全 文 ：研究报告
生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2011年第 1期
谷氨酸棒杆菌 metX、dapA基因敲除对
苏氨酸合成的影响
吕扬勇 伍展红 郑穗平
(华南理工大学生物科学与工程学院,广州 510006 )
摘 要: 谷氨酸棒杆菌中 m e tX基因编码蛋氨酸合成途径关键酶高丝氨酸乙酰转移酶, dapA基因编码赖氨酸合成途
径关键酶二氢吡啶二羧酸合成酶。为研究这两个基因缺失对苏氨酸积累的影响 , 以谷氨酸棒杆菌 R102 ( AHVr )为出发菌
株 ,通过重叠延伸 PCR及同源重组技术分别构建了 m etX、dapA单基因缺失突变株 R102m etX、R102dapA 以及双基因缺失
的突变株 R102m etXdapA。对出发菌以及上述 3株重组菌进行初步摇瓶发酵试验,用 H PLC法测定发酵液中苏氨酸含量。
结果表明, 发酵 72 h后, 3株重组菌的苏氨酸产量分别为 258、2 38和 301 g /L, 比原始菌株分别提高了 42 5%、315%
和 66 3%。
关键词: L-苏氨酸 蛋氨酸 赖氨酸 基因敲除 谷氨酸棒杆菌
Effect ofM etX and DapA Gene Knockout on Threonine
B iosynthesis inCorynebacterium glutam icum
LvYangyong W u Zhanhong Zheng Suiping
( School of B ioscience and B ioengineering, South China University of T echnology, Guangzhou 510006)
Abstrac:t m etX and dapA gene play sign ificant ro les in m eth ionine and lysine biosynthesis pathw ay s respec tive ly in C orynebacte-
rium g lu tam icum. In o rder to study the e ffect of gene de letion on threonine accum ulation, m etX, dapA gene deficient mutants
R102m etX, R102dapA and R102m etXdapA were construc ted from C orynebacterium g lutam icum R102( AHV r ) by SOE-PCR and
hom o logous recomb ination. A fte r 72 h ferm entation, the threon ine y ield in bro th of the three recomb inan t stra ins m easured by H PLC
w ere 2 58 g /L, 2 38 g /L, 3 01g /L, increasing by 425% , 315% and 66 3% , respective ly, com par ing w ith that o f the or ig ina l
stra in R102.
Key words: L-threon ine M eth ion ine Lysine Gene knockout Corynebacter ium glutam icum
收稿日期: 2010-06-12
基金项目:国家科技支撑计划项目 ( 2007BAK36B03 )
作者简介:吕扬勇,男,硕士研究生,研究方向:生物制药; E-m ai:l lv yy@ m ai.l scu t. edu. cn
通讯作者:郑穗平,副教授, E-m ai:l sp zheng@ scu t. edu. cn
在人体所必需的 8种氨基酸中,苏氨酸是仅次
于蛋氨酸、赖氨酸和色氨酸的第 4种氨基酸 [ 1, 2 ]。
苏氨酸是一种重要的营养强化剂, 已被广泛应用于
食品、饲料和医药等方面。
苏氨酸的主要生产菌种有大肠杆菌 (E scherichia
