全 文 ：研究报告
生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2010年第 8期
通用型转铁蛋白融合表达载体的构建及应用价值
王峰 孙晗笑 莫雪梅 李秀英 张光
(暨南大学药学院基因组药物研究所,广州 510632 )
摘 要: 构建通用型转铁蛋白融合表达载体, 利用 PCR方法扩增编码人转铁蛋白 N端半分子的基因片段, 通过酶切、连
接、转化等分子克隆方法构建通用型转铁蛋白融合表达载体。 PCR扩增了一个长约 1 1 kb的包含 Sca I酶切位点的基因片
段, 插入 pP ICZ的 Pm l I和 X ba I酶切位点,转化后进行菌液 PCR鉴定,成功获得重组子 pP ICZT fN,测序结果表明载体构建
成功, 重组质粒 pP ICZT fN能被 S ca I酶切。本研究成功构建通用型转铁蛋白融合表达载体, 构建的载体可以用于转铁蛋白
融合表达载体的构建。
关键词: 转铁蛋白 PCR 载体构建
Construction and Application Value ofUniversal
Transferrin Fusion Expression Vector
W ang Feng Sun H anx iao M o Xueme i L iX iuy ing ZhangGuang
( Institute of Genom icM edicine, College of Pharmacy, J inan University, Guangzhou 510632)
Abstrac:t To construct the un iv ersal transferr in fusion express ion vector, PCR w as em ployed to amp lify theNterm inal ha lfm o lec
u lar of hum an transfe rr in gene. M o lecular clon ingm ethods, including dig estion, liga tion, transfo rm ation w ere used to construct the un ive r
sal transferrin fus ion expression vector. A 1. 1 kb DNA fragm ent conta in ing theS ca I site w as amp lified and it w as inserted intoPm l I
and X ba I sites of pP ICZ. A fter transform ation and PCR identifica tion, recomb inan t p lasm id pP ICZT fN was obta ined successfully. Se
quencing analysis indicated that the open reading fram ew as correc tly. The p lasm id pP ICZT fN can be linearized byS ca I. The un ive r
sal transferrin fus ion expression vector w as constructed successfu lly in th is study.
Key words: T ransferr in PCR Vector construction
收稿日期: 20100209
基金项目:国家自然科学基金青年基金项目 ( 30700704)
作者简介:王峰,男,博士,助理研究员,从事基因工程药物研究; Em ai:l novelfunction@ 163 com
通讯作者:孙晗笑,从事基因工程药物研究; Em ai:l sunhx718@ yahoo. com. cn
人转铁蛋白 ( human transferrin, hT f)是由 679个
氨基酸组成,分子量约 76. 5 kD,其半衰期为 8 d,是血
