K2 HPO4 0. 2,
MgSO4·7H2 O 0. 01,橄榄油 1. 0 ( v / v)。
11115　引物 　细菌的 16S rDNA的特异引物 :正向
引物序列 ( pH ) : 5′2AAGGAGGTGATCCAGCC23′;反
向引物序列 ( pA ) : 5′2AGAGTTTGATCCTGGCTCAG2
3′。真菌 ITS22PCR扩增引物为真菌的通用引物 ,正
向引物序列 ITS1: 5′2TCCGTAGGTGAACCTGCGG23′
和反向引物序列 ITS4: 5′2TCCTCCGCTTATTGATAT2
GC23′。引物均由上海 Sangon公司合成提供。
112　方法
11211　产脂肪酶菌株的筛选 　将富集的产脂肪酶
微生物菌株稀释涂平板初筛 , 30℃培养 3 d左右 ,挑
选水解圈直径与菌落直径差值较大者进行复筛 ,细
541
© 1994-2011 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. http://www.cnki.net
生物技术通报 B iotechnology　B u lle tin 2009年第 8期
菌 37℃培养 2～3 d,真菌 28℃培养 4～5 d后 ,取培
养液测定酶活性 ,挑取产酶能力较高菌株。
11212　酶活的测定 　发酵液中脂肪酶酶活的测定
采用经典聚乙烯醇橄榄油乳化液方法 [ 13 ]。酶活力
单位定义 : 40℃, pH 7. 5 条件下 ,以每分钟产生
1μmol脂肪酸所需的酶量定义为 1 个活力单位
(μmol/m in·m l) ,以 U表示。
11213　菌株的分子生物学鉴定 　细菌总 DNA的提
取参照文献 [ 14 ]。以 pH和 pA为引物 ,分别以筛选
出的具有较高酶活的细菌基因组 DNA为模板 ,扩增
出 16S rDNA 全长序列。反应条件 : 95℃ 10 m in;
94℃ 1 m in, 55℃ 1 m in, 72℃ 2 m in, 30个循环 ; 72℃
6 m in。真菌基因组的提取参照文献 [ 15 ]进行。以
ITS1和 ITS4为引物 ,分别以筛选出的具有较高酶活
的真菌基因组 DNA为模板 ,扩增包含 5. 8S在内的
ITS2序列。反应条件 : 95℃ 10 m in; 94℃ 1 m in, 53℃
1 m in, 72℃ 1m in, 30个循环 ; 72℃ 6 m in。 PCR产物
经 A /T克隆至载体 pMD182T,后转化大肠杆菌 ,筛 选并获得阳性克隆子。外源片段 DNA序列经上海英骏生物技术有限公司测序鉴定后 ,提交 GenBank的 BLAST数据库 ,进行序列比对 ,将之与相似性最高的种属的 16S rDNA或 ITS2 rDNA序列进行同源性比对 , B ioedit软件得出反应其分类地位的系统发育树。2　结果211　产脂肪酶细菌菌株的分离通过富集、初筛和复筛 ,从 36份油污土样中分离获得 11株酶活大于 5. 0 U /m l的菌株。212　菌种鉴定与系统发育分析在考察菌落形态、颜色、大小等特征的基础上 ,对上述 11株菌进行了 rDNA序列测定与系统进化分析。根据供试菌株的 16S rDNA序列 ,在 GenBank数据库中进行相似性搜索 ,选择其中同源性较高的相关菌株构建了反映其分类地位的系统进化树 (图1,图 2)。
图 1　与产脂肪酶细菌菌株同源性最高的相关菌种代表菌株 16S rD NA序列系统发育树
　　从系统进化树可以看出 ,这 6株供试菌分别属
于 5个属。从 16S rDNA 序列相似性分析结果看 ,
2622与假单胞菌属的恶臭假单胞菌 ( P. pu tida)、丁 香假单胞菌 ( P. syringae)和荧光假单胞菌 ( P. f luo2rescens)等的亲缘关系较近 ,同源性为 98% ;由于亲缘关系非常相近 , 16S rRNA 序列很难将菌株 2622
641
© 1994-2011 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. http://www.cnki.net
2009年第 8期 徐莉等 :基于核糖体基因序列快速鉴定产脂肪酶微生物
与 P. fluorescens、P. syringae等区分开来。因而 ,将
该菌株暂定为 Pseudom onas sp. 2622,登录号 : DQ
993350 (图 12A )。菌株 0721与其最近邻的荧光假
单胞菌属的典型种产碱假单胞菌的同源性为 99% ,
结合形态学特征鉴定 ,命名为产碱假单胞菌 0721 ( Pseudom onas a lca ligenes 0721 ) ,登录号 : EU596481(图 12B )。菌株 jfly201与其最近邻的典型种琼氏不动杆菌的同源性为 99% ,结合形态学特征鉴定 ,命名为琼氏不动杆菌 jfly201 (Acinetoba ter ju rii jfly01) ,登录号 : EU604241 (图 12C) ;菌株 0450与
图 2　与产脂肪酶细菌菌株同源性最高的相关菌种 16S rD NA序列系统发育树
741
© 1994-2011 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. http://www.cnki.net
生物技术通报 B iotechnology　B u lle tin 2009年第 8期
