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生物技术通报
B IO TECHNOLOGY　BULL ETIN 2009年第 10期
耐热 DNA聚合酶基因双元载体的初步构建
梁雪莲 关彩蝶 柳勇 廖伯强
(仲恺农业工程学院生命科学院 ,广州 510225)
　　摘 　要 : 　Taq DNA聚合酶是 PCR反应中的重要试剂 ,它具有结构性稳定和耐高温的特性 ,有能在 90℃以上合成 DNA的
能力 ,因此被广泛使用于 DNA扩增技术当中 ,但是国内尚未报道有关 Taq DNA聚合酶基因用于转基因的研究。若将此耐热
基因转入某些经济作物中培育耐热新品种 ,将会有很好的前景和实用价值。本试验将初步构建 Taq DNA聚合酶的基因表达
双元载体。通过引物设计 ,用 PCR法从含有 Therm us aquaticus DNA polymerase克隆基因的散装 Taq DNA 聚合酶中扩增耐热
DNA 聚合酶基因 ,得到约 215 kb的 DNA片段。扩增片段连接到质粒 pUC19中测序证实是 Taq DNA聚合酶基因 ,再将该片段
重组到双元载体 pB in19中 ,通过蓝白筛选选择重组子 ,构建耐热 DNA聚合酶的基因双元载体 pB in192Taq。对其作进一步的
加工 ,即插入植物启动子和增强子等后 ,可通过土壤农癌杆菌的介导作用 ,用作植物转基因之用。
关键词 : 　PCR　Taq DNA聚合酶 双元载体 蓝白筛选
The Establish of Expression Vector of the
M ostable DNA Polymerase Gene
L iang Xuelian Guan Caidie L iu Yong L iao Boqiang
( Zhongkai University of Agriculture and Technology, College of L ife Sciences, Guangzhou 510225)
　　Abs trac t: 　Taq DNA polymerase , as an important reagent in PCR technique, features structural stability and high temperature re2
sistant, and can compose DNA in the temperature above 90℃1 Taq DNA polymerase has been extensive used in the technique of DNA
amp lification, but it has not been reported interiorly the study of genetic engineering1 This experimentation established the exp ression
vector of Taq DNA polymerase gene1 Themostable DNA polymerase gene had been amp lified from Taq DNA polymerase in bulk which
contain Therm us aquaticus DNA polymerase clone gene using PCR technique through p rimer design1 The amp lified 215 kb DNA frag2
ment was inserted into pUC19 and confirmed to be Taq DNA polymerase gene by DNA sequencing, then combined into binary vector
pB in191 B lue2white selection result showed that, the exp ression vector pB in192Taq of Taq DNA polymerase gene was built successful2
