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研究报告

生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2010年第 8期
柴胡及体细胞杂种愈伤组织酯酶同工酶技术的优化
刘法磊  车婧  支大英  王敏琴  夏光敏
(山东大学生命科学学院,济南 250100)
  摘  要:  为解决柴胡及其体细胞杂种愈伤组织中次生代谢物多, 同工酶粗提液粘稠、杂质多且呈混浊态,同工酶电泳谱
带不清晰及易拖尾的问题,通过增加离心次数、调整酶粗提液上样体积等方法, 得到了理想的酯酶同工酶电泳谱带。该法广
泛适用于其它植物的同工酶聚丙烯酰胺凝胶电泳分析。
关键词:  柴胡  酯酶同工酶  聚丙烯酰胺凝胶电泳  优化
Optim izing of Esterase Isoenzyme Analysis of
Bup leurum scorzonerifolium and Its Somatic Hybrid Calli
L iu Falei Che Jing Zh iDay ing W angM inq in X ia Guangm in
( School of Life Sciences, Shandong University, Jinan 250100)
  Abstrac:t  Num erous seconda ry m etabo lites in Bup leurum scorzonerifo lium som atic hybrid ca lli usua lly cause a sticky and mu rky
crude extract o f isoenzym es, wh ich conta ins m any unknown im purities. T roub les w ith poo r defin ition and serious sm ear are typically
found due to an unacceptab le purity o f the samp le. To so lve the problem, m ulti
rounds cen trifug ation w ere unde rtaken and then the load

ing vo lum e o f the sam ple was ad justed to proper range. An ideal resu lt w as achieved though the optim ized assay, w hich can be w ide ly
app lied in to PAGE ana lysis o f isoenzym es in other plants.
Key words:  Bup leurum scorzonerifolium  Esterase isoenzym es PAGE Optim ization
收稿日期: 2010
01
23
基金项目:国家 973!项目 ( 2009CB 118300) , 国家自然科学基金项目 ( 30870240)
作者简介:刘法磊, 男, 硕士研究生, 研究方向:植物细胞分子遗传学; E
m ai:l falei86@ yahoo. com. cn;车婧,支大英同为第一作者
通讯作者:王敏琴, 女, 硕士生导师, 研究方向:植物细胞分子遗传学; E
m ai:l m inq inw ang2002@ sdu. edu. cn
植物体细胞杂交可克服远缘杂交不亲和性,促
进不同物种间基因的渐渗与交流, 为有目的地创造
新种质、新品系创造了条件 [ 1, 2 ]。柴胡 (Bup leurum
scorzonerifolium ) 为双子叶、伞形科植物; 其体内含
70多种次生代谢物,具有吸收 UV辐射、增强柴胡抗
氧化能力的功能 [ 2]。短柄草 (B rachypod ium sy lvatic

