全 文 ：研究报告
生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2010年第 4期
米曲霉 F81菌株产中性蛋白酶的分离纯化
汤鸣强 曾小芳
(福建师范大学生物与化学工程系,福清 350300)
摘 要 : 对米曲霉菌种 F81所产中性蛋白酶进行分离纯化。经过硫酸铵分级沉淀, DEAESepharo se Fast F low阴离子交
换层析和 Sephacry lS200凝胶过滤层析后, 得到一种电泳纯的中性蛋白酶, 纯化倍数为 263 倍, 活性回收率为 6 7%。经
SDSPAGE电泳测定其相对分子质量约为 73 4 kD。
关键词: 米曲霉 中性蛋白酶 分离纯化
Studies on Separation and Purification of
Neutral Protease from Asperg illus oryae F81
TangM ingqiang Zeng X iaofang
(D epartment of B iology and Chem istry Eng ineering, Fuqing Branch of Fujian N ormal University, Fuqing 350300)
Abstrac:t The separa tion and pur ifica tion o f a neutra l protease from A sp erg illus oryae F81 w as studied. A s ing le neu tral protease
w as pur ified to hom ogene ity using ammon ium su lfate prec ip itation, DEAESepharose Fast F low an ion exchange chrom a tog raphy and
sephacry lS200 ge l filtra tion. This pur ification pro toco l resulted in a 26 3 fo ld purification of neutra l proteasew ith 6 7% final y ie ld ,
and the re la tive mo lecu lar w eigh t of the enzym e was de term ined to be approx im ate ly 734 kD using SDSPAGE.
Key words: A sperg illus oryae Neu tral pro tease Separa tion and pur ification
收稿日期: 20091213
作者简介:汤鸣强,男,理学硕士,副教授, 研究方向:生化与微生物; Em ai:l m qt- 1022@ 163. com
中性蛋白酶作用条件温和, 是最早发现并广泛
应用于工业化生产的蛋白酶制剂 [ 1] , 可应用于食
品、制药、化妆品以及丝纺等行业 [ 2]。米曲霉蛋白
酶酶系丰富,能产生丰富的中性蛋白酶,且米曲霉也
是美国 FDA 公布的 40余种安全微生物菌种之
一 [ 3] ,因此被广泛应用。本课题前期试验从酿造酱
油优质曲精中分离纯化到米曲霉 F81菌株,对该菌
株所产中性蛋白酶的提取与酶学性质进行了研
究 [ 4]。为深入了解该酶的理化性质与动力学特性,
以便为研究与应用提供参考,本研究报道了米曲霉
F81菌株产中性蛋白酶的分离纯化。
1 材料与方法
11 菌种与培养方法
米曲霉 F81由上海迪发酿造生物制品有限公
司优质酱油曲精分离纯化得到。发酵培养基: 黄豆
粉 4 g ,麸皮 16 g ,双蒸水 18 mL。搅拌均匀后装入
250mL三角瓶, 并在高压蒸汽锅内 121 灭菌 30
m in。培养方法: 菌种活化后制成孢子浓度为 1 !
10
8个 /mL的菌液,接种 2 mL活化菌种于发酵培养
基中, 30 恒温培养 72 h。
12 试剂和仪器
Sepharose Fast F low, Sephacry lS200为 Pharmac ia
公司产品; 干酪素购自上海国药集团化学试剂有限
公司; L酪氨酸购自上海翔军生物科技有限公司;
Fo lin酚试剂购自上海分子免疫生化实验室有限公
司;低分子质量标准蛋白购自上海生工。其余试剂
均为国产分析纯。B io log ic层析系统购自美国 B io
Rad公司; PH 211型台式数显酸碱度计购自意大利
