全 文 ：生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN·综述与专论· 2009年第 1期
收稿日期：2008-06-30
作者简介：杨慧洁（1963-），女，工程师，研究方向：生物技术
通讯作者：杨世海，博士，教授，博士生导师，E-mail：jlyangs@yahoo.com.cn
通过发根农杆菌 （Agrobacterium rhizogenes）感
染植物 ， 将其所含的 Ri 质粒上的一段 DNA （T-
DNA）转移并整合到植物基因组中 ，诱导产生毛状
根，并建立毛状根培养系统。实验证明，毛状根具有
生长迅速，合成能力强和遗传性稳定等优点 ，这是
传统细胞培养所不具备的。利用毛状根培养技术生
产次生代谢产物具有极大工业生产潜力，已引起人
们的广泛关注并得到了飞跃的发展，是药用植物资
源可持续发展的有效途径之一 [1]。 主要从发根农杆
菌、植物外植体及理化因子等方面论述影响发根农
杆菌介导的药用植物遗传转化的因素。
1 发根农杆菌
1.1 菌株类型
不同菌株对转化频率有一定的影响。 刘峻等 [2]
采用 1601、LBA91-8、R1000、A4 和 R15834 5 种发根农
杆菌菌株感染人参，然而只有菌株 15834 可转化人
参毛状根，其它菌株对人参转化没有成功。 说明不
同发根农杆菌对人参的敏感性不同，可能 l5834 对
人参的较为敏感。 王跃华等 [3]用 R1600，ATCC15834，
R1000，A4 等 4 种发根农杆菌感染川黄柏的外植体，4
种发根农杆菌浸染川黄柏的下胚轴和带芽下胚轴
外植体都能不同程度地诱导出毛状根，但不同菌株
的诱导率不同，ATCC15834 菌株的毛状根诱导率最
高为 31.40％，R1000诱导率最低仅 7.62％。刘树楠等 [4]
在银杏转化过程中以 15834，A4，R1000 3 种发根农杆
菌对银杏外植体转化，发现 15834，R1000 菌株的发根
能力较 A4 强得多，而 A4 菌株在相同的转化条件下
未能得到银杏发根。 陆倍倍等 [5]用发根农杆菌 LBA
9402 转化莨菪，100%长出了发根， 而用 A4 菌株诱
导发根，只有不到 80%的外植体长出了发根。 刘本
叶等 [6]研究发现发根农杆菌 ATCC15834 对青蒿毛
状根诱导效果最好， 诱导率达 58.7％，A4 菌株诱导
率为 19.5%。
发根农杆菌是一种植物病原菌，如同其它所有
发根农杆菌介导的药用植物遗传转化研究
杨慧洁 1 杨世海 2
（1吉林农业大学教育技术中心，长春 130118；2吉林农业大学中药材学院，长春 130118）
摘 要： 利用发根农杆菌（Agrobacterium rhizogenes）诱导药用植物产生的毛状根具有生长迅速，合成能力强和遗
传性稳定等优点，已成为一种新的培养系统。 就影响发根农杆菌介导的药用植物遗传转化的因素作一概述。
关键词： 发根农杆菌 毛状根 转化
Study on Genetic Transformation of Medicinal Plants
Mediated by Agrobacterium rhizogenes
Yang Huijie1 Yang Shihai2
（1Center of Education Technology，Jilin Agricultural University，Changchun 130118；2College of Chinese Medicinal Material，
Jilin Agricultural University，Changchun 130118）
Abstract： Hairy root transformed by Agrobacterium rhizogenes is a useful method of production of secondary
metabolites from medicinal plants since it has characters，such as growing fast，Agrobacterium rhizogenes genetic stability
and high synthesis. The factors influencing the Ri plasmid-transformation of medicinal plants were summarized in this
review.
