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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2011 年第 11 期
碱性 α-淀粉酶基因在巨大芽孢杆菌中的
表达及酶学性质研究
金辉1，2 廖思明1，2 王青艳1，2 刘筱梦1 黄日波1，2
(1广西大学生命与科学技术学院，南宁 530004;2广西科学院国家非粮生物质能源工程技术研究中心，南宁 530007)
摘 要: 将已克隆的碱性 α-淀粉酶基因信号肽编码序列去除，用 PCR的方法加入酶切位点，然后与表达载体 pHIS1525
连接转化大肠杆菌 DH5α，筛选出阳性转化子 DH5α-pHIS1525-JH，并提取质粒进一步转化巨大芽孢杆菌 YYBm1 原生质体，获
得基因工程菌 YYBm1-pHIS1525-JH。SDS-PAGE分析表明该基因在巨大芽孢杆菌中得到了有效表达。酶学性质研究表明，该
酶的最适温度与 pH 值分别为 60℃与 pH8. 5，在 pH7. 0 － 10. 5 之间具有较好的稳定性，Km值为 1. 94 mg /mL，酶活力可
达2 516. 5 U。
关键词: 碱性 α-淀粉酶 巨大芽孢杆菌 芽孢杆菌表达系统 基因表达 酶学性质
Expression and Enzyme Properties Analysis of Alkaline
α-amylase in Bacillus megaterium
Jin Hui1，2 Liao Siming1，2 Wang Qingyan1，2 Liu Xiaomeng1 Huang Ribo1，2
(1College of Life Science and Technology Guangxi University，Nanning 530004;2National Engineering Research
Center for Non-grain Biorefinery Guangxi Academy of Sciences，Nanning 530007)
Abstract: The signal peptide coding sequence of cloned gene alkaline α-amylase was removed，with the PCR method of adding re-
striction sites，and then connected with the expression vector pHIS1525 transformed into E. coli DH5α，screening positive recombinant
DH5α-pHIS1525-JH． The plasmid from the recombinant DH5α-pHIS1525-JH was transformed into protoplasts of Bacillus megaterium
YYBm1 to obtain genetically engineered bacteria YYBm1-pHIS1525-JH． SDS-PAGE analysis showed that the gene in Bacillus megateri-
um haven been effective expressed． Enzyme properties studies have shown that，the optimum temperature and pH values were 60℃ and
pH8． 5，the enzyme is stable at pH7. 0 － 10. 5，Km value is 1. 94 mg /mL，and enzyme activity was 2 516. 5 U．
Key words: Alkaline α-amylase Bacillus megaterium Bacillus expression system Gene expression Enzyme properties
收稿日期:2011-04-12
基金项目:广西自然科学基金重点项目(2010GXNSFD013030) ，广西科学院基金项目(09YJ17SW02)
作者简介:金辉，男，硕士研究生，研究方向:酶工程;E-mail:zjjinhui1985@ 163. com
通讯作者:黄日波，男，教授，博士生导师，研究方向:发酵工程和酶工程;E-mail:rbhuang@ gxas． cn
淀粉酶作为水解淀粉和糖原酶的总称，广泛存
在于动植物以及微生物中，它是最早实现工业化生
产且迄今为止仍被广泛应用的酶制剂之一。碱性
α-淀粉酶适应于 pH 值高的碱性环境，故可以用于