coli)、谷氨酸棒杆菌 ( Corynebacterium g lutam icum )、
黏质沙雷氏菌 ( Serratia marcescens ) 和黄色短杆菌
( B revibacterium f lavum )。由于大肠杆菌的遗传调
控背景清楚, 生长速度快, 因此成为构建 L-苏氨酸
重组工程菌时较为常用的宿主菌株 [ 3]。相比而言,
虽然无致病性的谷氨酸棒杆菌也是苏氨酸生产的传
统菌种,但人们长期以来多采用诱变育种技术 [ 4, 5]
来获得有应用价值的工业菌株, 该方法存在工作量
大、筛选过程繁琐、容易发生回复突变等缺点, 获得
理想的苏氨酸生产菌株难度较大。近年来随着谷氨
酸棒杆菌模式菌株 ATCC 13032基因组测序的完
成 [ 6] , 氨基酸合成相关基因调控机理的清晰, 以及
谷氨酸棒杆菌基因操作载体系统的完善,使得通过
2011年第 1期 吕扬勇等:谷氨酸棒杆菌 m etX、dapA基因敲除对苏氨酸合成的影响
分子生物学手段对谷氨酸棒杆菌进行相关改造来达
到育种的想法变成现实 [ 7- 10]。
与大肠杆菌相比, 谷氨酸棒杆菌中苏氨酸合成
途径步骤一致,但在关键酶的结构及调控模式上存
在较大差异,其主要体现以下方面: ( 1)天冬氨酸激
酶的调控方式不同。在大肠杆菌中天冬氨酸激酶存
在 3种由 AK I、AK II和 AK III基因分别编码的同
工酶,而谷氨酸棒杆菌中不存在同工酶,由 lysC基
因编码。 ( 2)编码相关酶的基因不同。大肠杆菌中
负责编码运输苏氨酸至胞外的转运蛋白的基因有
rhtA、rhtB和 rhtC, 而谷氨酸棒杆菌中只有 thrE基
因 [ 11] ;大肠杆菌中由高丝氨酸合成蛋氨酸途径的第
一个酶由 metA 基因编码, 而谷氨酸棒杆菌中则由
metX基因编码 [ 12, 13 ]。 ( 3)操纵子的结构不同。大
肠杆菌中苏氨酸操纵子的相关基因由 thrA (高丝氨
酸脱氢酶 )、thrB(高丝氨酸激酶 )、thrC (苏氨酸合成
酶 ) 3个基因组成,而谷氨酸棒杆菌中则由 hom (高
丝氨酸脱氢酶 )、thrB (高丝氨酸激酶 )两个基因组
成 [ 14, 15 ]。这些差异为构建重组谷氨酸棒杆菌生产
苏氨酸提供了思路。
基于此,本研究以一株具有苏氨酸结构类似
物抗性的菌株 R102( AHV r, 即解除苏氨酸过量对
高丝氨酸脱氢酶的反馈抑制 )为出发菌株,敲除赖
氨酸关键酶基因 dapA, 解除苏氨酸、赖氨酸对天
冬氨酸激酶的协同反馈抑制; 敲除蛋氨酸关键酶
基因 metX, 解除蛋氨酸对高丝氨酸脱氢酶的反馈
阻遏, 从而增加苏氨酸合成方向的代谢流, 为下一
步的育种提供了遗传背景更为清楚的基础菌株。此
外, 通过初步发酵试验考察其胞外苏氨酸合成的
变化。
1 材料与方法
11 材料
111 菌种、质粒 菌株及质粒相关特征如表
1所示。
112 培养基及培养条件 基本培养基 ( g /L ): 葡
萄糖 20, ( NH4 ) 2 SO4 10, KH 2 PO4 1, M gSO 4 7H 2O
04, FeSO4 7H 2O 001, M nSO4 001, 琼脂粉 15, 生
物素 100 g /L。种子培养基 ( g /L ):葡萄糖 40,蛋白
胨 20, KH 2 PO4 15, K 2HPO4 05, M gSO4 7H 2O 05,
酵母粉 5,生物素 50 g /L。发酵培养基 ( g /L ): 葡萄
糖 100, KH 2 PO4 05, K2HPO4 05, ( NH4 ) 2 SO4 20,
M gSO4 7H2O 025, FeSO4 7H2O 001, M nSO4 4H 2O
001, C aCO3 20, 酵母粉 5, 生物素 400 g /L, VB1 2
mg /L。氨基酸补充培养基:在基本培养基中加入终
浓度为 01 g /L的氨基酸, 上述培养基均需要调整
pH 70。
表 1 本研究所用的菌种及质粒
菌株及质粒 相关特征 参考文献
E. coli TOP10
F-, m crA ( m rr-h sd RM S-m crBC ) , 80, lacZM 15, lacX74, recA1,
ara139 ( ara-leu) 7697, galU, galK, rps, ( Strr) endA1, nupG 本实验室