其最近邻的嗜麦芽窄食单孢菌属的典型种嗜麦芽窄
食单孢菌的同源性为 99% ,归为嗜麦芽窄食单孢
菌 ,结合形态学特征鉴定 ,命名为嗜麦芽窄食单孢菌
0450 ( S tenotrophom onas m a ltoph ilia 0450 ) ,登录号 :
EU604758 (图 12D) ;菌株 G63与其最近邻的洋葱伯
克霍尔德氏菌属的典型种洋葱伯克霍尔德氏菌的同
源性为 99% ,归为洋葱伯克霍尔德氏菌属 ,结合形
态学特征鉴定 ,命名为洋葱伯克霍尔德氏菌 G63
(B u rkholderia cepacia G63 ) ,登录号 : EU597838 (图
12E) ;菌株 0722与其最近邻的枯草芽孢杆菌属的典
型种枯草芽孢杆菌的同源性为 99% ,结合形态学特
征鉴定 ,命名为枯草芽孢杆菌 0722 (B acillus subtilis
0722) ,登录号 : EU596480,如图 12F所示。真菌通过
测定分离菌株的 rDNA内转录间隔区 ITS序列 ,并
与已知同源种属的 ITS2序列进行比对 ,选择其中同
源性较高的相关菌株构建了系统进化树 (图 3,图
4) ,初步确定其系统发育关系。
从系统进化树状图 3可以看出 ,这 5株分离真
图 3　产脂肪酶真菌菌株与该属同源性最高相关菌种代表菌株 ITS2 rD NA序列系统发育树
菌分别属于 5个属。其中菌株 F044属于黑曲霉属。
结合菌落 (包括菌丝体 )形态、rDNA序列同源聚类
分析和 ITS序列限制性内切酶 (RsaⅠ)酶切电泳图
等特征 ,参照齐祖同 [ 16 ]和 Accensi等 [ 17 ]的方法鉴定
并命名为黑曲霉 F044 (A sperg illus n iger F044) ,登录
号 : DQ985232 (图 32A)。从 ITS2 rDNA序列相似性
分析结果看 , C22和假丝酵母 (Candida sp. )亲缘关
系较近 ,同源性为 98%。结合形态学特征鉴定 ,命
名为假丝酵母 C22 ( Candida sp. C22 ) , 登录号 :
EU604759 (图 32B) ; T76与丝孢酵母亲缘关系较近 ,
同源性为 98% ,结合形态学特征鉴定 ,命名丝孢酵
母 T76 ( Trichosporon sp. T76 ) ,登录号 : EU 603296
(图 32C) ; Y162与白地霉亲缘关系较近 ,同源性为
97% ,结合形态学特征鉴定 ,命名白地酶 Y162 ( Ga2
lactom yces geotrichum Y162) ,登录号 : EF159152 (图
32D ) ; Y25 与解脂耶氏酵母代表菌株同源性为
99% ,因此可认定为解脂耶氏酵母属 ,定名为解脂耶
氏酵母 Y25 ( Ya rrow ia lipoly tica Y25 ) , 登录号 :
EU603297 (图 32E)。
3　讨论
微生物脂肪酶是一类具有重要应用价值的生物
催化剂 ,工业应用前景广阔。分离、筛选和鉴定脂肪
841
© 1994-2011 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. http://www.cnki.net
2009年第 8期 徐莉等 :基于核糖体基因序列快速鉴定产脂肪酶微生物
酶产生菌 ,特别是具备高度位置特异性、立体特异性
和脂肪酸底物特异性的脂肪酶产生菌的获得 ,是拓
展新的微生物菌种资源 ,进一步丰富脂肪酶基因资
源库 ,开发具有知识产权且具工业应用价值的商用
脂肪酶的前提和基础 ,也是微生物资源学工作者的
重要研究课题。
图 4　产脂肪酶真菌菌株与该属同源性最高相关菌种代表菌株 ITS2 rD NA序列系统发育树
　　从全国各地采集了一系列土壤样品 ,利用不同
培养基对产脂肪酶的细菌和真菌进行筛选和分离 ,
先采用传统方法将分离到的菌株作初步形态观察 ,
再通过 rDNA序列测定和系统进化分析 ,对来源于
油污土壤的产脂肪酶目标菌种进行了快速鉴定 ,对
整理和挖掘我国丰富的脂肪酶资源库具有重要意
义。研究结果表明 ,从我国多样的生态环境中采集
土样 ,采用纯培养技术和分子生物学手段相结合 ,能
快速从普通环境中分离和鉴定产脂肪酶微生物 ,为
进一步扩展资源库奠定了技术基础。目前 ,已克隆
941
© 1994-2011 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. http://www.cnki.net
生物技术通报 B iotechnology　B u lle tin 2009年第 8期
30余条脂肪酶基因 ,构建了部分高效工程菌。初步
研究表明 ,白地霉 ( G. cand idum Y162)脂肪酶和洋
葱假单胞菌 G63脂肪酶具备优良的有机溶剂耐受
性和热稳定性 ,是生产生物柴油的优良催化剂 ,在工
业上极具应用开发潜力 [ 15, 19 ] ;黑曲霉 F044和白地
酶 Y162具极强的底物特异性 ,能选择性水解或酯
化获得高营养价值的多不饱和脂肪酸 ( FUFA s) ,在
功能食品开发中显示出诱人的前景 [ 15, 18 ]。
参 考 文 献
1　 Macrae AR, Hammond AR. B iotechnology & Genetic Engineering
Reviews, 1985, 6: 855～863.