HANNA公司; WFJ72系列 721E型可见分光光度计
购自上海光谱仪器有限公司; YX2808型立式不锈
钢蒸汽消毒器购自上海三申医疗器械有限公司;
GSP9050MBE隔水式恒温培养箱购自上海博迅实
业有限公司医疗设备厂; SHZ22水浴恒温振荡器购
自太仓市华美生化仪器厂; TGL16M 高速台式冷冻
2010年第 4期 汤鸣强等:米曲霉 F81菌株产中性蛋白酶的分离纯化
离心机购自湘仪离心机仪器有限公司; A ccu lab ALC
- 2104电子天平购自德国 Sartorius公司。
13 粗酶液的提取
准确称取 72 h固体发酵样品 20 g,置于 100mL
生理盐水中,搅拌均匀,于 40 恒温振荡锅中, 100
r /m in浸提 30 m in。浸提液用真空过滤机抽滤, 所
得滤液即为粗酶液。
14 中性蛋白酶活力测定 [ 5 ]
Fo lin酚法。酶活力定义:在 40 , pH72条件
下,每 g曲 lm in水解酪蛋白产生 1 g酪氨酸,定义
为 1个中性蛋白酶活力单位 ( U )。
15 酪蛋白水解圈法测定蛋白酶活性
准确称取酪蛋白 14 g, 置于约 40 mL双蒸水
中,水浴加热,并加入 3- 5滴浓氨水,迅速搅拌至无
颗粒沉淀,冷却后用 001 mol /L pH72N a2HPO4 柠
檬酸缓冲液定容至 100 mL。加入 1 g琼脂, 加热至
沸腾,趁热倒入消毒过的玻璃平板内。酪蛋白浓度
为 14%, 琼脂浓度为 10%, 上样后在 40 恒温培
养箱内培养 10 h。
16 酶的分离纯化
161 硫酸铵分级沉淀 设定粗酶液硫酸铵浓度
为 40%,于 0 冰浴条件下向酶液中加入硫酸铵粉
末并进行有规则的搅拌, 4 放置 24 h,在 4 条件
下 8 000 r/m in离心 10m in,收集上清液并测定上清
液中性蛋白酶活力。设定上清液硫酸铵浓度为
80%,于 0 冰浴条件下向酶液中加入硫酸铵粉末
并进行有规则的搅拌, 4 放置 24 h, 在 4 条件下
8 000 r/m in离心 10 m in,弃去上清液, 将沉淀溶解
在 15 mL 001 mo l /L pH75 N a2HPO4 柠檬酸缓冲
液中, 于 - 20 保存。
162 脱盐及浓缩 将硫酸铵分级沉淀后得到的
酶液置于透析袋中,在 4 条件下用双蒸水透析 4-
5次,再用上述缓冲液浸泡 40- 60 m in,直至浸泡前
后缓冲液电导率一致。透析后酶液用 PEG6000进
行脱水浓缩,并测定脱水后中性蛋白酶活性。
163 DEAESepharose Fast F low阴离子交换层析
将脱盐、浓缩后的酶液加到预先用 001 mo l /L
pH75 N a2HPO4 柠檬酸缓冲液平衡的 DEAESepha
rose Fast F low 阴离子交换层析柱 ( 17 cm !
25 cm )上,缓冲液流速 1 mL /m in, 经过 15 m in后开
始出现穿透峰, 1 h后穿透峰完全出现基线恢复稳
定, 用 0- 1 mo l/L NaC l溶液线性梯度洗脱, 流速 1
mL /m in。分别收集各洗脱峰, 用酪蛋白平板法检测
各洗脱峰有无水解圈,分别测定有水解圈的洗脱液
的中性蛋白酶活性。
164 Sephacry lS200凝胶过滤层析 取离子交换
层析得到的具有最大中性蛋白酶活性的洗脱峰加到
预先用 001 mo l/L pH75 Na2HPO4 柠檬酸缓冲液
平衡好的 Sephacry lS200层析柱 ( 17 cm ! 100
cm )上,用同样缓冲液洗脱, 流速 0 2 mL /m in。收
集各洗脱峰, 用酪蛋白平板法检测各洗脱峰有无
水解圈, 分别测定有水解圈的洗脱液的中性蛋白
酶活性。
17 电泳分析 [ 7]
SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳。电泳条件: 分离胶
12% ,浓缩胶 4% ,电泳电压恒定为 110 V。
2 结果与分析
21 中性蛋白酶 DEAESepharose Fast F low阴离子交
DEAESepharose Fast F low 阴离子交换层析洗
脱图谱如图 1所示。得到的洗脱峰用酪蛋白平板法
检测中性蛋白酶酶活。结果 (图 3)表明, 中性蛋白
酶酶活主要集中在第一个洗脱峰上。
图 1 中性蛋白酶 DEAESepharose FF洗脱图谱
22 中性蛋白酶 SephacrylS200凝胶过滤层析
SephacrylS200凝胶过滤层析洗脱图谱如图 2