ly, which can be used in p lant transgene through the medication from A grobzcterium rum efaciens1
Key wo rds: 　PCR　Taq DNA polymerase　B inary vector　Bule2white selection
收稿日期 : 2009207227
基金项目 :广东省科技厅“甜糯玉米耐热 DNA聚合酶基因的转化与耐热品系选育”(2007A2030000223)
作者简介 :梁雪莲 (19692) ,女 ,山西省文水县人 ,博士 ,主要从事农作物抗逆性基因工程研究 ; E2mail: liangxuelian2005@ sina1con　　耐热 DNA聚合酶广泛应用于 PCR技术中 [ 1 ] ,但尚未报道用于转基因培育耐热性转基因植物 ,国内也很少报道 Taq DNA 聚合酶的基因工程研究。这种 DNA聚合酶具有耐高温的特性 ,其最适的活性温度是 72℃,连续保温 30 m in仍具有相当的活性 ,而且在比较宽的温度范围内都保持着催化 DNA合成的功能 ,一次加酶即可满足 PCR反应全过程的需求 [ 2 ]。若能将耐热 DNA聚合酶基因转化在某些经 济作物 (如糯玉米 )中 ,使其在较高的温度下仍能正常地进行 DNA复制并生长 ,由此培育出抗热的转基因新品种 ,具有一定的经济价值和前景。利用土壤农癌杆菌转导是植物基因转移的常规方法 [ 3 ] ;土壤农癌杆菌 Ti质粒的 T区 DNA可以插入外源 DNA片段 ,通过转化进入植物细胞 ,再进入细胞核 ,而且还能整合到植物细胞的 DNA中并进行复制 ,因此外源 DNA 也随着得以复制表达。根据
生物技术通报 B iotechnology　B u lle tin 2009年第 10期
Taq DNA聚合酶基因序列设计了两个引物 ,用 PCR
法从散装 Taq DNA Polymerase中扩增酶基因 ,将扩
增物连接到 pUC19克隆载体 ,经测序后将此片段重
组于双元载体 pB in19上 ,构建基因表达载体 ,可用
于植物转基因之用。
1 材料和方法
1. 1 材料
1. 1. 1 细菌菌株与质粒 大肠杆菌 DH5α和质粒
载体 pUC19均购自北京鼎国生物技术有限责任公
司。双元载体 pB in19购自北京科百奥生物技术有
限公司。
1. 1. 2 酶 散装 Taq DNA Polymerase,限制性内切
酶及 T4DNA 连接酶均购自北京鼎国生物技术有限
责任公司。
1. 1. 3 主要仪器与其他试剂 Hema8000型 PCR
仪购自广州市正一科技有限公司。 TGL22000M 型
台式高速冷冻离心机购自长沙市平凡仪器仪表有限
公司。HH21型数显恒温水浴锅购自江苏省金坛市
荣华仪器制造有限公司。DY6040稳压稳流电泳仪
购自北京鼎国生物技术发展中心。WH23微型漩涡
混合仪购自上海沪西分析仪器厂。通用型 PCR试
剂盒 (50T)、DNA快速纯化 /回收试剂盒、DGL 4000
DNA Marker、抗生素、X2Gal和 IPTG均购自北京鼎
国生物技术有限责任公司。琼脂糖购自 OXO ID公
司 ,其他试剂为国产分析纯。
1. 2 方法
1. 2. 1 目的基因的获得 以散装 Taq DNA Poly2
merase代替 PCR反应体系中的 DNA模板和耐热聚
合酶两个组分 ,两引物与其他组分的用量按 PCR试
剂盒提供的用量添加。每 PCR管含 dNTP 015μl、
buffer 215μl、引物 1为 1125μl、引物 2为 1125μl、
Taq DNA polymerase 015μl、ddH2 O 19μl,总含量为
25μl。按照提供的方案进行 PCR。
1. 2. 2 PCR产物回收 PCR产物用 018%的琼脂
糖凝胶进行电泳 ,切取 215 kb处的凝胶片段 ,用
PCR回收试剂盒按照其提供的方案进行回收。
1. 2. 3 酶切、连接反应 目的 DNA 用限制酶酶
切、目的基因和载体质粒的连接反应按北京鼎国生
物技术有限责任公司提供的方法进行。
1. 2. 4 感受态细胞、重组子的制备 大肠杆菌感
受态的制备、重组子的制备及转化参照文献进行。
1. 2. 5 其他分析方法 PCR产物由北京鼎国生物
技术有限责任公司负责测序。重组质粒的蓝白筛选
