全 文 ：研究报告
生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2010年第 5期
西瓜根际枯萎病拮抗放线菌的筛选及鉴定
赵丽明 丁延芹 路晓萌 姚良同 杜秉海
(山东农业大学生命科学学院 农业微生物学重点实验室,泰安 271018)
摘 要: 从西瓜根际分离获得了 32个放线菌分离物, 通过离体拮抗试验,筛选出 3株对西瓜枯萎病有良好拮抗效果的
放线菌, 编号为 XF9、XF18和 XF22。通过对其进行形态学观察、生理生化测定以及 16S rDNA序列分析, 初步确定 XF9为灰色
链霉菌 ( Strep tomyces griseus ), XF18为淡紫灰链霉菌 ( S trep tom yces lavendulae ), XF22为脱叶链霉菌 ( S trep tomyces exfoliates )。
XF9、XF18和 XF2216S rDNA序列的 GenBank登录号分别为 EU723881、EU723880和 EU723879。
关键词: 西瓜根际 枯萎病 拮抗菌 筛选 鉴定
Screening and Identification of Actinomycetes Antagonistic to
Fusarium oxysporum from Rhizosphere ofWatermelon
Zhao L im ing D ingYanqin Lu X iaom eng Yao L iangtong Du Binghai
(College of Life Sciences, Key Laboratory of AgriculturalM icrobiology, Shandong Agr icultural University, Taian 271018)
Abstrac:t Th irty two iso la tes of actinom ycetes w ere obta ined from rh izosphere o fw aterm e lon. Through an tagon istic tests, three iso
lates antagonistic to Fusar ium oxy sporum .f sp. n iveum w ere screened, wh ich w ere designated as XF9, XF18 and XF22, respectively.
Based on them orpho log ica,l physio log ica l and b iochem ica l characteristics and phy logenetic analysis o f 16S rDNA, XF9, XF18 and XF22
w ere identified as S trep tomyces gr iseus, S trep tomyces lavendulae and Strep tomyces exfoliate s, respective ly. The sequences o f 16S rDNA of
XF9, XF18 and XF22 have been subm itted to GenBank and the accession numbers are EU723881, EU723880 and EU723879, respective ly.
Key words: W ate rm elon rh izosphe re W ilt Antagon istic actinom ycetes Screen ing Identification
收稿日期: 20091203
基金项目:山东省优秀中青年科研奖励基金 ( 2006BS06012)
作者简介:赵丽明,女,在读硕士,研究方向:分子微生物学; Em ai:l zholim ing_03@ 163. com
通讯作者:杜秉海,教授, Em ai:l bhdu@ sdau. edu. cn
放线菌是具有巨大实用价值的一类微生物,目
前从微生物中发现的大约 8 000种生物活性物质
中,近 70%是由放线菌产生的 [ 1, 2]。利用放线菌的
次生代谢产物 抗生素制备的新农药,由于其具有
无污染、不易使有害生物产生抗药性等特点已成为
无公害农药的主体和未来农药的发展方向 [ 3]。
瓜类枯萎病的病原菌为尖孢镰刀菌 ( Fusarium
oxysp orum ) ,在土壤中越冬, 从寄主根茎部侵入, 引
起植株系统性病害。西瓜枯萎病是由西瓜枯萎病菌
( Fusarium oxy sporum .f sp. niveum )引起的一种世界
性土壤传播病害。是西瓜生产中,发生最普遍、危害
最严重的病害,一般株发病率为 10% - 30% , 严重
的高达 80% ,减产 3- 7成,甚至绝收,不仅严重影
响了西瓜的产量和质量, 而且挫伤了瓜农种植的积
极性,成为困扰西瓜生产的一道难题 [ 4 ]。该病害在
我国蔬菜种植区普遍发生,危害严重。目前,对这类
维管束病害尚无有效的防治方法。本试验从西瓜根
际土壤中筛选对西瓜枯萎病菌防治效果好、无污染、
土壤中生存良好的放线菌菌株,并进行鉴定。从而
实现对西瓜枯萎病安全、健康、高效的防治。
1 材料与方法
11 材料
111 西瓜根际样品 西瓜根际样品采自山东省
高青县西瓜种植区。
112 菌株 西瓜枯萎病原菌 ( Fusarium oxy spori
um .f sp. niveum ) ,由本实验室保存。
113 培养基及主要试剂 高氏一号培养基: 用于
生物技术通报 B iotechnology Bulletin 2010年第 5期
放线菌培养、分离。PDA培养基:用于西瓜枯萎病原菌
的培养和拮抗菌的筛选。菌种鉴定培养基参考文献
[ 5]。DNA提取试剂: DNA提取缓冲液 ( 2 ! CTAB
缓冲液 ) ; SDS缓冲液;溶菌酶处理液 (溶菌酶 2mg /
mL, RNase溶液 50 g /mL,蔗糖 03mo l/L, TrisHC l
10mo l/L ) ; T ris饱和酚 ∀氯仿 ∀异戊醇 ( P∀C∀I) ;氯
仿 ∀异戊醇 ( C∀I)。 PCR试剂: DNA聚合酶, dNTP和
Buffer(w ithM g
2 +
) :均购于上海申能博彩生物科技有
限公司。3S柱 PCR产物纯化试剂盒购于上海申能博
彩生物科技有限公司。琼脂糖凝胶电泳试剂: 5 !
