全 文 ：·研究报告·
生物技术通报
B IO TECHNOLOGY　BULL ETIN 2009年第 11期
PCR方法扩增神经生长因子
β亚基基因的条件优化
闻崇炜 1 　李倩 2 　庄强 2 　夏娟 1 　文毅 1
(1江苏大学药学院 ,镇江 212013; 2江苏大学环境学院 ,镇江 212013)
　　摘 　要 : 　研究了不同退火温度、dNTP浓度、Mg2 +浓度下用 PCR方法扩增小鼠神经生长因子β亚基 (β2NGF)基因的效
率。并将扩增所得β2NGF基因克隆到 pUCAT4载体中 ,对得到的阳性克隆进行了测序证实 ,为下一步利用该基因表达重组β2
NGF创造了前提条件。
关键词 : 　神经生长因子 　PCR
Optimal PCR Condition for Amplif ication of Nerve
Growth Factorβ Subun it Gene
W en Chongwei1 　L i Q ian2 　Zhuang Q iang2 　Xia Juan1 　W en Yi1
(1 School of Pharm acy, School of the Environm ent, J iangsu University, Zhenjiang 212013;
2 School of the Environm ent, J iangsu University, Zhenjiang 212013)
　　Abs trac t: 　The influence of annealing temperature, dNTP concentration, Mg2 + concentration on amp lification efficiency of nerve
growth factorβ subunit(β2NGF) gene by polymerize chain reaction ( PCR) was studied and reported. The obtainedβ2NGF gene was then
cloned into pUCAT4 vector. DNA sequencing result of the positive clone confirmed the correctness of the obtainedβ2NGF gene and
could p rovide p rerequisite condition for exp ression of recombinantβ2NGF in the next step.
Key wo rds: 　Nerve growth factorβ subunit(β2NGF) 　Polymerize chain reaction ( PCR)
收稿日期 : 2009207213
作者简介 :闻崇炜 (19712) ,男 ,汉族 ,博士 ,主要从事基因工程药物的研究及开发 ; E2mail: wenchw@ujs. edu. cn　　神经生长因子 ( nerve growth factor, NGF)具有神经元营养和促突起生长双重生物学功能 ,是神经营养因子中最早被发现同时也是目前研究最透彻的一种神经细胞生长调节因子 [ 1～3 ]。NGF由 α、β、γ三种亚基形成α2βγ2复合物 ,从而发挥其生物学活性。研究表明由 118个氨基酸组成的 β亚基 (β2NGF)是 NGF关键的活性区 ,可以发挥 NGF的全部生物学活性。目前已经作为神经保护剂用于临床治疗多种多种神经功能缺损及神经系统退行性疾病。当前国内临床所用β2NGF还都是通过从小鼠颌下腺组织中分离提取制得。由于β2NGF在组织中含量极微 ,导致提取工艺产量不高 ,得率较低 ,也造成产品价格较高 ,增加了患者的经济负担。如果采用基因工程方法生产重组β2NGF,可望有效克服 上述难点与不足 ,具有良好的生产与应用前景 [ 4～8 ]。另外 ,获得β2NGF基因并构建相应载体用于基因治疗也受到很多关注 [ 9, 10 ]。生产表达重组β2NGF蛋白或利用β2NGF基因进行基因治疗的前提是获得β2NGF基因 ,并构建相应载体。在此 ,研究了有关影响 PCR方法扩增 β2NGF基因效率的主要因素 ,并用扩增所得β2NGF基因构建了重组质粒 ,通过 DNA序列分析证明了所获得基因的正确性 ,为下一步构建相应重组蛋白表达载体及相应基因治疗研究打下了基础。1　材料与方法1. 1　试剂与仪器C57 /BL小鼠购自扬州大学比较医学中心动物房。Taq酶、dNTP购自上海生工生物工程技术服务有限公