方法按文献 [ 4 ]进行。
2 结果和分析
2. 1 目的基因的扩增
根据文献 [ 5 ]提供的 Taq DNA聚合酶基因的
215 kb全序列设计了两个引物 ,两段引物分别位
于基因的两端 ,并在引物的 5′端都加上 EcoRⅠ的
识别位点。
Primer 1: 5′2GGCCGAATTCATGCTGCCCCTCTTT2
GAGCCC23′
Primer 2: 5′2GGCCGAATTCTCACTCCTTGGCGGA2
GAGCC23′
以散装 Taq DNA Polymerase代替 PCR反应体
系中的 DNA模板和聚合酶两个组分 ,加入两种引物
及其他组分在 Hema8000型 PCR仪上反应 36个循
环 (94℃ 1 m in; 56℃ 1 m in; 72℃ 4 m in) ,扩增出约
215 kb的 DNA片段 (图 1)。由于生产此酶的生物
公司可能对目的基因加以改造 ,可能插入一些必要
的 DNA片段 ,因此扩增出来的产物可能会比 215 kb
的片段稍大。
图 1　PCR扩增产物的琼脂糖凝胶电泳
2. 2 重组质粒的构建
将 PCR扩增的产物用 DNA快速回收试剂盒回
收 ,与质粒 pUC19分别加 EcoRⅠ酶消化 ,并将消化
后产物混合 ,加 T4 DNA连接酶 ,在 15℃保温过夜。
转化感受态 E1coli DH5α,在氨苄平板 (含氨苄青霉
素 50 mg/m l, 200 mg/m l IPTG和 20 mg/m l X2Gal)
上筛选白色菌落 (含重组子 ) (图 2)。
091
2009年第 10期 梁雪莲等 :耐热 DNA聚合酶基因双元载体的初步构建
图 2 重组子的筛选 　　　　
为检测是否为假阳性结果 ,提取重组质粒并以
此为 DNA模板 ,加引物进行 PCR,结果能扩增出约
215 kb片段 (图 3) ,即为阳性结果。
图 3　PCR鉴定重组质粒
2. 3 双元基因表达载体的构建
双元载体 ( binary vector)系统即由两个分别含
T2DNA和 V ir基因的相容 Ti质粒构成的双质粒系
统 , T2DNA与 V ir基因分别位于两个独立的质粒上 ,
通过反式激活 T2DNA转移 (图 4)。双元载体法是
由 Hoekewa等 ( 1983)首次提出的。这种方法的优
点在于它不需要构建质粒共载体 ,但是在共培养试
验中 ,转移效率还不够高 [ 6 ]。在双元载体系统中 ,
一个是克隆质粒 ,如 pB in19,它具有 T2DNA基因 ,其
上具有多克隆位点 (MSC) ,通过限制酶酶切后可加
入外源 DNA。它可在大肠杆菌和土壤农癌杆菌中
复制 ,操作简便 ,并可在二者间转移 ,因此又称穿梭
质粒。在 T2DNA序列外 ,还有细菌选择标记基因 ,
而在 LB和 RB之间还有植物选择标记基因。双元
载体的另一个为辅助质粒 ,如通常与 pB in 19匹配
使用的 pAL4404质粒是非致病 Ti质粒 ,它具有 Ti
质粒的毒性基因 V ir, V ir基因接受植物创伤信号后 ,
就能活化转录 ,所产生的蛋白质能促进克隆质粒上
的 T2DNA转移。把外源 DNA加入克隆质粒后 ,转
化含有辅助质粒的感受态土壤农癌杆菌中并通过其
介导 ,克隆质粒中的 T2DNA 就能转移到植物基因
组中。
图 4 双元载体系统
本试验所选用的双元载体是 pB in 19 (图 5 )。
双元载体 pB in19由 Bevan等 ( 1984)构建的微型质
粒 ,是应用得最广泛的微型 Ti质粒 (M ini2Ti p las2
m id)。它的细菌选择标记为原核生物的卡那霉素
抗性基因 (A phI) ,而植物的选择标记则是真核生物
的卡那霉素抗性基因 (nos2N ptⅡ) ,它含有来自 pTiT37
的 T2DNA左右边界序列 ,以及来自噬菌体 M13mp19
的 lacZ基因。在 lacZ基因内部有多克隆位点 MCS,
可插入外源基因使其失活 ,在含有 IPTG和 X2Gal的
平板上筛选出呈白色的转化子菌落 ,具有质粒小 ,宿
主广 ,操作方便等优点。
图 5 双元载体 pB in19结构图
191
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重组质粒用 EcoRⅠ酶切后 , 经电泳得到约