TBE缓冲液;琼脂糖;上样缓冲液; 染液 ( 05 g /mL
溴化乙锭溶液 )。试剂具体配置方法参阅文献 [ 6]。
12 方法
121 拮抗放线菌的筛选 通过梯度稀释法, 从
西瓜根际土样中筛选放线菌分离物, 并采用传统的
对峙方法 [ 7]进行初筛, 筛选出对西瓜枯萎病菌具拮
抗活性的放线菌,记录其编号, 并分别转接到相应分
离培养基斜面上保存。
122 形态学特征 于光学显微镜下观察用插片
法 [ 8]培养的拮抗放线菌的基内菌丝、气生菌丝和孢
子丝的形态,是否有断裂、膨大或者横隔等特征。
123 培养性状观察 将试验菌株用接种环按画
线法接种于上述各培养基中,于 28# 恒温箱中培养
6- 10 d,观察并记录其生长情况以及气生菌丝、基
内菌丝和可溶性色素等的颜色。
124 生理生化特征分析 淀粉水解、H 2 S产生、
碳源利用、纤维素分解、牛奶凝固和明胶液化等生理
生化特征参照刘占良 [ 9]的方法进行测定。
125 分子生物学鉴定 在高氏一号培养基上接
种放线菌, 28# 下培养 24 h, 刮取新生长的菌丝体,
提取 DNA,具体方法参阅文献 [ 10] , 并在文献基础
上进行了一部分改进。用灭菌的牙签刮取适量菌体
于已加入提取缓冲液并放于冰盒中的 15 mL离心
管中, 并用牙签粗头端轻轻的反复敲打研磨。
PCR扩增使用以下引物: 正向 P:f 5∃AGAGTTT
GATCCTGGCTCAGAACGAACGT3∃; 反 向 P:f 5∃
TACGGCTACCTTGTTACGACTTCACCCC3∃。反应 条
件: 94# 变性 1 m in, 56# 退火 1 m in, 72# 延伸
15m in,共 30个循环, 反应前预变性 ( 95# ) 5 m in,
循环结束后延伸 10 m in ( 72# )。PCR产物用 08%
的琼脂糖凝胶电泳检测。
PCR产物的纯化按照申能博彩 3S柱离心式
PCR产物小量快速纯化试剂盒说明书进行。 16S
rDNA的测序工作由上海英俊生物技术有限公司完
成, 序列相似性分析通过 NCB I的 BLAST程序比对
( http: / /www. ncb.i nlm. nih. gov /BLAST / )。
2 结果与分析
21 西瓜根际枯萎病拮抗放线菌的筛选
通过梯度稀释法从西瓜根际土样中筛选出 32
个放线菌分离物。然后通过 32株西瓜根际放线菌
对西瓜枯萎病作对峙试验, 共筛选出 3株具有良好
拮抗效果的放线菌。从图 1中可以看出, 放线菌
XF9、XF18和 XF22都对 Fusarium oxy sp orium .f sp.