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生物技术通报 B iotechnology　B u lle tin 2009年第 11期
司 ,Mg2 +随 Taq酶附带。T4 DNA连接酶购自 Fermentas
公司。pUCAT4质粒由本课题组构建并且保存。分子
量标准 DL2000购自东盛生物科技有限公司 ,共有 100,
250, 500, 750, 1 000, 2 000 bp 6条条带。PCR使用 Ap2
p lied Biosystems公司的 2720 Thermal cycler。
1. 2　β2NGF基因扩增所用引物
引物均由上海生工合成 ,引物浓度调整到 50
μM后用于 PCR。
上游引物序列 : 5′2TTCATCCACCCACCCAgT2
CTTCCACATgg23′
下游引物序列 : 5′2CCgAAgCTTATTATCTTgT2
AgCCTTCCTgCTgAgCACACAC23′
1. 3　小鼠肝 DNA的提取
取 100 mg新鲜肝脏组织 ,加入 4 m l SNET溶液 ,
同时加入蛋白酶 K,使其终浓度达到 400μg/m l。
SNET溶液包括 20 mM Tris, 5 mM EDTA, 400 mM
NaCl, 1% SDS, pH 8. 0, 55℃放置过夜。加入等体积的
酚、氯仿、异戊醇 ,室温振荡 30 m in。最大转速离心 5
m in,转移水相 ,加入等体积的异丙醇沉淀 DNA。最
大转速离心 ,去除异丙醇 ,加入等体积 70%乙醇 ,再离
心 5 m in。去除 70%乙醇 ,敞开管口 ,待残余乙醇挥发
干净。加入 0. 5 m l TE, 4℃过夜使核酸沉淀溶解。
1. 4　PCR扩增β2NGF基因
基本 PCR扩增反应液按如下配制 :模板 DNA
1μl,上游引物 1μl,下游引物 1μl, dNTPs(10 mM )
1μl, 10 ×PCR缓冲液 5μl,Mg2 + (25 mM ) 3μl, Taq
酶 0. 5μl,加灭菌双蒸水补足体积 50μl。在研究不
同 Mg2 +浓度或 dNTP浓度对 PCR扩增效率有何影
响时 ,加入不同体积的 MgCl2或 dNTP溶液后 ,对加
入灭菌双蒸水的体积进行相应调整 ,使 PCR体系总
体积仍保持为 50μl。
基本 PCR扩增反应条件采用如下流程 :先 94℃5
m in,随后以 94℃ 30 s, 60℃ 30 s, 72℃ 1 m in的条件
进行 35个循环 ,随后再 72℃ 5 m in。PCR结束后取 5
μl反应产物进行 1%琼脂糖凝胶电泳鉴定。在研究
不同退火温度对 PCR扩增效率有何影响时 ,除了对
退火温度进行相应调整 ,其它反应条件均保持不变。
1. 5　PCR产物的克隆及鉴定
PCR扩增产物用常规方法进行琼脂糖凝胶电
泳 ,切胶回收 ,处理后与 pUCAT4载体连接。连接反
应体系按照连接酶的使用说明 ,反应总体积为
20μl, 22℃连接过夜后用于转化感受态细胞。采用
常规方法鉴定重组子 ,得到的阳性重组子命名为
pUC2GNGF,采用常规方法提取质粒保存待测序。
1. 6　基因序列测定
阳性重组质粒 pUC2GNGF送上海生工生物工
程技术服务有限公司进行序列测定。测序结果用
Chromas L ite软件分析。
2　结果
2. 1　退火温度对 PCR扩增β2NGF基因效率的影响
分别采用不同退火温度扩增β2NGF基因 ,所得
PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳分析 ,结果如图 1所
示。结果表明退火温度低于 58℃时 ,除了扩增出大
小为 350 bp的条带 ,同时也扩增出大小为 180 bp、