R102 Derived from ATCC 13032 [ 4]
R102m etX R102 w ith delet ion in the m etX genes 本研究
R102dapA R102 w ith delet ion in the dapA genes 本研究
R102m etXdapA R102 w ith delet ion in bothm etX and dapA genes 本研究
pk18m obsacB KmRSucS, Mob ilizab leE. coli vector [ 8]
pk18-dm etX C ontain ingm etX delet ion fragm en t dm et in pk18mob sacB 本研究
pk18-ddapA C ontain ingdapA delet ion fragm en t ddapA in pk18mobsacB 本研究
113 酶与试剂 限制性内切酶 X ba I、E coR I、T4
DNA ligase和 ExTaq DNA Polymerase均为宝生物工
程 (大连 )有限公司产品, PCR产物纯化及胶回收试
剂盒购自 Q IAGEN公司,胰蛋白胨、酵母提取物购自
Oxoid公司;苏氨酸标准品购自 S igma公司, 其他化
学试剂均为国产色谱纯。
159
生物技术通报 B iotechnology Bulletin 2011年第 1期
114 引物 为了获得 metX、dapA基因内缺失部
分碱基的 DNA片段,参考谷氨酸棒杆菌 ATCC13032
基因组序列,设计重叠延伸 PCR引物如表 2。其中
metX-2、metX-3以及 dapA-2、dapA-3分别有 20 bp互
补序列 (下划线部分 ) , metX-1、dapA-1有 E coR I酶
切位点, metX-4、dapA-4有 Xba I酶切位点。分别在
metX、dapA基因上下游设计引物,鉴定该基因是否敲
除成功。 ddapA鉴定引物如下: 上游: 5-TGCCC-
AACGCTACAGAGTCCAGAAT-3, 下游: 5-GCGCTCT-
GGTTAGAGGAAGCATCTG-3。dmetX鉴定引物如下:
上 游: 5-CGGCTTTGCTGCAATCTAGCTTTAA-3, 下
游: 5-TTACGGAGGTACATCCGCTTAATCC-3, 述引物
在上海生工生物技术有限公司合成。
表 2 重叠延伸 PCR引物
引物名称 引物序列 ( 5-3)
m etX-1 CGCGAATTCCGAAGCCGGAGCAATCATTAC
m etX-2 CAACTGCTCTAAGCAGTAAACCCACTCTAGGGTGCGGGC
m etX-3 TTTACTGCTTAGAGCAGTTGTGGCGAACTAGAAATCGACG
m etX-4 TATTCTAGAGTCTTCGTCTGGGGAGATGAGG
dapA-1 CTTGAATTCTCCGCGAAGTAGCGGTAGAATG
dapA-2 TATTTTTATCAAATGCTCGACCACAGATGTCCGCGTGTTG
dapA-3 TCGAGCATTTGATAAAAATATCTGCAGGGCATCAACGTAGG
dapA-4 TTCTCTAGACGCACCCTGCATCGACTTAACAACG
12 方法
121 载体 pk18-dm etX、pk18-ddapA的构建 采
用重叠延伸 PCR的方法 [ 16] , 获得 m etX、dapA部分
基因缺失的 DNA片段 dmetX、ddapA。以 R102基因
组 DNA为模板通过普通 PCR方法分别获得 metX、
dapA基因 5端片段及 3端片段, 以 PCR产物为模
板通过重叠延伸 PCR获得 metX、dapA基因内双缺失
的 DNA片段 dmetX、ddapA。将获得的 dmetX、ddapA
片段分别与基因敲除载体 pk18mobsacB连接。
122 重组载体转化 R102 R102感受态的制备
及外源基因电击转化参考 Jang[ 17 ] , vanderR est[ 18 ] ,
并略作修改,确定其电击转化条件: 1 800V, 20 F,