洗涤剂、淀粉水解和纺织等行业，因此是有待开发的
新酶源［1］。本试验将一段筛选到的碱性 α-淀粉酶
基因成功在外源宿主中得到表达，希望能得到适用
于某个行业生产的碱性 α-淀粉酶。
随着 α-淀粉酶分子生物学的研究不断深入，越
来越多的 α-淀粉酶基因被克隆与表达，其中使用最
多的宿主就是大肠杆菌。然而，巨大芽孢杆菌具有
分布广泛，生化功能多样，以及能利用多种碳源，蛋
白表达产量高，稳定性好，分泌的蛋白易纯化，良好
的发酵基础和生产技术等优点［2］，比大肠杆菌更具
表达宿主的优势。经过多年的研究与开发，巨大芽
孢杆菌外源蛋白表达系统已经比较成熟，是一种比
较方便廉价的基因表达形式，并已经成功应用于多
种外源蛋白的分泌表达，但是碱性 α-淀粉酶基因在
2011 年第 11 期 金辉等:碱性 α-淀粉酶基因在巨大芽孢杆菌中的表达及酶学性质研究
其成功表达的报道还比较少。
本试验旨在通过原生质体转化法将已克隆的碱
性 α-淀粉酶基因转入巨大芽孢杆菌 YYBm1 中，实
现该基因在宿主中的高效表达，丰富巨大芽孢杆菌
表达系统外源蛋白的表达种类，并对表达产物进行
酶学性质的研究。
1 材料与方法
1. 1 材料
1. 1. 1 菌种与质粒 大肠杆菌 E. coli DH5α 为本
实验室保存，Bacillus megaterium YYBm1 与质粒
pHIS1525 购于 MoBiTec 公司，质粒 pMD18-T Vector
购于 TaKaRa 公司，Anoxybacillus GXTC-3 为本实验
室筛选保存。
1. 1. 2 培养基 LB培养基见参考文献［3］;AB3培
养基配成 1. 75 %，购于 Difco公司;芽孢杆菌转化培
养基、SMM 液、SMMP 液和 CR5 培养基参考 Mo-
BiTec公司操作手册;发酵培养基使用 LB培养基。
1. 1. 3 酶和试剂 Taq DNA 聚合酶、各种限制性内
切酶、T4 DNA 连接酶、DL2000 DNA Marker、λ-HindⅢ
digese DNA Marker 购于 TaKaRa 公司;细菌 DNA 提
取试剂盒、凝胶回收试剂盒、质粒提取试剂盒、DNA
纯化试剂盒、蛋白质 Marker、Bradford 蛋白定量试剂
盒购于天根生化科技有限公司;氨苄青霉素、四环素、
溶菌酶购于上海生工生物工程技术服务有限公司。
1. 2 方法
1. 2. 1 引物设计 根据碱性 α-淀粉酶基因序列及
表达载体 pHIS1525 酶切位点序列，结合信号肽预测
结果，应用 Primer Premier 5. 0 软件设计 PCR 引物，
在上游引物 5端引入 3 个保护碱基 ATC 和一个
BanⅡ位点，在下游引物 5端引入 3 个保护碱基
ATC 和 1 个 NaeⅠ位点:上游引物(P1) :5-ATC
GAGCTCAAAACAGAGCGAACGTGGC-3;下游引物
(P2) :5-ATCGCCGGCTGATGCTTTTCGTTTACGC-3。
1. 2. 2 细菌 DNA 的提取 细菌 DNA 的提取和
DNA的纯化分别按细菌 DNA 提取试剂盒和 DNA
纯化试剂盒操作说明进行。
1. 2. 3 目的基因的获得 以提取的 Anoxybacillus
GCTC-3 菌株的总 DNA为模板，根据设计的引物 P1
和 P2 进行 PCR。PCR 反应体系为 50 μL，含有 50
ng DNA，0. 2 mmol /L dNTP，25 pmol 每种引物，1 ×
PCR反应缓冲液，2. 5 U Taq DNA 聚合酶。反应程
序:94℃预变性 3 min;94℃变性 35 s，50℃复性45 s，
72℃延伸 1 min 30 s，30 个循环后;72℃ 再延伸
10 min。
1. 2. 4 重组表达质粒的构建 胶回收 PCR 产物，
用 BanⅡ 和 NaeⅠ双酶切并进行 DNA纯化，然后与
同样双酶切处理并回收的表达质粒 pHIS1525 用 T4
DNA 连接酶进行连接，转化大肠杆菌 E. coli DH5α。
在含有氨苄青霉素(100 mg /L)的 LB 平板上长出菌
落后，随机挑取 9 株于含相同氨苄青霉素 LB 液体
培养基培养后提取质粒并通过质粒 PCR 筛选阳性
转化子。
1. 2. 5 重组质粒转化巨大芽孢杆菌 YYBm1 巨大
芽孢杆菌原生质体的制备参考文献［4］。将构建好
的重组表达质粒按 MoBiTec公司的操作手册进行芽
孢杆菌的转化。
1. 2. 6 碱性 α-淀粉酶基因的诱导表达 将重组芽
孢杆菌接入含 10 μg /mL 四环素的 LB 培养基中
37℃培养过夜，以 2%的接种量接种到含有相同抗
生素浓度的 LB 培养基中 37℃继续培养，当菌体浓
度达到 OD600 = 0. 3 时加木糖到终浓度 0. 5%，进行
诱导表达。诱导表达 6 h 后取样，在 4℃条件下