650 bp、950 bp的多条非特异性条带 ,并且 180 bp的
条带亮度远高于另外两条非特异性条带。退火温度
为 58℃时 ,除了扩增出 350 bp左右的条带 ,同时仅
扩增出微弱的 180 bp非特异性条带。退火温度高
于 60℃时 ,则仅特异性扩增出大小为 350 bp的条带 ,
没有扩增出非特异性条带。
1～7. 退火温度分别为 50、52、54、56、58、
60、62℃的样品 ;M. 分子量 marker
图 1　退火温度对 PCR扩增β2NGF基因效率的影响
2. 2　Mg2 +浓度对 PCR扩增β2NGF基因效率的影响
分别采用不同浓度的 Mg2 +扩增 β2NGF基因 ,
PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳分析 ,结果如图 2所
示。结果表明 Mg2 +终浓度为 0. 5和 1. 0 mM时 , PCR
反应特异性扩增出 350 bp左右的条带 ,没有出现非
特异性条带 ,但是扩增效率较低。Mg2 +终浓度为 1. 5
mM时 , PCR反应特异性扩增出 350 bp左右的条带 ,
没有出现非特异性条带 ,扩增效率也最高。Mg2 +终
浓度升高到 2. 0和 2. 5 mM时 ,除了扩增出 350 bp左
右的条带 ,同时还扩增出 180 bp的非特异性条带。
Mg2 +终浓度进一步升高到 3. 0和 3. 5 mM时 ,除了扩
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2009年第 11期 闻崇炜等 : PCR方法扩增神经生长因子β亚基基因的条件优化
增出 350 bp左右的条带 ,同时还扩增出大小为 180
bp、650 bp、950 bp的 3条非特异性条带。非特异性
条带的含量也随 Mg2 +浓度的升高而上升。
1～7. Mg2 +终浓度分别为 0. 5、1. 0、1. 5、2. 0、2. 5、
3. 0、3. 5 mM的样品 ;M. 分子量 marker
图 2　M g2 +浓度对 PCR扩增β2NGF基因效率的影响
2. 3　dNTP浓度对 PCR扩增β2NGF基因效率的影响
分别采用不同 dNTP终浓度扩增β2NGF基因 ,
PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳分析 ,结果如图 3所
示。结果表明 dNTP终浓度为 50和 100μM时会导
致 PCR扩增效率降低 ,除了扩增出 350 bp左右的条
带 ,同时还扩增出 180 bp的非特异性条带。 dNTP
终浓度为 200μM时 , PCR扩增效率最高 ,并且仅仅
扩增出 350 bp左右的条带 ,特异性也最好。 dNTP
终浓度为 300和 400μM时 , PCR扩增特异性很好 ,
仅仅扩增出 350 bp左右的条带 ,但是 dNTP浓度越
高 ,则扩增效率越低。
1～5. dNTP终浓度分别为 50、100、200、300、
400μM的样品 ;M. 分子量 marker
图 3　dNTP浓度对 PCR扩增
β2NGF基因效率的影响
2. 4　重组质粒构建及测序结果
按照上述最优条件 ,即退火温度 60℃, Mg2 +终
浓度为 1. 5 mM , dNTP终浓度为 200μM ,进行 PCR
扩增β2NGF基因。PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳
后回收 350 bp大小的条带 ,按照常规方法与酶切处
理的 pUCAT4载体片段连接。连接产物转化到感受
态细胞后挑取阳性克隆 ,酶切鉴定正确的重组质粒
命名为 pUC2GNGF。同时进行序列测定 ,结果表明
所得扩增条带的序列与已报道β2NGF基因序列完
全一致 (图 4)。
图 4　pUC2GNGF测序结果
3　讨论
PCR方法不仅可以用于 ISSR2PCR反应研究物 种遗传多样性 [ 11 ] ,也是目前用来扩增并获得目的基因 ,用以构建相应重组质粒的最常用分子生物学技术
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手段。当以基因组 DNA为模板扩增特定基因时 ,常