niveum具有较好的拮抗效果。
图 1 三株拮抗菌对西瓜枯萎病原菌的拮抗效果
22 形态学特征
如图 2显示, XF9孢子丝直、柔曲,孢子椭圆形,
表面光滑; XF18孢子丝松敞螺旋形, 孢子卵圆形至
长圆形,表面光滑; XF22孢子丝直或柔曲,孢子卵圆
形至长圆形,表面光滑。
图 2 三株拮抗菌的孢子丝形态 ( 400 ! )
108
2010年第 5期 赵丽明等: 西瓜根际枯萎病拮抗放线菌的筛选及鉴定
23 培养特征观察
表 1 三株拮抗菌的培养性状
培养基 气生菌丝 基内菌丝 可溶性色素
XF9 XF18 XF22 XF9 XF18 XF22 XF9 XF18 XF22
蔗糖硝酸盐琼脂 灰白色 浅紫灰色 砖红色 灰白 灰黄色 浅黄褐 无 无 无
营养琼脂 无 很少,灰白色 灰白色 淡黄褐色 黄色 淡黄褐色 无 浅褐色 无
淀粉琼脂 无 无 无 淡黄褐色 黄色 淡黄褐色 无 无 无
马铃薯琼脂 灰白色 灰色 灰白 淡黄褐色 褐色 淡黄褐色 无 黑褐色 黄色
高氏一号 灰白色 紫灰色 砖红色 淡黄褐色 灰黄 黄褐色 无 黄色 黄色
察氏琼脂 灰白 紫灰 红褐色 灰白 浅灰褐 黄褐色 无 无 黄色
葡萄糖酵母膏琼脂 很少,白色 少,白色 浓密,红色 暗黄 暗黄 黄褐色 无 无 无
24 生理生化鉴定结果
表 2 菌株部分生理生化特性
特征 XF9 XF18 XF22
明胶液化 + + +
硝酸盐还原 + + +
硫化氢 - + -
淀粉水解 + + +
石蕊牛奶 凝固并胨化 不凝固,不胨化 凝固并缓慢胨化
纤维素生长 - - -
葡萄糖 + + +
果糖 + + +
木糖 + + +
蔗糖 - + +
D甘露醇 + + +
25 分子鉴定结果
16S rDNA纯化产物的 1%琼脂糖凝胶电泳见图
3。将 XF9, XF18, XF22的 16S rDNA序列提交 Gen
Bank, 所得收录号分别为 EU723881, EU723880,
EU723879。将 16S rDNA基因序列利用 BLAST。进行
1. XF9; 2. XF18; 3. XF22
图 3 16S rDNA PCR扩增结果
比对,菌株 XF9与 S trep tomyces sp414( EU054355)
的相似性为 98%,菌株 XF18与 Strep tomyces lavendu
lae x jy ( DQ645958)的相似性为 99%, 菌株 XF22
与 S trep tomyces sp. FXJ04 ( AY314784 )的相似性为
100%。
通过 16S rDNA序列分析, 3株菌均为链霉菌
属, 并结合形态学、培养特征及生理生化分析结果,
可以初步判定这 3株菌分别为灰色链霉菌 ( S trep to
myces griseus)、淡紫灰链霉菌 ( S trep tomyces lavendu
lae) ,脱叶链霉菌 ( Strep tomyces exfoliates )。
3 讨论
我国是一个农业大国, 每年的病虫害发生面积
达 2亿 - 26亿 hm2。农药的用量达数 10万 ,t而
且, 目前我国的农药结构极不合理,基本上以化学农
药占主导。其中, 高毒、高残留、对环境影响大的农
药使用量占半数以上,开发新型生物农药是减少化
学农药使用量的有效途径之一, 也符合发展绿色生
态农业的要求 [ 11 ]。枯萎病是农作物的主要病害之
一, 如何高效、安全、可靠的进行灰霉病的防治是长
期以来丞待解决的难题。
我国西瓜枯萎病防治研究已经取得了较大的进
展, 不论农业防治、生物防治还是化学防治都取得了
很好的成绩。但是,西瓜枯萎病是一种土传病害,由
于土壤的特殊复杂性,使得开展该病生物防治的研
究相对困难, 目前主要集中在丛枝菌根 ( AM ) 真
菌 [ 12]与根部有定殖力且无致病性或弱致病性菌系
的研究,从患病植株根际土壤 [ 13]或患病植株获得高
效拮抗能力的菌株成为西瓜枯萎病拮抗菌筛选的研
109
生物技术通报 B iotechnology Bulletin 2010年第 5期
究方向。
XF9、XF18和 XF2216三株放线菌对西瓜枯萎
病有很强的抑菌活性, 是较好的防治枯萎病的有益
微生物,从中开发出新型、高效、无毒天然农用杀菌
剂的潜力十分巨大。三株拮抗菌的获得不仅为开发
出廉价、高效的生物农药奠定了菌种基础,而且为进
一步的研究西瓜枯萎病高效拮抗菌的拮抗机制提供
了试验基础。
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