6 000 r /min离心 10 min收集上清。
1. 2. 7 表达产物的分离纯化 将表达的上清液过
镍柱进行分离纯化［5］。
1. 2. 8 表达产物的分析与鉴定 通过对上清液纯
化产物的 SDS-PAGE 电泳检测，按照表达蛋白的分
子大小进行鉴定。
1. 2. 9 酶活力的测定 取 450 μL 浓度为 1%(W/
V) ，用 0. 05 mol /L Tris-HCl缓冲液(pH8. 5)配置的淀
粉溶液，60℃预热 10 min，加入 50 μL 酶液后 60℃反
应 10 min，用 DNS 法测定产生的还原糖。一个酶活
单位(U)定义为在上述反应条件下 1 mL酶液每分钟
水解淀粉产生相当于 1 μg葡萄糖所需的酶量［6］。
1. 2. 10 蛋白质含量的测定 按 Bradford 方法，以
牛血清白蛋白绘制标准曲线分。根据标准曲线计算
出酶液中的蛋白质含量。
1. 2. 11 酶学性质的研究
1. 2. 11. 1 最适反应 pH 和 pH 稳定性 在 pH
4. 0 － 10. 5 范围内，每隔 0. 5 个 pH 梯度测定酶活
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力;将酶液静置于不同 pH 值的缓冲液，在相对稳定
的 50℃保存 30 min，测定残余酶活力。以酶活最高
为 100%，其余酶活与之相比计算相对酶活。
1. 2. 11. 2 最适反应温度和热稳定性 在 40 －
75℃范围内，每隔 5℃测定酶活力;在 pH8. 5 浓度为
1%的淀粉液下，把酶液在 40 － 75℃范围内，每隔
5℃保存 30 min，并测定残余酶活。以酶活最高为
100%，其余酶活与之相比计算相对酶活。
1. 2. 11. 3 酶的 Km值的测定 在最适 pH和最适温
度下，分别测定酶液在淀粉底物浓度(S)分别为 1、
1. 25、2、2. 5、4、8、10 及 16 mg /mL 酶活力。绘图计
算出酶的 Km值。
2 结果
2. 1 目的基因的获得
以 Anoxybacillus GXTC-3 菌株的总 DNA 为模
板，通过 PCR扩增的产物大小经琼脂糖凝胶电泳的
结果如图 1，大小与目的基因(1 500 bp)接近，说明
扩增获得了目的基因。
M． DL2000 DNA Marker;1 － 4． PCR产物
图 1 PCR扩增结果
2. 2 重组质粒的构建及验证
将去掉自身信号肽编码序列的碱性 α-淀粉酶
基因插入到质粒 pHIS1525 的 BanⅡ和 NaeⅠ酶切位
点之间，获得重组质粒 pHIS1525-JH，将重组质粒
pHIS1525-JH转化大肠杆菌 E. coli DH5α 感受态细
胞，在含氨苄青霉素抗性 LB 平板上长出菌落后随
机挑 9 株于相同抗性的 LB 液体培养基中培养并提
取质粒进行琼脂糖凝胶电泳，同时以质粒 pHIS1525
为阳性对照(图 2)。从电泳的结果(图 3)来看，在
挑取的 9 个转化子中 2、3、4、6、7 及 9 号质粒相对于
pHIS1525 阳性对照有明显的滞后。挑取 2、3、4 及 6
号质粒进行 PCR，从 PCR 的结果来看，这 4 个转化
子都得到了与目的基因大小一致的产物，说明 2、3、
4 及 6 号都是阳性转化子。
M． λ-Hind Ⅲ digese DNA Marker;1． 质粒 pHIS1525;
2 － 10． E． coli DH5α转化子中的质粒
图 2 E． coli DH5α转化子中的质粒
M． DL2000 DNA Marker;1 － 4．质粒 PCR
图 3 E． coli DH5α转化子中质粒 PCR
2. 3 重组质粒转化巨大芽孢杆菌及验证
从大肠杆菌 E. coli DH5α阳性转化子中提取重
组质粒 pHIS1525-JH，以原生质体法转化巨大芽孢
杆菌 YYBm1，在含四环素抗性半固体平板上长出菌
落后随机挑取 9 株于相同抗性的 LB 液体培养基中
培养并提取质粒进行琼脂糖凝胶电泳，同时以重组
质粒 pHIS1525-JH为阳性对照。经电泳分析，挑取
的 9 个转化子的质粒与质粒 pHIS1525-JH的分子量
大小相同，证明实现了重组质粒的转化。
2. 4 碱性 α-淀粉酶基因的表达鉴定
将重组菌 YYBm1-pHIS1525-JH进行诱导表达，
表达量最大时收集上清液，通过镍柱纯化后进行
SDS-PAGE分析。SDS-PAGE结果(图 4)显示，重组
菌 YYBm1-pHIS1525-JH表达产物的分子量与目的
基因表达产物分子量大小相同，说明目的基因成功
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转入了巨大芽孢杆菌 YYBm1 中并实现了表达，表
达产物的分子量约为 54 kD。