215 kb的片段 ,将此基因片段和同样经 EcoRⅠ酶消
化的双元载体 pB in19混合 ,加 T4 DNA连接酶 15℃
保温过夜后 ,并转化感受态 E1coli DH5α,在卡那平
板 (含卡那霉素 50 mg/m l, 200 mg/m l IPTG和 20
mg/m l X2Gal)上筛选白色转化菌落 (图 6、图 7)。
图 6 蓝白筛选白色菌落 　　　　　图 7　重组子
2. 4 基因表达双元载体的鉴定
为检测是否有假阳性结果 ,提取表达双元载体
作为 DNA模板 ,加两引物和其他试剂进行 PCR法
鉴定 ,经电泳结果得到约 215 kb的片段 (图 8) ,即
为阳性结果。
图 8　PCR鉴定基因表达双元载体
3 讨论
3. 1 目的基因获得的策略
本试验的一个难点是目的基因的获得。假设散
装 Taq DNA聚合酶中残留有表达载体 ,且平均分布
在酶液中 ,其量也大于 PCR中 DNA模板的最低量
要求 ,可不经过提取直接以此酶液代替 PCR体系中
DNA模板和 Taq DNA聚合酶这两种成分 ,加入其他
试剂和引物进行 PCR,结果有 215 kb片段的扩增产
物 ,经测序后证明是所需的 Taq DNA聚合酶基因。
3. 2 基因表达载体的高效性
本试验利用双元载体构建耐热 DNA聚合酶基
因表达载体 ,下一步将对其进行必要的加工 ,插入表
达重组基因所需的植物启动子、增强子等。总之 ,提
高对转化外源基因表达的调控能力 ,不断对表达载
体进行加工和完善是一项长期且艰难的工作 ,但能
为 Taq DNA聚合酶开创其他领域的应用 ,特别是转
基因方面提供必要的前提。
3. 3 Taq DNA聚合酶基因在基因工程中的前景
当今 ,转基因技术广泛应用于农业生产。应用
转基因技术将目的基因导入经济作物体内进行品种
改良已取得了许多实际及可喜的进展。自 1983年
首次成功获得转基因烟草以来 ,植物基因工程已在
抗虫、抗病、抗除草剂、抗逆、品种改良等方面有了许
多深入的发展。迄今为止 ,全世界已分离目的基因
几百个 ,获得转基因植物近 200种 ,其中农杆菌转化
成功的植物已达 116种 [ 4 ]。Taq DNA聚合酶作为一
种生化实验室常用的酶、PCR的重要试剂 ,甚少有
基因工程方面的研究。该酶本身天然构想稳定 ,具
有耐高温的特性 ,在 94℃时仍有活性 ,能在比较宽
的温度范围内都保持着催化 DNA合成的能力 ,是
植物基因工程抗热基因的良好资源 ,但在国内外
却没有相关报道。某些经济作物 ,如甜、糯玉米 ,
由于其价格较高 ,又缺乏耐热品种 ,而且绝大多数
国内品种只适合华南、华中地区春、秋种植 ,并且
在南方夏季高温多雨的条件下 ,会出现花期不遇
和吐丝困难等情况。若将 Taq DNA聚合酶基因作
为耐热基因转化某些经济作物 ,培育耐热新品种
就可以解决广东地区反季节种植的难题 ,有着深
远的现实意义及广阔的发展前景。
其它同类耐高温酶的基因工程研究也只限于
基因克隆和在酵母或大肠杆菌中的表达 ,以及一
些耐热性研究等方面的研究 ,例如 ,超耐热酸性α2
淀粉酶 [ 7 ] 、嗜热脂肪芽孢杆菌 HY269耐热金属蛋
白酶基因 [ 8 ]等。本试验尝试用双元载体来构建基
因表达载体 ,类似的耐热基因表达载体的研究国
内发表的不多 ,李佳等 [ 9 ]曾发表对耐热植酸酶基
因 phyA新型表达载体的构建。本试验对 Taq DNA
聚合酶基因构建的表达载体将开启抗热基因转化
的新一页。
291
2009年第 10期 梁雪莲等 :耐热 DNA聚合酶基因双元载体的初步构建
参 考 文 献
1 黄卓烈 ,朱利泉 ,生物化学 1北京 :中国农业出版社 , 2004,
385～3881
2 马建岗 ,基因工程原理 1西安 :西安交通大学出版社 , 2007, 61
～64, 128～1291
3 肖尊安 ,植物生物技术 1北京 : 化学工业出版社 , 2005, 191
～2041