Key words： Agrobacterium rhizogenes Hairy root Ri plasmid-transformation
2009年第 1期
病原菌一样， 发根农杆菌并不能感染所有的植物，
因此发根农杆菌与寄主植物之间存在着相互作用
的问题。 但是比其它菌株具有更广泛的寄主范围，
这可能与 T-DNA 存在生长素基因有关， 不同植物
对各种发根农杆菌的敏感程度存在着明显差异，不
同发根农杆菌对同一植物的毒性也存在明显差异。
因此，发根农杆菌株系与寄主植物之间的相互作用
是决定发根诱导率的主要因素。发根农杆菌与植物
之间相互作用的机制尚不十分清楚，故在建立一个
新的转化体系时，有必要用多个发根农杆菌株系进
行试验，以便选择出较适宜的细菌株系。
1.2 菌液浓度
在农杆菌介导的遗传转化中，菌液浓度是转化
成败的关键因素之一。 菌液浓度过低，会使农杆菌
细胞数目不足， 外植体单位面积上附着的细菌太
少 ，减少了农杆菌与受伤害细胞接触的机会，导致
转化效率较低；菌液浓度过高，则由于营养不足造
成菌液中死菌数目过多，实际有感染能力的农杆菌
数目减少。 此外，菌体产生的某些有害代谢产物对
植物细胞造成伤害，引起转化效率下降。 农杆菌的
浓度太高，生长过盛就会造成外植体死亡，并且如
果农杆菌在共培养培养基上生长过旺，即使加大头
孢菌素浓度也难以将其杀死。选用菌液浓度的原则
是能够达到最大转化效率的最小菌液浓度。赵东利
等 [7]在转化苦豆子试验中发现不同光密度的 A4 发
根农杆菌 MS 悬浮液对苦豆子子叶外植体的转化
频率的影响不同 ，最高转化率达到 15.0％，最佳光
密度为 OD600 =0.6。而高于或低于该密度，转化率都
呈下降的趋势。 刘本叶等 [6]将 OD660=0.75 的 ATCC
15834 菌液稀释 5～20 倍， 对青蒿毛状根诱导率影
响不大，但稀释倍数过高或过低会使毛状根诱导率
下降。 随着菌液的浓度增加，诱导大苞栝楼毛状根
显著增加，当菌液的浓度达到 OD600=0.7 时，无论是
菌株 R1000 还是 R1601，对于子叶或茎的诱导 ，诱导活
性均达最大，得到最高的毛状根诱导数。 菌液的浓
度下降到 OD600=0.9 时，毛状根诱导受到抑制 [8]。
2 植物外植体
2.1 外植体类型
不同植物的同一外植体、同一植物的不同外植
体以及同一外植体的不同发育阶段的转化效率都
有明显的差异。 刘传飞等 [9]用 R1601 菌株感染 3 种葛
属植物，三裂叶葛叶片外植体产生毛状根的百分率
为 28％， 而野葛和山葛叶片外植体分别为 15％和
17％。 王莉等 [10]用发根农杆菌 LBA9402 对何首乌
叶、叶柄和茎切段感染诱导，发现无菌苗小植株叶
的诱导率高达 100％， 而叶柄和茎的诱导率分别为
66.7％和 46.7％。 胡忠等 [11]在进行枸杞转化过程中
发现，枸杞的毛状根诱导频率与外植体的发育年龄
和生理状态密切相关 。 无论是叶片切段还是茎切
段，较为幼嫩的组织更容易感染发根农杆菌 ，其中
3 周龄的叶片切段产生毛状根能力更强，更适于 A4
菌株感染。常振战 [12]利用 LBA9402 诱导天山大黄发
根， 叶片、 子叶柄的敏感性较强 ， 诱导率分别为
51.6％和 62.5％； 而子叶片和叶柄的相对敏感性较
差，诱导率仅为 4.08％和 0.00％。王冲之等 [13]研究西
洋参毛状根诱导发现西洋参的叶很难诱导毛状根，
而叶柄细胞再生能力强，有明显的创伤反应 ，利于
农杆菌诱导毛状根。 王泓等 [14]采用农杆菌菌株 A4
感染苗龄 5 周的萝芙木真叶叶片和茎段，真叶叶片