浆中主要的含铁蛋白质,直接参与体内铁代谢,负责
运载由消化管吸收的铁和由红细胞降解释放的铁,从
而承担对铁的吸收、贮存和利用部位之间的转运 [ 1]。
由于人转铁蛋白本身在人体普遍存在,因此无毒、无
副作用,安全性较好;另一方面, 转铁蛋白受体在人的
口腔上皮细胞, 尤其是胃肠上皮细胞,小肠上皮细胞
高丰度的表达, T f还可以抵抗胃肠道胰凝乳蛋白酶和
胰蛋白酶的降解作用 [ 2- 4]。因此, T f是蛋白多肽类药
物的理想运输载体。近年来转铁蛋白在蛋白多肽类
药物的靶向传递及口服给药方面取得了一些进
展 [ 3, 4]。本试验旨在构建通用型转铁蛋白融合表达载
体,为进一步研究其作为药物运输载体奠定基础。
1 材料与方法
1. 1 材料
限制性内切酶 Pml I、X ba I、Sca I、T4连接酶、
dNTP购自 TaK aRa公司; KODplus聚合酶购自 Toyo
bo公司; PCR纯化试剂盒、抗生素购自鼎国公司;质
粒快速提取试剂盒购自博大泰克公司;引物合成于上
海英骏公司; 其它试剂均为国产分析纯。 pPICZ为
本室保存; pMD18ThTf为本实验室构建 [ 5]。
1. 2 方法
1. 2. 1 引物设计 P1: 5GGTGACACAACTCACA
2010年第 8期 王峰等:通用型转铁蛋白融合表达载体的构建及应用价值
CATCCGGAGTCCCTGATAAAACTGTGAGATG 3,划
线部分 IgG3序列;
P2: 5AG TCTAGA CTTTCATCTGTTGGGGCTTCT
3,阴影为 Xba识别序列;
P3: 5AC CACGTG G AGTACT ACCCCACTTGGT
GACACAACTCAC3,划线为部分 IgG3序列,阴影为
Pml I识别序列, 方框内为 Sca I识别序列。 5
AOX1: 5GACTGGTTCCAATTGACAAGC3, 3AOX1:
5GCAAATGGCATTCTGACATCC3。
1. 2. 2 PCR扩增及产物回收 PCR反应体系: 10
buffer 8 L, 25 mmo l/L M gSO4 4 L, 10 mmo l /L
dNTP 8 L, 20 mo l/L P1 2 L, 20 mo l/L P2 2
L, KODplus聚合酶 4 L, 加水至 80 L。PCR反
应条件: 94 变性 5 m in后, 进行 30个循环, 程序:
94 变性 30 s, 55 退火 30 s和 72 延伸 80 s。从
琼脂糖凝胶上切下含目的片段的电泳条带, 按胶回
收试剂盒使用说明书进行 PCR产物回收。
1. 2. 3 质粒提取及酶切 质粒提取采用北京博大泰
克质粒快速提取试剂盒。酶切反应体系为 DNA 30
L,对应的 10 buffer 4 L,限制性酶 1 L,加水至
40 L。
1. 2. 4 连接反应及重组质粒转化 取回收的 PCR
产物 4 L, pMD18T 载体 1 L, 5 buffer 2 L, T4
DNA连接酶 1 L, 加水至 10 L, 16 过夜。用
CaC l2法转化 DH5感受态宿主菌,涂布于含有 Zeo
cine的 LB培养基平板, 37 培养过夜。
1. 2. 5 重组子的鉴定 挑取单克隆接种于 400 L
LB培养基中, 37 震荡培养过夜,以引物 3AOX和
5AOX进行菌液 PCR鉴定。在 1. 0%琼脂糖凝胶中
电泳分离 PCR产物,通过片段大小判断是否为重组
子。将鉴定正确的克隆送英骏公司测序。
2 结果
2. 1 PCR扩增 hT fN基因
以质粒 pMD18ThTf为模板, P1和 P2引物组
合建立 PCR反应体系,可以扩增 1. 1 kb左右的条
带 (图 2) , 初步鉴定为所需目的基因。再以其为
模板, 用 P3和 P2引物组合扩增引入 Pml I、S ca I、
Xba I酶切位点。其中 Pml I、Xba I位点为克隆进
pPICZ载体的位点, 而 Sca I位点为外源药物蛋白基
因插入位点。
图 1 构建流程图
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M. DL 2000分子量标准; 1. hT fN扩增片段