4 王关林 ,方宏筠 ,植物基因工程 (第 2版 ) 1北京 :科学出版社 , 2002, 327～339; 766～76915 金城 ,刘宏迪 ,杨寿钧 ,等.生物工程学报 , 1995, 11 (3) : 239～24416 吴乃虎 ,基因工程原理 1北京 : 高等教育出版社 , 1989, 314～32617 郭建强 ,李运敏 ,岳丽丽 ,等 1 生物工程学报 , 2006, 22 ( 2 ) :237～24218 孙超 ,金城 ,杨寿钧等 1生物工程学报 , 1999, 8 (1) : 63～6719 李家 ,刘钟滨 1同济大学学报 (医学版 ) , 2004, 25 (6) : 41～441
(上接第 180页 )
2. 3 拷贝数稳定性检测结果
菌种 CHBV取其平均值约为 15155,菌种 CMOX取
其平均值约为 20181,各自平均值的差值约为
5126。乙肝发酵液 M ox基因和 HB sA g基因达到荧
光强度阈值的循环数各自平均值的差值约为
5111, 则乙肝菌种 HB sA g基因拷贝数为 38个拷
贝 ,乙肝发酵液 HB sAg基因拷贝数约为 35个拷贝 ,
发酵前后基因拷贝数相差 - 719%。又分别取了两
批发酵液测定 HB sA g基因在重组汉逊酵母中拷贝
数 ,变化分别为 - 113%和 612%。由此可见发酵前
后 HB sAg基因在重组汉逊酵母中稳定存在 (图 6和
表 2)。
表 2　菌种和发酵液的 HB sA g和 M ox基因
达到阈值时的 C t值
名称 Ct值
菌种 CHBV1、CHBV2 1514595、1516
菌种 CMOX1、CMOX2 201784、2018351
发酵液 CHBV1、CHBV2 1512073、1419635
发酵液 CMOX1、CMOX2 2012292、201161
3　讨论
在相对定量 PCR反应中 ,指数扩增期内基线的
选择十分重要。本试验经过线性范围的摸索得到当
在荧光阈值为 104时 ,目的基因和内源参照基因梯
度的线性范围很好。由此把基线选在荧光阈值为
104时 ,通过比较目的基因和内源参照基因 Ct值的
而判定待测目的基因的拷贝数。
定量 PCR是一种新近发展的技术 ,它通过扩增
产物估算起始拷贝数 ,具有灵敏、快速、并在电脑分
析软件支持下实现对 PCR扩增产物的动态监测和
自动定量等优点 ,但 PCR反应效率的微小变化都将
使结果产生较大幅度偏差。本试验为了减少试验误
差而设置了复孔取其平均值进行计算 [ 6～8 ] ,可使荧
光定量 PCR成为一种有效的分析基因拷贝数的方
法。实时定量 PCR在分析细胞因子的表达、单核苷
酸多态性 ( SNP)及易位基因的检测等方面还有非常
广泛的应用 [ 9～11 ]。
参 考 文 献
1 李影 ,何蕴韶 ,程刚 ,等. 中山医科大学学报 , 2001, 22 ( 1 ) :
8～10.
2 宋勇涛 ,王勇 ,刘勤 ,等. 动物医学进展 , 2008, 29 (11) : 55～59.
3 王宇 ,刘景晶. 药学进展 , 2006, 30 (9) : 385～390.
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2005, 5 (2) : 209.
5 朱建楚 ,胡银岗 ,奚亚军 ,等. 西北农业学报 , 2005, 14 ( 6 ) :
78～82.
6 付春华 ,陈孝平 ,余龙江 ,等. 激光生物学报 , 2005, 6 ( 14) : 466
～471.
7 W eng HB, Pan AH, Yang LT, et al. PlantMolecular B iology Report,
2004, 22: 289～300.
8 Inghamd J, Beer S, M iney S, et al. B ioTechniques, 2001, 31:
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9 Ueda M, Imada K, Imura A, et al. B r J Haematol, 2005, 128 ( 2 ) :
169～176.
10 Johnson VJ, Yucesoy B, Luster M I. Cytokine, 2004, 27 ( 6 ) :
135～141.
11 Taube T, Eckert C, Komer C, et al. Leuk Res, 2004, 28 ( 7 ) :
699～706.
391