和茎段 2 种不同的外植体对农杆菌的反应能力不
一样，二者之间的差异很明显。 11 d 后感染农杆菌
的真叶叶片的伤口部位开始出现大量的白色突起，
随即分化出白色细根， 呈从生状；14 d 后感染农杆
菌的茎段的伤口部位才开始有膨大和突起，而且只
分化出少量的发根。两种不同的外植体的诱导频率
也不一样的，叶片的诱导频率可以达到 90%，而茎
的诱导频率只有 20%。从叶片上诱导出的毛状根数
量可达数十条，而目比较长，生长速度较快，继代培
养可以形成较多分枝；而从茎段上诱导出的毛状根
只有几条，而且比较短，生长速度缓慢，几乎没有分
枝。 齐香君等 [15]利用发根农杆菌 A4 感染黄芩外植
体，黄芩茎段的诱导率较高，而黄芩叶诱导率为零。
刘峻等 [2]用 Ri15834 对人参无菌苗、3 年生的根薄壁
组织、无菌苗切段等感染诱导，结果表明外植体中
分化程度低的幼嫩组织比分化程度高的成熟组织
诱导成功率高，带叶幼茎的诱导成功率又明显比其
它外植体高。新疆雪莲外植体的类型影响发根农杆
菌的感染效率。 在叶片 、叶柄、根段 3 种的外植体
中，根段的诱导效率最高，可达 100％；其次是叶柄；
叶片的诱导效率最低，且容易褐化死亡 [16]。 经发根
杨慧洁等：发根农杆菌介导的药用植物遗传转化研究 17
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2009年第 1期
农杆菌 R1601 感染的蒙古黄芪只在下胚轴、根段上有
毛状根的产生，子叶和叶片无反应。 根段虽然可诱
导出毛状根，但诱导率很低，只有 5％～7%[17]。 用发
根农杆菌 LBA9402 转化何首乌外植体， 其中叶的
诱导率最高 ，达到 100％，其次叶柄为 66.7%，茎为
46.7%[11]。
通常认为，幼嫩的生长旺盛的组织对农杆菌更
敏感，被感染后，伤口附近的细胞较易脱分化形成
较多的感受态细胞， 从而有利于农杆菌诱导毛状
根 。 但在 ATCCC15834 对虎杖外植体的转化中发
现，成熟叶片是较适宜的感染材料，出根快，发根诱
导率及诱根密度显著提高。过于幼嫩的虎杖叶片因
发育尚未成熟，体内激素水平及次生代谢物的含量
相对较低，感染后伤口部位易形成黄褐色的愈伤颗
粒而很难分化出根 [18]。 检测发现，成熟叶片中白藜
芦醇含量较高，这可能意味着白藜芦醇在外植体含
量高低决定着转化的难易程度。
2.2 外植体预培养和共培养时间
外植体产生伤口后，在愈合过程中会形成并释
放出乙酰丁香酮等酚类物质，以此作为诱导发根农
杆菌识别的信号分子。发根农杆菌侵染前需经过一
定时间预培养， 使受体能形成并释放这种信号分
子，从而提高转化率。另外，经农杆菌感染的外植体
伤口处细胞可能因为过敏反应而褐化， 甚至死亡，
会严重影响转化效率及毛状根的形成，预培养也能
较好地解决褐化问题。共培养时间的长短与转化效
率密切相关，但共培养时间过长，可使发根农杆菌
过度生长，而严重毒害外植体使转化难以实现。
孙敏等 [19]研究长春花毛状根的转化时，预培养
0～7 d 后转化的外植体有不同的转化率， 预培养 2
d 的转化率最高（44.44％）；转化后的外植体共培养
0～5 d 的转化率也不同， 共培养 2 d 的转化率最高
（50.70％），而共培养大于 3 d 后的转化率则不断下
降。 刘本叶等 [6]研究证明叶片外植体与菌共培养时
间对青蒿发根诱导率有明显影响， 其中共培养 3 d
时诱导率最高（达 97％）。过早地转入抗生素虽可有
效抑制菌的增殖， 但也明显降低了发根诱导率，共