200 , 1 mm电击杯。重组载体转化 R102感受态细
胞后,经两次同源重组,分别在 kan抗性平板及 10%
蔗糖平板上进行两次筛选, PCR方法鉴定筛选分别得
到 metX、dapA基因缺失的谷氨酸棒杆菌突变株
R102m etX、R102dapA以及 R102metX dapA。
123 Met、Lys营养缺陷型的验证 将得到的上述
菌株在 LB培养基中 30 过夜培养后,分别划线于基
本培养基、蛋氨酸补充培养基、赖氨酸补充培养基平
板以及同时补充两种氨基酸的平板,观察生长情况。
124 各株菌的初步发酵试验 对 R102、R102dapA、
R102metX、R102m etX dapA 4株菌进行初步的苏
氨酸发酵试验。将培养 24 h的种子液按 10%接种
量转接于发酵培养基中, 按正交设计试验得到的最
佳条件 30 , 215 r/m in发酵, 考察 metX、dapA基因
缺失对菌株生长的影响,发酵 72 h后用高效液相色
谱法检测发酵液中苏氨酸含量。
125 发酵液中苏氨酸的含量 采用高效液相分
析系统 (HPLC) 柱前衍生测定。衍生方法: 取发酵
液 1mL, 12 000 r /m in离心 5m in ,取上清液 100 L
加入 15mL离心管中, 加入已经配制好的衍生缓冲
溶液 ( 05 mol /L碳酸氢钠溶液, pH90) 100 L, 摇
匀后再加入衍生试剂溶液 ( 1% 2, 4-二硝基氟苯的
乙腈溶液 ) 150 L ,摇匀,将离心管置于 60 水浴
中暗处恒温加热 60 m in后取出, 冷却溶液至室温
后, 加入定容缓冲液 ( 001 mo l/L磷酸二氢钾, pH
70) 稀释至 12 mL, 用 022 m针筒式过滤器过
滤后, 用于色谱分析。采用 A gilent 1100高效液相
色谱仪, Ag ilent 20RBAX SB-C18 ( 46 150 nm, 5
m )色谱柱, 紫外检测器, 360 nm检测。流动相分
别为 A: 乙酸钠缓冲溶液 ( pH65, 含 10 mL /L N,
N-二甲基甲酰胺 ) , B: 60% 乙腈。流动相速度为
10mL /m in; 柱温 22 。梯度洗脱程序如表 3所
示。测定完毕以后利用标准曲线计算发酵液中苏氨
酸的含量。
表 3 流动相梯度程序
时间
( m in )
流动相
A (% ) B (% )
0 80 20
4 80 20
10 70 30
15 60 40
20 50 50
25 5 95
30 80 20
160
2011年第 1期 吕扬勇等:谷氨酸棒杆菌 m etX、dapA基因敲除对苏氨酸合成的影响
2 结果
21 重组载体的构建
以 R102基因组 DNA为模板通过普通 PCR方
法获得 metX基因 5端约 426 bp片段及 3端约
467 bp片段,以 PCR产物为模板通过重叠延伸 PCR
获得 metX 基因内缺失约 100 bp的 DNA 片段
dm etX, 约 893 bp。将获得的目的片段 dmetX与基
因敲除载体 pk18mobsacB连接, 转化感受态大肠杆
菌 top10, 提取质粒, 酶切鉴定 (图 1)。采用同样的
方法获得 dapA基因 5端约 650 bp片段及 3端约
550 bp片段, 以 PCR产物为模板通过重叠延伸 PCR
获得 dapA基因内缺失约 500 bp的 DNA片段 dda-
pA, 约1 200 bp。将获得的目的片段 ddapA与基因
敲除载体 pk18mobsacB连接, 转化感受态大肠杆菌
top10,提质粒,酶切鉴定 (图 2)。
22 重组载体转化 R102及突变株的筛选
重组载体 pk18-dmetX转化 R102后, 经第 1次
同源重组, 重组菌基因组 DNA 同时含 metX 及
dmetX,经第 2次同源重组,获得仅含 dmetX的缺陷
型突变株及仅含 metX的回复突变株。以基因组
DNA为模板,利用 dmetX鉴定引物进行 PCR鉴定,
结果如图 3所示。重组载体 pk18-ddapA转化 R102
后, 同样经过两次同源重组, 获得含 ddapA的缺陷
型突变株及仅含 dapA的回复突变株。以基因组
DNA为模板,利用 ddapA鉴定引物进行 PCR鉴定,
结果如图 4所示。