2　 Jaeger KE, Eggert T. Current Op inion in B iotechnology, 2002, 13
(4) : 390～397.
3　魏红明 ,赵华. 当代化工 , 2006, 35 (4) : 246～249.
4　 HagstrÊm A, Pomm ier T, Rohwer F, et al. App lied and Environ2
mentalM icrobiology, 2002, 68 (7) : 3628～3633.
5　 D rancourtM, Bollet C, Carlioz A, et al. Journal of ClinicalM icro2
biology, 2000, 38 (10) : 3623～3630.
6　 O lsen GJ, Woese CR. Cell, 1997, 89: 991～994.
7　 Hugenholtz P, Huber T. International Journal of Systematic and Ev2
olutionary M icrobiology, 2003, 53: 289～293
8　 Fuller NJ, Marie D, Partensky F, et al. App lied and Environmental
M icrobiology, 2003, 69 (5) : 2430～2443.
9　 Mummey DL, Stahl PD. M icrobial Ecology, 2004, 48 ( 1 ) : 41
～50.
10　KumarM, Shukla PK. Journal of Clinical M icrobiology, 2005, 43
(2) : 662～668.
11　L i HC, Bouchara JP, H su MM, et al. Journal ofMedicalM icrobiol2
ogy, 2008, 57: 592～600.
12　Turenne CY, Sanche SE, Hoban DJ, et al. Journal of Clinical M i2
crobiology, 1999, 37 (6) : 1846～1851.
13　Kouker G, Jaeger KE. App lied and Environmental M icrobiology,
1987, 53 (1) : 211～213.
14　郑维 , 权春善 , 朴永哲 ,等. 中国生物工程杂志 , 2006, 26 (4) : 75
～80.
15　阎金勇 , 杨江科 , 徐莉 , 等. 微生物学报 , 2008, 48 ( 2 ) : 184
～190.
16　Q i ZT(齐祖同 ) , A spergilluset Teleomorphi Cognati. In: Flora Fun2
gorum Sinicorum. Beijing: Science Press, 1997, 5.
17　Accensi F, Cano J, Figuera L, et al. FEMS M icrobiology Letters,
1999, 180 (2) : 191～196.
18　舒正玉 , 杨江科 , 徐莉 , 等. 武汉大学学报 (理学版 ) , 2007, 53
(2) : 204～208.
19　杨江科 , 郭道义 , 闫云君. 高技术通讯 , 2007, 17 (2) : 175～179.
(上接第 143页 )
7　张金伟 ,曾润颖. 生物磁学 , 2006, 6 (1) : 6～10.
8　马歌丽 ,董文惠 ,等. 现代食品科技 , 2007, 23 (8) : 17～19.
9　 中国科学院微生物研究所 ,细菌分类组 :一般细菌常用鉴定方
法. 北京 :科学出版社 , 1978.
10　Gerhardt P主编 ,厦门大学生物系微生物学教研室 译. 普通细菌
学方法手册. 厦门 :厦门大学出版社 , 1989.
11　Buchanan RE, Gibbons N E, Bergey′sManual of Determ inative Bac2
teriology(8 th ed) . New York: W illiam s and W ilkins, 1974.
12　Mateos JC, Ruiz K, Rodriguez JA. Journal ofMolecular CatalysisB:
Enzymatic, 2007, 49 (16) : 104～112.
13　Shinobu Oda, Kunio Isshiki, L iquid2surface Immobilization System
and L iquid2liquid Interface B ioreactor: App lication to Fungal Hydrol2
ysis. [M ] Process B iochem istry, 2007, 42 (11) : 1553～1560.
14　Gómez de Membrillera, Joaquín García Box. Journal of B iotechnolo2
gy, 2007, 131 (2) : 90～91.
15　Florczak T, Makowski K, Turkiewicz M. Journal of B iotechnology,
2007, 131 ( 2) : 89～90.
051
© 1994-2011 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. http://www.cnki.net