培养时间超过 4 d 后叶片污染数急剧增加。 陆倍倍
等 [5]试验表明莨菪共培养的时间以 3 d 为好 ，此时
转化效率达到最高值， 进一步增加共培养时间，转
化效率会急剧下降。究其原因可能是由于在共培养
基上不含任何抗生素，植物细胞和细菌细胞都可以
生长。 如果培养时间过长，过度生长的细菌细胞就
会抑制植物细胞的正常生长，甚至会造成植物细胞
的死亡。 胡忠等 [11]采用原液或将菌液稀释 1 倍之后
感染叶片切段，并共培养 3 d 发状根的诱导效果最
好。菌液浓度太低，共培养时间延长，使转化频率下
降。在较高菌液浓度下，延长共培养时间，农杆菌生
长旺盛，而组织块的生长受到影响，严重的褐化死
亡；另一方面组织块的表面菌体太多 ，转化培养期
间不容易彻底除去。 野葛经过 2 d 预培养的叶片经
R1000 感染 7 d 左右 ，在叶柄及中脉处出根 ，而未经
预培养的叶片要比经过预培养的叶片推迟 4 d 左
右出根，两者在毛状根诱导率及毛状根诱导密度方
面无明显差异。 将叶片预培养 1 周以后再进行感
染，叶片只发生皱缩而不生根。 可能短时间的预培
养有助于切口细胞进行伤口修复反应，并及时进入
农杆菌易于感受的状态， 而长时间的无激素培养，
阻碍了细胞进一步分裂生长，并加快了细胞的老化
及褐化过程，因而使转化率不断下降 [20]。
被感染细胞所处的细胞周期相位对转化起重
要作用。 Estelle 等 [21]在研究碧冬笳叶肉组织的细胞
周期相位转化的影响时发现，转化发生在处于 S 期
的细胞，而且只有细胞分裂和增殖时基因才能稳定
表达。由此可见，适时的预培养可以调整植物细胞，
使其处于良好的感受状态，有利于农杆菌的感染和
Ri 质粒的整合表达，可有效提高转化率，而过长时
间的预培养可能使外植体切段伤口愈合，不利于农
杆菌转化。
2.3 外植体放置方向
外植体放置方向对发根诱导频率有明显影响。
姚春娜等 [22]报道黄瓜叶片的上表皮向下放置接触
培养基有利于毛状根的诱导，其诱导频率显著高于
向上的频率。 由于子叶下表皮与上表皮结构不同，
与培养基接触时，导致接触部分的培养基的 pH 值
改变，因而对 Vir 基因诱导的改变不一样，较高 pH
值抑制 Vir 基因的表达 [23]。 于树宏等 [18]的研究表明
虎杖叶片下表皮接触培养基（上表皮向上）比上表
皮向下分化根的能力强，毛状根诱导率及诱根密度
分别高于后者 1.21 倍及 1.75 倍。 赵东利等 [26]也报
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道苦豆子子叶上表皮一面必须向上放置，否则很难
长出发根。认为可能与叶片上下表皮细胞生理结构
不同、分泌次生物质能力存在差异等有关。
3 化学因子
3.1 培养基
培养基的种类对发根的转化率及生长产生影
响。步怀宇等 [25]试验的 3 种培养基（MS，B5，N6）中，
骆驼刺发根的转化率有明显不同。 其中 MS 培养基
上发根转化率最高，达到 26.9%，其次在 B5 培养基
上，发根转化率为 13.3%；而在 N6 培养基上 ，外植
体不产生发根。 刘本叶等 [6]在转化青蒿发根时，MS
基本培养基效果最好 ， 发根诱导率为 50.1％ ，而
White 培养基发根诱导率仅为 21.3%。
3.2 外源激素
在发状根的诱导过程中，添加适当浓度的外源
激素对于提高发状根的诱导频率有明显的促进作
用。王莉等 [10]考察浓度均为 0.1 mg/L 的不同外源生
长激素添加在基本 MS 固体培养基上对何首乌毛
状根诱导率的影响。 结果表明，2，4-D 的作用最明