因 DNA模板背景复杂 ,设计的引物不能完全排除与
模板还存在部分配对位点的可能性 ,往往造成 PCR
反应扩增效率低 ,甚至无法扩增出目的基因。因此 ,
以基因组 DNA为模板扩增特定基因不仅需要设计合
理的引物 ,同时也需要控制合适的 PCR反应条件 ,从
而减少非特异性扩增 ,提高特异性扩增的效率。
本试验研究了退火温度对 PCR从小鼠肝细胞
的基因组 DNA扩增β2NGF基因时的影响。结果表
明 ,以基因组 DNA为模板扩增β2NGF基因时 ,需要
设计合成足够长度的引物 ,保证引物与模板的退火
温度至少达到 60℃,才能保证 PCR扩增反应的特异
性。Mg2 +的浓度对 PCR反应的特异性与扩增效率
有影响。低浓度的 Mg2 +会降低扩增效率 ,但是对特
异性没有影响。高浓度 Mg2 +对扩增效率影响较小 ,
但是导致非特异性扩增升高。试验结果还表明
dNTP的浓度对 PCR反应的特异性与扩增效率也有
影响。低浓度 dNTP时不仅扩增效率低 ,而且会出
现非特异性扩增。高浓度 dNTP时没有出现非特异
性扩增 ,但是产物得率较低。这一抑制作用有可能
因为高浓度的 dNTP与 Mg2 +螯合而引起。
综上所述 ,本研究得到了以基因组 DNA为模板
扩增小鼠β2NGF基因时最优 PCR条件 ,也为下一步
用基因工程方法表达重组β2NGF,并替代目前临床所
用提取β2NGF创造了条件。另外 ,所用扩增条件也
为以基因组 DNA为模板扩增其它基因提供了参考。
参 考 文 献
1　 Barinaga M. Science, 1994, 264 (5160) : 772～774.
2　 O lson L. Exp Neurol, 1993, 124 (1) : 5～15.
3　 A lbeck D,MeschesMH, Juthberg S, et al. B rain Res, 2003, 967 (1～
2) : 306～310.
4　赵娟 ,何冰 ,江汉民 ,等. 中国生物工程 , 2006, 26 (6) : 1～5.
5　白艳艳 ,杨吉成 ,李丽娥 ,等. 苏州大学学报 (医学版 ) , 2004, 24
(4) : 466～468.
6　马巍 ,刘淼 ,杨广笑 ,等. 西安交通大学学报 (医学版 ) , 2005, 26
(1) : 33～36.
7　朱武飞 ,刘亚珍 ,赵之恭 ,等. 中国生物制品学杂志 , 2009, 22
(3) : 238～241.
8　姜静 ,姜桂香. 中国生物工程杂志 , 2006, 26 (2) : 8～12.
9　邓兴力 ,杨智勇 , 董坚 ,等. 医学研究生学报 , 2009, 22 ( 1 ) :
108～110.
10　马巍 ,吴玲 ,刘淼 ,等. 西安交通大学学报 (医学版 ) , 2002, 23
(4) : 338～341.
11　王桂娟 ,陈茂盛 ,向振勇. 生物技术通报 , 2008, (3) : 162～165.
食品生物技术理论与实践 ·书 　讯 ·
(应用生物技术大系丛书 )
姜毓君　包怡　红李杰　主编　赵锋　崔英俊　副主编
9782720202562720　　  48. 00　　　　　2009年 9月出版
内容简介 :本书是一本介绍生物技术基本理论及其在食品科学中应用的专著。生物技术的迅猛发展已经对食品科学产生了极大的促进作用 ,
因此引起了科学界、产业界和消费者的极大兴趣和关注。本书在介绍生物技术基本理论的基础上 ,较为全面地阐述了其在食品科学、食品工业生
产以及食品安全检测中的应用 ,并对有关食品生物技术引起的争议进行了客观的分析。全书共分九章 ,包括 :食品生物技术导论 ,食品生物技术的
对象与方法 ,基因克隆和重组蛋白生产 ,植物生物技术及其在食品生产中的应用 ,动物生物技术及其在食品生产中的应用 ,发酵技术及其在食品生
产中的应用 ,工业化细胞培养及其在食品生产中的应用 ,生物技术在食品安全检测中的应用 ,伦理、安全和规范。全书内容深入浅出 ,循序渐进 ,语
言叙述通俗易懂、简明流畅。
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