M．标准蛋白分子量;1．纯化后的酶液
图 4 酶的 SDS-PAGE分析
2. 5 蛋白质含量的测定
根据 Bradford法用蛋白定量试剂盒测定蛋白质
标准曲线(图 5) ，根据蛋白质标准曲线计算得出碱
性 α-淀粉酶酶液中的蛋白含量为 0. 114 mg /mL。
2. 6 酶活力的测定
测定得到在最适 pH和最适温度条件下 50 μL
图 5 蛋白质标准曲线
该酶作用 450 μL 1%可溶性淀粉酶 10 min 可水解
产生 1. 258 mg葡萄糖，然后根据酶活力的定义，计
算得到碱性 α-淀粉酶的酶活力为 2 516. 5 U。
2. 7 碱性 α-淀粉酶的性质研究
2. 7. 1 酶最适反应 pH 分别用 pH 4. 0、4. 5、5. 0、
5. 5、6. 0、6. 5、7. 0、7. 5、8. 0、8. 5、9. 0、9. 5、10. 0 以及
10. 5 的磷酸缓冲液，以 1. 0%的可溶性淀粉溶液为
底物，在 60℃条件下反应 10 min，测得不同 pH值下
的酶活力，测得其最适 pH值为 pH8. 5(图 6-A)。
2. 7. 2 酶的 pH 稳定性 将酶液在 pH 值分别为
4. 0、4. 5、5. 0、5. 5、6. 0、6. 5、7. 0、7. 5、8. 0、8. 5、9. 0、
A．酶最适反应 pH;B．酶的 pH稳定性;C．酶的最适反应温度;D．酶的热稳定性
图 6 酶学性质曲线
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9. 5、10. 0 及 10. 5 的磷酸缓冲液中 50℃ 放置 30
min，调 pH至 8. 5 在 60℃下与底物反应 10 min测其
剩余酶活，测得在 pH8. 0 时具有最高耐受性，在
pH7. 0 － 10. 5 之间能保持在最高酶活力的 70%以
上(图 6-B) ，具有较好的耐碱性。
2. 7. 3 酶的最适反应温度 在最适反应 pH8. 5 条
件下，将酶液分别在 40、45、50、55、60、65、70 和 75℃
条件下与底物反应 10 min 测定各反应酶活力。结
果(图 6-C)表明，该酶的最适反应温度为 60℃。
2. 7. 4 酶的热稳定性 在相对最稳定的 pH8. 0 条
件下，将酶液分别在 40℃、45℃、50℃、55℃、60℃、
65℃、70℃和 75℃保存 30 min，再在最适反应温度
60℃测定残余酶活力。结果(图 6-D)表明，温度在
40 －55℃范围内酶活力相对稳定，可保持在 80%以上。
2. 7. 5 酶的 Km值的测定 以不同浓度的可溶性淀粉
为底物，在最适的 pH和温度下测定酶的反应速度，得
到 1 /V与 1 /［S］的关系线(图 7)，并计算得出碱性 α-
淀粉酶对可溶性淀粉的 Km值为 1. 94 mg /mL。
图 7 双倒数作图求酶的 Km值
3 讨论
巨大芽孢杆菌是一种很有潜力的分泌型基因工
程菌，它在表达外源蛋白时有许多优点:能利用多种
碳源，营养要求低，生长快;不具有碱性蛋白酶，表达
的外源蛋白不会被降解，重组质粒稳定，不易丢失;
分泌蛋白的量大且分泌的蛋白易纯化;具有良好的
发酵基础和生产技术。所以巨大芽孢杆菌比大肠杆
菌、枯草芽孢杆菌更适合作为外源蛋白表达的宿主
系统［7］。近年来，许多酶均在巨大芽孢杆菌中得到
了表 达，如 葡 聚 糖 酶［8］、葡 聚 糖 蔗 糖 酶［9］、
Clostridium difficile 毒素 A［10］等。并且许多表达载体
也得 到 了 优 化，如 pHISI1525 和 pSTREP1525、
pSTREPHIS1525 等，使具有亲和标记的重组蛋白易
于分离纯化，并实现了葡聚糖蔗糖酶［9］、果聚糖蔗
糖酶［11］及青霉素酰胺酶［12］等外源蛋白的表达与纯
化。通过试验我们发现碱性 α-淀粉酶基因在巨大
芽孢杆菌中表达量高，其它的杂蛋白含量少，这有利
于后期的纯化工作，并且碱性 α-淀粉酶的酶学性质
也很稳定，试验所采用的质粒是优化过的 pHI-
SI1525，它带有 6 个组氨酸标签，设计引物时不必再
另外加入组氨酸标签，进一步利于外源蛋白的分离
纯化，这些方面的优势充分说明了巨大芽孢杆菌是
一种较理想的外源蛋白表达的宿主系统。
4 结论
通过对碱性 α-淀粉酶酶学性质的研究发现，该
酶的最适反应温度为 60℃，最适反应 pH 为 8. 5，在
pH7. 0 － 10. 5 的范围内相对稳定，使得它可以应用
于加酶洗涤剂中以除去含有淀粉食物污垢的食品，
还可以应用于纺织工业人造棉、人造丝的退浆，也可
以与碱性纤维素酶共同作用，以及进行垃圾处理等
领域，具有较大的应用前景，达到了试验的预期
目标。
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