全 文 ：研究报告
生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2010年第 1期
高质量毕赤酵母基因组 DNA提取方法比较
唐天乐 高炳淼 长孙东亭 罗素兰
(海南大学海洋学院 热带生物资源教育部重点实验室 海南大学生物技术实验中心,海口 570228)
摘 要: 旨在比较 5种毕赤酵母基因组 DNA的提取法, 以便获得简便高效的提取高质量酵母基因组 DNA的优化方法。
分别使用蜗牛酶破壁法,超声波破碎法, 液氮研磨法, Ly ticase破壁法, 试剂盒法提取毕赤酵母基因组 DNA,然后进行 DNA电
泳检测以及紫外分光光度计测定 DNA浓度和纯度。结果显示, 5种方法均能提取出酵母基因组 DNA, 而酶法所提取的酵母基
因组 DNA质量最好。由此证实,蜗牛酶法成本低、效果好,是理想的提取高质量酵母基因组 DNA的方法,完全满足后续试验
要求。
关键词: 毕赤酵母 高质量基因组 DNA 提取方法优化
Comparison ofM ethods forH igh Quality Genom ic DNA
Extraction ofP ichia pastoris
Tang T ianle Gao B ingm iao Zhangsun Dongting Luo Su lan
(K ey Laboratory of Trop ical B io log ical Resources of M inistry of Education,
O cean College, Center for Experimental Biotechno logy, H ainan University, H aikou 570228)
Abstrac:t In orde r to find an optim ized and e ffective m ethod, the re w ere five m ethods o f yeast g enom ic DNA extrac tion to be
compared, including sna ilase, u ltrasonic ex traction, liqu id nitrogen a ttr ition, ly ticase and yeast DNA k it m ethods The genom ic DNA
qua lity w as exam ined by e lectrophoresis and u ltrav iolet spectropho tom eter Results dem onstrated that genom ic DNA ofP ichia pastor is
could be iso la ted by a ll the five me thods, in wh ich snailasem ethod w as the best one to get h igh qua lity DNA There fore, the snailase
m ethod show ed m any advantag es such as relatively low expense and h igh effic iency over the rest
Key words: P ichia pastoris H igh quality genom ic DNA Extraction me thod optim ization
收稿日期: 20091009
基金项目:国家 863!计划 ( 2007AA02Z114) ,国家自然科学基金项目 ( 30860368) , 重大新药创制国家科技重大专项课题项目 ( 2009ZX09103
644 ),海南大学创新团队项目 ( hd09xm 02) ,重点科研项目 ( hd09xm 15)
作者简介:唐天乐,男,硕士研究生,研究方向:水生生物技术与海洋药物; Em ai:l tt l0114@ 163 com
通讯作者:罗素兰,女,教授,博导; T e:l 089866289538, Em ai:l luosulan2003@ 163 com
毕赤酵母 (P ichia pastoris )是目前应用最广泛
的外源蛋白表达系统之一, 该表达系统易于操作
培养、快速生长、表达量高, 同时又能对外源真核
基因进行正确翻译和翻译后加工与修饰, 并能对
许多蛋白质产物进行分泌表达, 使产物易于提纯。
近年来该表达系统极受研究者的青睐, 已用该系
统成功表达了 500多种来自病毒、细菌、真菌、动
植物和人的蛋白 [ 1]。
在毕赤酵母表达系统中外源目的基因能够稳定
表达,必须整合到酵母染色体中。所以毕赤酵母重
组子基因组 DNA的提取是鉴定外源目的基因是否
正确插入的先决条件 [ 2]。但因为酵母是真核细胞
拥有细胞壁, 难以破坏,所以提取酵母基因组 DNA
比提取大肠杆菌 DNA要困难得多。一般来说,制备