um ( Huds. ) B eauv. )为单子叶、禾本科植物; 其遗
传组成简单、生活周期较其它禾谷类植物短,已成为
禾本科新的模式植物。
同工酶是生物体内普遍存在的分子结构不
同、但催化同一反应的酶类, 是基因差异表达的结
果, 可作为基因活动的生化指标,在体细胞杂种性
质的确定、鉴别中起重要作用 [ 3]。本实验室曾在
以柴胡为亲本之一的体细胞杂交试验的杂种鉴定
中发现,柴胡及杂种愈伤组织同工酶谱带常不清
晰并有拖尾现象。通过对前期电泳中出现的问题
进行分析总结, 对试验条件进行优化, 以期得到理
想的结果。
1 材料与方法
1. 1 供试材料
对照组为短柄草和柴胡亲本愈伤组织,试验组
为短柄草与柴胡体细胞杂交再生的愈伤组织。
1. 2 样品酶提取液的制备、凝胶电泳及染色
酶液的提取、制备、凝胶电泳及染色等步骤参考
文献 [ 2, 4, 5 ]。同工酶提取过程中, 柴胡及其体细
胞杂种粗酶提取液需进行多次离心, 直至上清液完
全澄清, - 20∀ 储存备用。
1. 3 上样量的优化
为使聚丙烯酰胺凝胶电泳谱带清晰, 进行两次
生物技术通报 B iotechnology  Bulletin 2010年第 8期
凝胶电泳,拟通过第一次电泳确定各样品第二次电
泳 (正式电泳 )的体积。
第一次电泳:首先用 B ioPho tometer核酸蛋白测
定仪 (德国, eppendorf公司 )测定各样品的总蛋白浓
度 Cn (
g /mL)。随后在确保各检测样品上样体积
V0一致 ( V0 = 15
L /加样孔 )的前提下, 进行 15 mA
恒流蛋白电泳、染色并照相记录。
第二次电泳 (正式电泳 ) :对第一次电泳所得结
果进行分析,将其中出现清晰酶谱带的加样孔设为
标准加样孔,相对应的样品设为标准参照样品,其总
蛋白浓度设为 C0,则将其上样总蛋白量 ( C0 # V0 )设
为标准总蛋白量。据此便可换算出其它检测样品的
最适上样体积参考值 Vn* , Vn* = C 0 #V0 /Cn, 具体过
程如下表 1所示。对照优化前电泳图谱中各克隆同
工酶谱带的具体情况 (酶带深浅 ), 做出相应调整
(提高或降低上样体积参考值 Vn* ) , 得出第二次电
泳上样体积 ( Vn* ∃ 5. 0)
L /加样孔。在其它电泳
参数不变条件下,进行优化后的正式电泳,染色并照
相记录。
表 1 电泳条件优化前后粗酶液的上样体积
样品名称或
杂种编号 C n (
g /mL ) V0 (
L /加样孔 )
第一次电泳后
酶谱带清晰度 V
*
n ∃ 5. 0(
L /加样孔 ) 第二次电泳后酶谱带清晰度
短柄草 1. 936 15 + + 10 + + +
柴胡 0. 780 15 - 35 + + +
11 0. 977 15 + + 30 + + +
14 1. 762( C0 ) 15 + + + 15 + + +
15 0. 446 15 - 60 + +
28 0. 520 15 + + 50 + + +
51 0. 626 15 + 45 + +
95 1. 391 15 + + 24 + + +
* 将编号 14的总蛋白浓度设为标准总蛋白浓度 C 0; + !代表电泳谱带肉眼可辨的衡量标准,其数目与分辨率呈正相关; - !代表电泳谱带肉
眼几乎不可分辨
2 结果与讨论
柴胡细胞含有 70多种次生代谢物, 推测这些
次生代谢物的存在干扰了同工酶粗酶的提取, 使
其愈伤组织研磨后的粗酶提取液较为黏稠、杂质
较多、呈混浊态, 酶提取液中的待测酶含量降低;
电泳后呈现较弱的酶谱带带型、拖尾严重。通常
所用的简单静置及一步离心提取粗酶液的方法,
不能完全除去柴胡及其杂种愈伤组织粗酶液中的
杂质沉淀。本研究随机挑选了 6个杂种克隆及柴
胡、短柄草亲本愈伤组织进行酯酶同工酶分析, 进
行了如下优化措施: 首先, 对研磨、离心所获上清
液, 肉眼分辨其是否清晰, 适当增加粗酶提取液的
离心次数, 直至上清液完全澄清。离心纯化可有
效去除其它杂质的干扰, 提高单位体积中粗酶的
含量,对类似柴胡、次生代谢产物含量较多的植物
尤为适宜。
其次,确定得到清晰酶谱带对应的加样孔中
的标准总蛋白浓度 C0、标准总蛋白量 ( C0 # V0 ) , 并
利用公式 Vn* = C 0 #V0 /Cn计算出其它样品最适参
考上样体积 Vn* , 此法基本屏蔽掉各克隆的单位酶
活差异, 确保各点样孔的总酶活大体一致。试验
中,优化前测得的短柄草总蛋白浓度数值大且图 1
中酶带颜色很深、呈弥散团状、拖尾明显 (图 1

A );优化后, 在计算出的最适参考值 Vn* 的基础上
适当减小上样体积, 得到带型清晰的酶谱带。而
柴胡及其待测杂种 (同工酶谱带带型基本偏向柴
胡 ) , 电泳后带型明显不清晰, 与其样品蛋白含量
低有关, 因此在其参考值 Vn* 基础上不同程度增大
上样体积, 获得较为理想的同工酶谱带。经过上
样量的调整 ( Vn* ∃ 5. 0)
L /加样孔, 优化后的电
泳图谱 (图 1
B )比优化前电泳图谱 (图 1
A )分辨
率提高。
通过上述优化方案,达到了优化试验条件、改良
试验技术的目的, 使植物细胞同工酶分析技术的应
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2010年第 8期 刘法磊等:柴胡及体细胞杂种愈伤组织酯酶同工酶技术的优化
用范围更加广泛。
箭头表示优化后肉眼可辨的清晰同工酶谱带; Br.短柄草; Bu.柴胡
图 1 试验条件优化前 (A )及优化后 ( B )酯酶同工酶谱带
参 考 文 献
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