图 2 PCR扩增产物琼脂糖凝胶电泳
2. 2 载体的制备
从大肠杆菌中提取质粒 pPICZ, 用 Pm l I和
Xba I进行酶切, 将其线性化制备载体, 电泳结果如
图 2所示。 1号泳道为未酶切的载体质粒 pPICZ,
其形态为环状,在琼脂糖凝胶中受到的阻力小,故在
电泳时迁移的较快。 2号泳道 3. 6 kb大小的片段为
酶切后的线性化载体,跟预期的结果相符,表明制备
载体成功。
1. pPICZ; 2. pP ICZ /Pm l I& X ba I; M. /H ind
图 3 pPICZ酶切琼脂糖凝胶电泳
2. 3 鉴定重组子
将连接产物转化到大肠杆菌 DH5, 挑取 7个
单菌落小量培养, 使用引物 3AOX和 5AOX (其在
载体上的位置如图 1所示 )对菌液进行 PCR扩增鉴
定, PCR产物电泳结果如图 4所示。 4号泳道扩增
出 1. 7 kb左右的片段, 表明此泳道对应的单菌落中
所含的质粒有外源片段 T fN基因的插入,将此克隆
送英骏公司测序。而其它泳道扩增出 600 bp左右
的片段,表明没有外源片段的插入即空载体。将重
组质粒命名为 pPICZTfN。用 5AOX引物测序, 测
序峰图如图 5,峰形较好,序列内含有 Pm l I和 S ca I
酶切位点,序列与预期一致。
2. 4 pPICZT fN的 Sca I酶切
从阳性克隆提取质粒 pPICZTfN, 用 Sca I进
行酶切, 如图 6,载体被线性化切成 4. 6 kb左右的条
带, 与预期大小一致, 这表明重组 pPICZTfN质粒
中含有 Sca I酶切位点, 而此位点即为设计的外源药
物蛋白基因的插入位点。
1- 7.不同单菌落的菌液 PCR产物电泳结果; M. DL 2000分子
量标准
图 4 菌液 PCR扩增产物琼脂糖凝胶电泳
图 5 pP ICZTfN测序峰图
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1. pPICZT fN /Sca I; M. /H ind
图 6 pPICZTfN酶切琼脂糖凝胶电泳
3 讨论
本试验根据 IgG3氨基酸序列设计了引物, 构建
了含有 Sca IIgG3TfN结构的通用型酵母表达载
体,插入外源基因后在酵母中能表达药物蛋白 IgG3
TfN的融合蛋白结构。 IgG3上游铰链区由 11个氨
基酸组成, 其序列为 TPLGDTTHTSG, 柔性好、活动
度较大,作为连接肽连接药物蛋白和 T fN,可以保证
两端蛋白的空间构象互不影响 [ 6 ]。设计的 S ca I酶
切位点为外源药物蛋白基因插入位点, 酶切末端为
平末端, 应用 pPICZTfN构建融合载体时, 只需将
Sca I酶切、脱磷的 pPICZT fN载体, 直接与加磷的
PCR产物进行连接, 避免了外源片段的酶切步骤,
不用考虑外源基因片段内部的酶切位点及载体上的
其它酶切位点影响, 同时, Sca I酶切、脱磷的
pPICZTfN载体可以一次性大量制备,这样可以大
大简化连接步骤,极大程度的方便任何外源蛋白药
物基因的插入。由于连接为平端连接, 虽然有正反
两个插入方向,但可以用 5AOX和外源基因的下游
引物组合来有效鉴定外源基因的插入方向。
人转铁蛋白分子含有两个功能类似的结构域,
这两个结构域有一定的同源性,每个结构域均能结
合一个铁原子和一个碳酸阴离子,且均含有保守的
结合铁原子和碳酸阴离子的氨基酸位点 [ 5, 7]。转铁
蛋白基因的 N端半分子可以在毕赤酵母中进行表
达, 活性检测表明表达蛋白可以结合并释放铁原子,
这表明体外表达的具有单个 N端结构域的蛋白仍
具有活性 [ 8]。有研究者利用基因工程制备了干扰
素与转铁蛋白 N端半分子的融合蛋白, 虽然融合蛋
白具有抗病毒活性及铁结合能力,但比活下降,可能
是由于干扰素与转铁蛋白之间没有连接肽造成
的 [ 9]。本研究构建了通用型转铁蛋白融合表达载
体, 为进一步开发基于转铁蛋白的蛋白质药物传递
新途径奠定了良好的基础。
参 考 文 献
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