酵母基因组 DNA模板进行 PCR [ 3]等常规方法所要
求的基因组 DNA质量要求不高,但会出现假阳性的
现象,而进行 Southern杂交等试验, 需要至少 ( 10
g)非常高质量的基因组 DNA用于酶切消化。本
试验通过几种提取酵母基因组 DNA的不同方法, 探
索出适合大规模提取高质量的酵母基因组 DNA的
方法,为进一步鉴定提供保证。
2010年第 1期 唐天乐等:高质量毕赤酵母基因组 DNA提取方法比较
1 材料与方法
11 材料
111 菌株以及载体 酵母菌 GS115以及表达载
体 pPICZA购于 Inv itrogen公司。
112 仪器 超声波破碎仪 SON ICS(VCX500)、液
氮研钵、B ioR ad DNA电泳仪、B ioRad SmartspecTM
plus分光光度计、凝胶成像分析系统 ( A lpha2200
美国 )。
113 主要试剂 蜗牛酶购置上海缘聚生物技术
有限公司。Ly ticase酶 ( 3 000 U )购于天根生物公
司。DNA M arker EcoT14 digest为大连 TaKaR a
B iotech公司产品。酵母基因组提取试剂盒为天根
酵母基因组 DNA提取试剂盒, 其他为国产分析纯
试剂。
114 溶液配制 DNA缓冲液: 100 mmol /L Tris
HC ,l pH 80, 10 mmo l/L EDTA, 1% SDS 裂解液
( 2% T riton X100, 1 % SDS, 01 mo l/L NaC ,l
10 mmo l/L T risHC l pH80, 1mmo l /L EDTA )。蜗
牛酶缓冲液: 01 mo l/L 磷酸缓冲液, pH74,
025mo l/L M gC12用 022 m细菌滤膜过滤除菌。
PBS缓冲液: 001 mo l/L N a2 HPO4和 N aH 2 PO4,
pH70, 015 mol /L NaC l。YPD液体培养基: 10 g酵
母提取物和 20 g蛋白胨溶于 900 mL水中, 高压灭
菌 20m in后,加入灭菌的 100mL的 20%葡萄糖溶
液,混匀保存。01mo l/L磷酸钠缓冲液 ( pH74)的
配置: 774 mL 01 mol /L Na2HPO 4 + 226 mL 01
mo l/L N aH2 PO 4。山梨醇 buffer: 用 01 mol /L磷酸
钠缓冲液 ( pH74)配置 12mo l/L山梨醇。
12 酵母基因组 DNA提取方法
121 蜗牛酶破壁法 [ 4] 将 2 mL菌液 12 000 r/
m in离心 2 m in, 弃上清,沉淀中加入 500 L PBS重
悬, 12 000 r /m in离心 2 m in; 弃上清, 重复悬浮一
次,沉淀溶于 100 L含 20 mg /mL的蜗牛酶溶液
中, 45∀ 作用 2 h再加 100 L裂解液, - 20∀ 冷冻,
然后室温震荡溶解,反复 3次;向悬浮液中加入 150
L 5mo l/L KAc( pH 89)轻轻混匀, 然后 10 000 r/
m in离心 5 m in; 将上清转移到一新的 15 mL离心
管中, 加入 2倍体积的乙醇, 轻轻混匀, 室温放置 5
m in后 12 000 r/m in离心 10 m in; 除去上清,将沉淀
溶解在 100 L TE ( 10 mmo l/L TrisHC ,l pH74, 1
mmo l/L EDTA, pH80 )中, 加入 6 L RNaseA ( 10
mg /mL) , 37∀ 温浴 30m in;加入等体积的酚 #氯仿 #
异戊醇 ( 25#24#1) ,颠倒混匀, 12 000 r/m in离心 5
m in, 转移上清至另一新离心管, 重复抽提 1次, 用
1 /10体积的 3 mo l/L醋酸钠 ( pH52)、25倍体积
的乙醇沉淀 DNA,之后用 75%乙醇洗涤沉淀两次,
干燥后用 20 L ddH 2O溶解。
122 超声波破碎法 接种酵母 50 mL YPD培养
基, 30∀ , 培养 16 - 18 h; 室温下, 4 000 r /m in离心
5m in收集菌体, 菌体用灭菌水洗 1次, 4 000 r/m in
离心 5m in,加入 3mL 1mo l/ L山梨醇, 放置冰上,设
置超声强度 36% , 超声时间 3 m in,超声 30 s, 停滞
30 s。使用 ! 3mm锥形小接头进行细胞的破碎, 加
入收集菌体、再加入 5 mL DNA缓冲液 ( 100 mmo l/
L T risHC l, pH80, 10mmo l /L EDTA, 1% SDS) ,混
匀, 65∀ 保温 1 h。10 000 r /m in离心 15 m in。上清
用酚氯仿异戊醇抽提 2次, 每次 5 000 r /m in离心 7
m in。加 6 L RNaseA ( 10 mg /mL) , 用 25倍乙醇
沉淀过夜 (加 03 mol / L醋酸钠, pH 52), 10 000 r /