显，不仅根的诱导率高，而且出根时间也早，成簇的
根从白色愈伤组织上长出 ， 根生长迅速并逐渐变
粗， 有的根在 20 d 后就长到 2 cm 长，2 mm 粗。 王
冲之等 [13]用添加 2，4-D 1 mg/L、KT 0.1 mg/L 的 MS
培养基， 未能诱导出西洋参毛状根 ， 而使用添加
NAA 6 mg ／ L 的培养基进行农杆菌与外植体共培
养，成功地获得了毛状根。 刘峻等 [2]在 MS 培养基中
（含 1×l0-4 mol·L-1 AS）中添加不同种类及浓度的生
长素和细胞分裂素 ， 结果发现在含 NAA （3×10-6
mg·L-1）、KT（0.3×10-6 mg·L-1）的条件下 ，外植体的
愈伤化程度最高，分裂态细胞也最多。 但生长素浓
度太高又会抑制愈伤组织的形成，同时诱导率也降
低。因此外源性激素是影响人参愈伤组织及毛状根
形成的关键因素之一。 李雅丽等 [17]把感染后的蒙古
黄芪外植体分别共培养在 MS（0）、MS+IBA 0.1 mg/
L、MS+IBA 0.3 mg/L 和 MS+IBA 0.5 mg/L 的培养基
上。 在 MS+IBA 0.3 mg/L 上，毛状根的诱导率最高，
达到 42.2％， 这说明在适当的植物激素作用下，黄
芪组织块可以启动细胞分裂， 而处于 DNA 合成和
细胞分裂高峰期的外植体较易进行外源 DNA 的导
入与整合，从而促进根的诱导。
3.3 酚类物质
发根农杆菌感染受损伤的植物细胞时，被损伤
的细胞通常合成一些创伤信号分子（一类小分子酚
类化合物，如乙酰丁香酮、羟基乙酰丁香酮等），这
些创伤信号分子在 VirA 基因产物 （为一种结合在
膜上的受体蛋白 ）介导下 ，使 Vir 区的其他基因活
化，促使 T-DNA 复制和 T-链蛋白复合体的形成。 T-
链蛋白复合体通过细菌细胞膜的转运，最后进入植
物细胞核 ，将 T-DNA 整合进植物的基因组 [26]。 因
而，外源乙酰丁香酮（AS）等酚类物质的添加 ，提高
了该类信号分子的浓度， 促进 Vir 区基因的活化，
从理论上讲对转化率的提高有促进作用。因此在受
体植物与供体细菌相互作用中，如果宿主没有产生
的诱导物或含量太低就不能引起 Vir 区基因的活
化，用一些酚类化合物处理菌株后可提高 Vir 区的
表达并明显提高药用植物外植体的转化率。
目前广泛使用的是 AS 和羟基乙酰丁香酮（OH-
AS），已取得了良好效果。 施和平等 [27]将 100 mg ／ L
AS 与浸泡菌液分别或同时加入到预培养基、 共培
养基中 ，都能提高外植体的转化效率，其中以同时
加入两者的转化率最高。 Hu 等 [28]在黄芪毛状根诱
导研究中发现，TR105、R1601、ATCCI5834 和 LBA9402
几种菌在添加了 20 μmol ／ L 的 AS 后， 其毛状根诱
导率均有所增加， 最高者可从原来的 20％增加到
70％。
AS 对农杆菌转化植物的作用因植物种类而
异，有些情况下，AS 能提高根癌农杆菌对植物的转
化率，但在有些情况下，AS 并不能提高农杆菌对植
物的转化率，甚至会降低转化率 [6，31]。 AS 等小分子
量酚类物质存在于植物受伤后产生的分泌物中，是
由代谢活跃的受伤植物细胞特异合成和分泌的。农
杆菌与植物共培养时 ，AS 与质粒上 VirA 蛋白结
台 ，使 Vir G 蛋白磷酸化结构改变 ，激活其它毒性
区基因，从而促进 T-DNA 转移。 当受伤植物细胞产
生的酚类物质足以诱导 Vir 基因活化时 ， 再加入
AS 则不能进一步提高转化率， 甚至会有毒害作用
使转化率降低。
3.4 碳水化合物