所示。得到的 4个洗脱峰用酪蛋白平板法检测中性
蛋白酶酶活。结果 (图 4)表明, 中性蛋白酶酶活主
要集中在第一个洗脱峰上。粗酶液经 (NH4 ) 2 SO4分
级沉淀、DEAESepharose Fast F low 阴离子交换和
SephacrylS200凝胶过滤层析后,中性蛋白酶的比活
195
生物技术通报 B iotechnology Bulletin 2010年第 4期
力提高了 263倍,活性回收率为 67%。各步分离
纯化结果如表 1所示。
图 2 中性蛋白酶 SephacrylS200洗脱图谱
ck.缓冲液对照; 1 - 4 .各洗脱峰; 5.粗酶
图 3 DEAESepharose FF洗脱峰酶活情况
ck.缓冲液对照; 1- 4; 各洗脱峰; 5.粗酶
图 4 SephacrylS200洗脱峰酶活情况
表 1 中性蛋白酶的分离纯化结果
步骤 体积
(mL )
总酶活
( U)
总蛋白
( mg)
比活力
(U /m g)
纯化
倍数
回收率
(% )
粗酶液 3195 46480 10224 45 10 100
40% AS上清 51 11 806
80% AS沉淀 15 26212 990 265 58 564
DEAESepha
rose FF 102 6667 77 872 192 143
Sephacry l S200 52 3144 26 1195 263 67
23 中性蛋白酶分子量的测定
根据各低分子质量标准蛋白的迁移率 (表 2) ,
得到蛋白质分子质量与迁移率的回归方程 y = -
3778x+ 22066, R 2 = 09496,式中 y为标准蛋白质
的分子质量 ( kD) , x为迁移率 ( cm /m in) (图 5)。对
SephacrylS200凝胶过滤层析的峰 1收集液浓缩, 进
行 SDSPAGE不连续垂直平板电泳。电泳结果如图
6所示。目的蛋白质中性蛋白酶的迁移率为 52
cm /m in,推算米曲霉 F81菌株所产中性蛋白酶分子
质量为 734 kD。
表 2 低分子质量标准蛋白质的迁移率
标准蛋白 ( kD) 200 130 974 662 43 目的蛋白
迁移率 ( cm /m in) 070 18 36 57 68 52
图 5 标准蛋白分子质量与迁移率的关系
A.蛋白质分子质量标准; B.粗酶; C DEAES epharose FF
洗脱峰 1; D. SephacrylS200洗脱峰 1
图 6 中性蛋白酶 SDSPAGE电泳图
3 结论与讨论
对米曲霉菌种 F81所产中性蛋白酶进行分离
纯化, 经过硫酸铵分级沉淀, DEAE Sepharose Fast
F low阴离子交换层析和 Sephacry lS200凝胶过滤层
析后,得到一种电泳纯的中性蛋白酶, 纯化倍数为
263倍, 活性回收率为 67%。经 SDSPAGE电泳
测定其相对分子质量约为 734 kD。酪蛋白水解圈
法比较敏感、直观、简便, 常被用于产蛋白酶菌株的
筛选。该法用于检测蛋白酶分离纯化中洗脱峰的酶
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2010年第 4期 汤鸣强等:米曲霉 F81菌株产中性蛋白酶的分离纯化
活性。本试验发现,多个洗脱峰都有水解圈的出现,
只是大小有别, 说明该菌株可能拥有多个蛋白酶
组分。
文献 [ 12]提出,该菌固体发酵所产中性蛋白酶
粗酶的最适作用温度为 60 , 最适 pH 值为 70。
40 下酶稳定性较好, 60 下处理 20 m in, 粗酶中
几乎检测不到酶活力; Km值为 284mg /mL;最大反
应速度为 032 mg /m in mL。Mg2+对酶活有激活
作用, Cu2+、Fe3 +、Zn2+、Mn2+不同程度抑制酶活性,
其中 Cu2+、Fe3+强烈抑制酶活性。有关纯酶的酶学
性质与动力学特性有待进一步深入研究, 而在此基
础上对粗酶与纯酶相关特性的比较, 则有利于初步
阐明该菌中性蛋白酶的结构特征。
参 考 文 献
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(上接第 164页 )
检测目的蛋白表达具有更好的敏感性与特异性。多
种方法在不同水平与方面检测证实目的基因在真核
细胞中表达, 为研究 H IV1 N ef基因对真核细胞生
物学特性改变的影响奠定基础。
参 考 文 献
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