m in离心 10m in。75%乙醇洗 2次, 风干。加 50 L
ddH2O溶解。
123 液氮研磨法 接种含有目的基因的酵母重组
子 GS115 pPICZA到 50mL YPD,在 30∀ 生长至对数
生长晚期。滤液 4 000 r /m in离心 10m in。菌体用液
氮碾磨破壁。加 7 mL DNA缓冲液 ( 100 mmo l/ L
TrisHC,l pH80, 10mmo l/L EDTA, 1% SDS)。混匀,
65∀ 保温 1 h。10 000 r/m in离心 15m in。上清用酚氯
仿异戊醇抽提 2次,每次 5 000 r/m in离心 7m in。加 6
L RNaseA ( 10mg /mL),用 25倍乙醇沉淀过夜 (加
03mo l/L醋酸钠, pH52), 10 000 r/m in离心 10 m in。
75%乙醇洗 2次,风干。加50 L ddH2O。
124 Lyt icase破壁法 [ 5] 接种有目的基因的酵母
重组子 GS115 pPICZA到 10 mL酵母试管培养基
中 (YPD培养基 ) , 30∀ , 培养 18 h; 取 15 mL酵母
培养液,室温下, 4 000 r/m in离心 5- 10 m in收集菌
体; 菌体用灭菌水洗 1次, 4 000 r/m in离心 5m in; 菌
体用 1 mo l/L山梨醇溶液重悬,加入 5 L 10 U /L
溶菌酶 ( Lyticase) 30∀ 温浴 30m in;加入 100 L 2%
SDS混匀, - 20∀ 冰冻,然后室温震荡溶解, 反复 3
次; 向悬浮液中加入 150 L, 5 mo l/L KA c( pH89)
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生物技术通报 B iotechnology Bulletin 2010年第 1期
轻轻混匀, 然后 10 000 r/m in离心 5m in; 将上清转
移到 1个新的 15mL离心管中, 加入 2倍体积的乙
醇,轻轻混匀,室温放置 5m in后 12 000 r/m in离心 10
m in;除去上清,将沉淀溶解在 100 L TE ( 10mmol /L
TrisHC l pH74, 1 mmo l/L EDTA pH80)中, 加入 6
L RNaseA ( 10mg /mL) , 37∀ 温浴 30m in; 加入等体
积的酚#氯仿#异戊醇 ( 25#24#1), 然后 10 000 r/m in
离心 5 m in;转移上清到 1个新的 15 mL离心管中,
加入 1 /2体积的 75mol /L NH 4A c( pH75)和等体积
的异丙醇, - 20∀ 放置 20m in后 12 000 r/m in离心 10
m in;除去上清,加入 300 L 75%乙醇漂洗沉淀 1次,
10 000 r /m in离心 5 m in; 风干除去乙醇, 用 20 L
ddH2O溶解酵母 DNA。
125 试剂盒法 按照所购试剂盒说明书进行提
取。接种有目的基因的酵母重组子 GS115 pPICZA
到 10 mL酵母试管培养基中 ( YPD培养基 ) , 30∀ ,
培养 18 h; 取 15 mL酵母培养液, 12 000 r/m in离
心 1 m in收集菌体,加入 600 L山梨醇 buffer, 5 L
10U /L溶菌酶 ( Lyt icase) , 30∀ 处理 30m in。4 000
r /m in离心 10 m in, 沉淀中加入 200 L缓冲液 GA
重悬, 加入 20 L蛋白酶 K混匀,加入 4 L RNaseA
( 100mg /mL), 室温放置 5 m in。加入 220 L缓冲
液 GB,颠倒混匀, 70∀ 放置 10 m in, 加 220 L无水
乙醇充分颠倒混匀, 所得溶液和沉淀都加入吸附柱
中, 12 000 r/m in离心 30 s, 向吸附管中加入 500 L
缓冲液 GD, 12 000 r/m in离心 30 s,向吸附柱中加入
500 L漂洗液 PW洗两次, 最后加入 30 L ddH 2O
洗脱柱子上的酵母基因组 DNA。
13 电泳检测酵母基因组 DNA
电泳条件如下, 1%琼脂糖凝胶, 核酸染料 Go ld
V iew, M arker( EcoT14 d igest)点样 3 L, 每加样孔
上样量 1 L, 80 V恒定电压 25 m in, 然后用凝胶成
像系统 ( A lpha2200)拍照。
14 测定酵母基因组 DNA纯度及浓度
样品稀释 10倍, 终体积 50 L, 做 3个平行对
照, 混匀后用 B ioR ad Sm artspecTM plus分光光度计
测定,分析各种方法所提酵母基因组 DNA纯度及
浓度。检测基因组 DNA质量是否达到 Southern杂
交等试验的要求。A 260值代表其浓度, 一般 OD260 /