Vir 区基因的诱导与活化除与创伤信号分子 、
pH 值、温度等条件有关外，还要求培养基中不含有
杨慧洁等：发根农杆菌介导的药用植物遗传转化研究 19
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酵母提取物，需要含量较高的碳水化合物。 实验中
添加 10 g ／ L 肌醇的毛状根诱导率及毛状根诱导密
度分别比对照高出 2.9 和 2.5 倍。 因为高浓度的肌
醇可促进 Vir 基因的表达。 此外，蔗糖对发根农杆
菌的转化也有一定的影响。 如用 2％蔗糖溶液稀释
菌液感染野葛叶片诱导毛状根发生的效果好，其作
用可能是维持菌体渗透压，或调节 Vir 区的 rolC 基因
的表达， 其表达的产物也可以启动毛状根的发生 [20]。
施和平等 [30]在不加蔗糖或少加蔗糖预培养和共培
养的黄瓜子叶外植体被发根农杆菌感染后，不仅子
叶外植体的毛状根诱导率极低，且子叶很快由绿变
黄，腐烂；而高浓度（4%）蔗糖却能使黄瓜子叶形态
学上端也产生毛状根。
4 物理因子
4.1 光照强度
在不同光照条件下， 发根的诱导率有所不同。
无论子叶或茎，不同的光照能导致大苞栝楼发根数
量的变化，而且转化率均随着光照强度的增大而减
少，即负相关关系。但是，从子叶和茎上诱导的发根
的数量来看，两者并不存在明显的差别，每个光照
强度处理组发根数大致相等，在暗培养中无菌苗发
根转化率较高 。 另有研究发现 [31]在暗中持续培养
30 d 的已感染的龙胆叶片未见有根发生，而同时在
光下培养的材料 2 周左右即有部分叶片诱导出了
根 [9]。
4.2 温度
当以 20℃进行处理时，大苞栝楼的发根的数量
明显降低，这主要是由于低温影响外植体的体内酶
的活性和减慢代谢过程， 从而降低生长和分化速
率。 当温度为 30℃的时候，子叶和茎都没有发根长
出，这主要是由于温度超过 28℃，发根农杆菌的生
长受到严重的抑制 ，温度越高抑制越大，甚至导致
菌株的死亡。 30℃已经严重降低了菌株的生长和转
化能力 [9]。 温度对龙胆外植体的根诱导有很大的影
响。24℃～26℃ 是诱导发根的适宜温度，在这个温度
下，被感染的材料 12 d 开始出根，出根率也高。 当
被感染的外植体处在 21℃～23℃ 的情况下，始出根
的时间约推迟一周，即需 20 d，并且出根率也相应
降低，尤其是叶片的诱导率可降低 50％。 当温度为
20℃ 以下或 28℃ 以上，根的诱导率为零 [31]。 在转化
莨菪的试验中共培养的温度在 22℃时，发根农杆菌
的转化频率较高，此时不容易发生质粒丢失及比较
容易控制细菌的过度生长，但植物细胞的生长也同
时会受到一定程度的抑制 [5]。
4.3 pH 值
农杆菌的活化液 pH 值较低时有利于某些 Vir
区基因的激活，如 VirD2 的活化要求 pH5.4～5.6，有
些致瘤试验甚至报告需 pH5.1～5.2[23]。 pH 值改变 0.3
会对几种植物的转化效率有明显的影响 [29]。
当用发根农杆菌对大苞栝楼无菌苗子叶和茎
诱导发根时， 在 pH6.0 时获得最高的转化能力，因
此，pH6.0 是发根农杆菌最适的转化 pH，高于或低
于此 pH 大苞栝楼的发根率都会降低， 这表明 pH
会影响发根农杆菌的生理特性。同时，pH 也会对外
植体的生长和分化产生影响 [9]。 例如，将 YEB 培养
液的 pH 值由 7.2 降至 5.6～5.8，可以提高 R1000 菌株
的致根性，感染后的叶片毛状根诱导率由 15.6%提
高到 29.5%，毛状根诱导密度由 1.7 提高到 2.2[20]。
在农杆菌与植物细胞进行共培养时，使用较低
pH 的培养基有利于转化频率的提高。 原因可能是
在偏酸的培养条件下，有利于农杆菌 Vir 区基因的
表达，但较低 pH 条件下，培养基的凝固状态较差，
不利于试验操作，容易污染。 pH 在 4.8～6.2 的范围
内，对转化效率的负面影响较小。 所以共培养时一
般选择 pH5.2 的条件 [5]。
4.4 超声波或微波处理
赵东利等 [24]研究超声波辅助处理对发根农杆
菌介导的苦豆子遗传转化的影响，结果表明超声波
处理有助于转化率的提高。 当超声波（功率 120 W，
振荡频率 50 kHz）处理 25 min 时，转化率达到最高
峰 （子叶为 83.7%，下胚轴为 39.1%），分别高于对
照（14.4%和 9.8%）69.3% 和 29.3%。 于树宏等 [18]在
诱导虎杖毛状根时，利用超声波或微波进行辅助感
染促使叶片提前出根， 其中以超声处理 30 s 效果
最显著， 与原液浸泡相比 ， 根平均诱导率提高了
1.71 倍，诱根密度提高了 2.15 倍。 而且还有效增加
生根位点，除切口部位外，叶片边缘、叶脉周围等未
划伤处也有大量根系出现。
超声波作用于目标材料后，由于气泡闭合形成
的瞬间高压会在材料的表层及深层形成许多微损
20
2009年第 1期
伤，从而有助于农杆菌的侵染。 短暂微波辐射产生
的热效应也有助于农杆菌 T-DNA 向植物细胞的导
入。 在光学显微镜下观察经这两种处理的虎杖叶
片，发现其细胞完整性受到不同程度的破坏，细胞
间隙变大，微伤口或热效应会导致叶片表皮形成一
些暗色的区域， 毛状根在这些部位的发生机率较
大。 但是当处理时间超过 1 min 后，不仅叶片在共
培养时极易发生褐腐，存活率明显下降，而且几乎
不形成毛状根，说明过长时间的超声或微波处理会
严重损伤核基因组 DNA。
4.5 真空渗透处理
真空渗透作为农杆菌介导的基因转化试验中
的一种辅助手段，虽然在拟南芥的遗传转化研究中
有过报道 [32]，但都是以完整植物的花序为对象。 赵
东利等 [8]报道了以外植体为对象 （离体转化 ）的真
空渗透转化研究，结果表明使用这种方法显著地提
高了 A4 发根农杆菌对苦豆子子叶的转化率， 其中
抽真空处理 15 min 的效果最好， 转化率由 8.8%提
高到 78.3%。 其机理可能由于真空渗透处理在植物
材料表面产生很多微损伤，且抽真空后形成的负压
强制农杆菌更紧密地吸附于外植体伤口及伤口内
细胞间隙，从而促进了 T-DNA 向植物细胞的导入。
但处理时间非常重要，时间过长，植物细胞因遭受
到更大的伤害而死亡。
4.6 甘露醇预处理
步怀宇等 [27]研究不同理化因子对发根农杆菌
Ri 质粒转化骆驼刺的影响，发现用 0.3 mol ／ L 甘露
醇预处理 12 h 后，转化率最高达到 65.96%，是仅经
3 d 预培养的外植体转化率 （34.38 %）的 1.92 倍 ，
充分说明高渗处理可有效提高转化率。这可能是由
于一定浓度的甘露醇使细胞处于渗透胁迫条件下，
发生质壁分离和轻微细胞伤害，而这种受伤状态有
利于农杆菌向受体细胞的附着和 Ri T-DNA 通过合
成如脯氨酸类渗透调节物向植物细胞的转移和整
合。 但是甘露醇浓度过高（>0.75 mol ／ L）和处理时
间过长 （24 h）则可能使细胞处于高渗环境形成不
可逆受伤状态，转化率反而降低。
综上所述，发根农杆菌转化药用植物细胞涉及
一系列复杂的反应，影响因素很多，更详细的诱导
机制有待进一步探讨。
参考文献
1 曲伟红，赵建国.九江学院学报，2006，21（4）：85~87.