OD280 < 17, 表明样品中蛋白质含量过多; OD260 /
OD280 > 20, 表明 RNA含量过多; OD260 /OD280为 18
表示纯度好。
DNA浓度 (g /L) = 50 ∃OD260读数
∃稀释倍数 /1 000
DNA纯度 = OD260 / OD280
2 结果与分析
21 琼脂糖凝胶电泳检测酵母基因组 DNA
从电泳结果 (图 1)可以看出, 各种方法所提酵
母基因组 DNA分子大小基本一致。图 1中的第 1,
3, 4泳道条带较亮; 第 2, 5泳道条带较暗。说明酶
法、Lyticase破壁法和液氮研磨法明显好于超声波破
碎法和试剂盒法。第 2, 3, 5泳道均有不同程度的拖
尾现象。相比之下,蜗牛酶破壁法所提取的酵母基
因组 DNA (图 1第 1泳道 )的量和完整性最好。
M EcoT14 d igest分子量标准; 1蜗牛酶破壁法;
2超声波破碎法; 3液氮研磨法; 4 Lyticase破壁法;
5及试剂盒法
图 1 不同方法提取酵母基因组 DNA的电泳效果
22 各种方法提取的酵母基因组 DNA的浓度比较
用分光光度计测定出了各种方法提取的酵母基
因组 DNA的浓度 (图 2)。结果表明,浓度比较高的
是液氮研磨法, Lyt icase破壁法,蜗牛酶破壁法,这几
种方法测定的 DNA浓度均在 08 g /L以上, 使用
不到 12 L就能满足酶切需要。而超声波破碎法与
试剂盒法所提取的 DNA浓度较低。从起始菌液体积
来看,超声波破碎法与液氮研磨法用了 50mL菌液,
其于 3种方法只用了 15- 2 mL菌液。虽然液氮研
磨法的 DNA浓度最高为 10205 g /L,但这是从 50
mL菌液中提取的, 仅溶于 50 L ddH 2O中的浓度。
因此,从 DNA得率来看,蜗牛酶破壁法是最高的。
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2010年第 1期 唐天乐等:高质量毕赤酵母基因组 DNA提取方法比较
1.蜗牛酶破壁法; 2. 超声波破碎法; 3. 液氮研磨法;
4. Lyt icase破壁法; 5.试剂盒法
图 2 不同方法提取的酵母基因组 DNA浓度对比
23 各种方法提取的酵母基因组 DNA的纯度比较
通过 B ioRad SmartspecTM plus分光光度计测
定各个 DNA的纯度如表 1所示。 5种方法所提取
的 DNA都在 OD260处有显著吸收峰。其 OD260 /
OD280比值都在 17以上,接近 18,说明它们的纯度
都较高,去蛋白和去 RNA的效果都较好。为了不影
响后续酶切等试验, 本研究没有使用 TE缓冲液溶
解 DNA, 而使用了 ddH 2O。若用 TE缓冲液溶解
DNA, 由于 pH值和离子存在会稍微影响光吸收值,
其 OD260 /OD280比值会稍高,更接近标准值 18[ 6, 7]。
表 1 不同方法提取酵母基因组 DNA的纯度对比
方法 蜗牛酶破壁法 超声波破碎法 液氮研磨法 Lyticase破壁法 试剂盒法
OD 260 /OD 280 1753 176 1702 1766 1787
3 讨论
本研究通过比较 5种提取酵母基因组 DNA的
效果表明,两种酶法所提酵母基因组 DNA的质量较
高,其中蜗牛酶法是最好的一种;超声波破碎法容易
打断 DNA,拖尾现象明显, 破碎大量细胞也存在破
碎不充分的现象;液氮研磨法所提酵母基因组 DNA
虽然浓度较高,但纯度是几种方法中最低的,去蛋白
的效果不好;试剂盒方便但其柱子载量限制,很难得
到较高浓度的酵母基因组 DNA。
蜗牛酶是一类混合酶,其中包括纤维素酶、蛋白
水解酶和果胶酶等,有 30- 40种之多,而酵母细胞
壁呈 三明治 !结构: 外层主要为甘露聚糖, 内层主
要为葡聚糖, 中间层主要是蛋白质, 为多种物质构
成。根据贾艳萍等的研究, 蜗牛酶的多种酶能够协
同作用于酵母细胞壁从而达到较好的破壁效果,而
溶菌酶是单一酶只能破坏酵母细胞壁一种物质,故
而破壁效果不好 [ 8, 9 ]。本试验结果表明, 蜗牛酶与
Ly ticase溶菌酶的破壁效果差异不明显,但蜗牛酶价
格远远低于 Ly ticase溶菌酶, 在起到同样破碎效果
的情况下大大节省了提取酵母基因组 DNA的成本。
王志博等 [ 8]研究表明, 蜗牛酶破壁的最佳条件是
45∀ 、酶作用时间 6 h, 在本研究中, 通过 2 h酶解,
加上反复的冻融方法,同样达到了很好的破壁效果,
缩短了酶作用时间。
Southern杂交等试验需要至少 ( 10 g)非常高
质量的基因组 DNA用于酶切消化。而本研究所提
供的蜗牛酶破壁法所提取的酵母基因组 DNA使用
不到 12 L就能满足酶切需要。因此,本试验提供
的蜗牛酶破壁法是一种经济, 高效的制备毕赤酵母
基因组 DNA的理想方法。
参 考 文 献
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