2 刘峻，丁家宜，徐红，等.中国中药杂志，2001，26（2）：95~99.
3 王跃华，苟小军，吴洁，等.中国中药杂志，2006，31（22）：1853~
1856.
4 刘树楠，孙天思，李根保.武汉大学学报，1998，44（2）：238~240.
5 陆倍倍，张磊，开国银，等.中草药，2005，36（12）：1864~1868.
6 刘本叶，叶和春，李国凤，等 .应用与环境生物学报，1998，4
（4）：349~353.
7 赵东利，张春广，王新宇，等.药物生物技术，2002，9（4）：220~
223.
8 徐明芳，曹焕生，李定坚.生态科学，2003，22（3）：209~212.
9 刘传飞，李玲，潘瑞炽，等.应用与环境生物学报，2001，7（2）：
143~146．
10 王莉，于荣敏，张辉，等.生物工程学报，2002，18（1）：69~73.
11 胡忠，杨军，郭光沁.西北植物学报，2000，20（5）：766~771.
12 常振战，沈昕，果德安，等．北京医科大学学报，1998，30（5）：
413~415.
13 王冲之，丁家宜.药物生物技术，1999，6（2）：80~84.
14 王泓，廖志华，田桂香，等 .西南师范大学学报，2006，31（2）：
137~141.
15 齐香君，陈秀清，何恩铭.西北农业学报，2006，15（5）：244~
247.
16 付春祥，金治平，杨睿，等.生物工程学报，2004，20（3）：366~
371.
17 李雅丽，张凯.云南植物研究，2005，27（2）：204~210.
18 于树宏，赵丽丽，王伟，等.西北植物学报，2005，25（9）：1740~
1746.
19 孙敏，汪洪，王颖，等.西南师范大学，2002，27（4）：549~552．
20 于树宏，李玲，刘传飞，等.高技术通讯，2002，（3）：34~37.
21 Estelle V，Frederic D，Rajbir SS，et al.Planta，1997，201：160~172.
22 姚春娜，王亚馥.兰州大学学报，2001，37（5）：77~81.
23 Stachel SE，Messens E，Montagu VM，et al. Nature，1985，318：
624~629.
24 赵东利，陈红波，聂秀苑，等 .西北植物学报，2003，23（3）：
468~472.
25 步怀宇，景建洲，郝建国，等 .西北植物学报，2000，20（4）：
577~584.
26 周立刚，王君健，杨崇仁.天然产物研究与开发，1998，10（3）：
87~95.
27 施和平，粱朋，权宏.生物工程学报，2003，19（1）：46~49.
28 Hu ZB，Alfermann AW. Phytochemistry，1993，32（2）：699~703.
29 Godwin I，Todd G，Ford-Lioyd B，et al. Plant Cell Rep，1991，9：
671~675.
30 施和平，李玲，潘瑞炽.广西植物，2000，20（4）：356~360．
31 江洪如，涂艺声，王碧琴，等.江西科学，1995，13（4）：244~248.
32 巩振辉，Milner JJ，何玉科.西北植物学报，1996，16（3）：277~
283.
杨慧洁等：发根农杆菌介导的药用植物遗传转化研究 21