M. 250 bp DNA Ladder Marker; 1. pk18-dm etX; 2. pk18-
dm etX /E coR I+ X ba I
图 1 重组载体 pk18-dm etX双酶切鉴定
M. 250 bp DNA Ladder Marker; 1. metX; 2. m etX
图 3 m etX基因缺失菌株的筛选
M. 250 bp DNA ladderM arker; 1. pk18-ddapA; 2. pk18-dda-
pA /E coR I+ X ba I
图 2 重组载体 pk18-ddapA双酶切鉴定
M. DNA Marker DL2000TM ; 1. dapA; 2. dapA
图 4 dapA基因缺失菌株的筛选
23 蛋氨酸、赖氨酸营养缺陷型的验证
由图 5-A可以看出, 敲除了 dapA、metX基因的
菌株在基本培养基上均不能生长。敲除了 dapA基
因的菌株 R102dapA 只能在赖氨酸补充培养基上
生长 ( 5-B ); 而敲除了 me tX基因的菌株 R102metX
只能在蛋氨酸补充培养基上生长 ( 5-C ) ;两个基因
161
生物技术通报 B iotechnology Bulletin 2011年第 1期
同时缺失的菌株 R102m etX dapA 只能在两种氨基
酸都存在的情况下才能生长 ( 5-D)。结果表明, 该
两个基因的缺失分别造成了谷氨酸棒杆菌 R102的
赖氨酸、蛋氨酸营养缺陷型。
图 5 蛋氨酸、赖氨酸营养缺陷型验证结
24 metX、dapA基因缺失对菌体生长及苏氨酸产
量影响的初步发酵试验
由 4株菌的生长曲线 (图 6)可以看出,敲除了
基因的重组菌株的生长速度比原始菌株 R102有所
减慢, 但最终二者的生物量接近,说明该基因敲除没
有对菌体生长造成较为明显的影响。
采用 HPLC检测发酵液中的苏氨酸产量,在如前
所述的检测条件下, 苏氨酸标准品及 R102metX-
dapA菌株发酵液 (其他菌株发酵液图略 )测定的色
谱图如图 7所示。各株菌发酵 72 h后苏氨酸产量,
R102、R102metX、R102dapA 和 R102metX-dapA
胞外苏氨酸浓度分别为 181、258、238和 301 g /L。
3 讨论
本研究在谷氨酸棒杆菌 R102 ( AHV r )的基础
上,通过分子生物学手段分别构建了 metX、dapA单
基因缺失菌株 R102metX、R102dapA 以及两个基
因同时缺失的菌株 R102metXdapA。在构建
metX、dapA基因缺失突变株过程中运用了重叠延伸
PCR的方法, 该技术能够在体外进行有效的基因重
组, 能快速获得依靠限制性内切酶消化的方法难以
得到的产物。在谷氨酸棒杆菌体系 [ 19]以及大肠杆
菌中均有应用 [ 20]。
图 6 四株菌的生长曲线
在利用谷氨酸棒杆菌生产苏氨酸的研究中较
多采用物理、化学等随机诱变的方法筛选得到结
构类似物抗性菌株, 2009年解晓鹏等 [ 5]通过紫外
及硫酸二乙酯诱变得到一株 AHV抗性稳定的谷氨
酸棒杆菌 UV-3-DES, 初步发酵苏氨酸产量为 031
g /L; D iesve ld等 [ 21]通过在具有 AHV、AEC双重抗性
的谷氨酸棒杆菌 DM368-3中过量表达大肠杆菌氨基
酸转运基因,以此增强苏氨酸胞外运输能力, 使胞外
产量达到 6 g /L左右。本研究利用分子生物学手段
成功敲除了谷氨酸棒杆菌 metX、dapA基因,解除了对
天冬氨酸激酶、高丝氨酸脱氢酶的反馈抑制, 克服了
诱变菌株回复突变的缺点,目前通过敲除该类基因达
到营养缺陷型的报道尚未见到。初步发酵结果表明,
两个基因同时缺失的重组菌胞外苏氨酸积累量达到
301 g /L明显高于原始菌株的181 g /L,该菌具有进
一步改造提高苏氨酸产量的潜力。
此外,我们还比较了 4株菌的生长趋势, 结果表
明, 敲除了基因的 3株重组菌生长趋势在初始的一
段时间内均比原始菌株缓慢,但 24 h后 4株菌的总
体生物量接近。表明该基因的敲除未对重组菌的生
长造成较大的影响,为下一步菌种构建及苏氨酸发
酵提供了保障。本研究敲除了蛋氨酸、赖氨酸合成
途径中关键酶基因,在后续的研究中将通过过量表
达载体 pEC-T18mob2串联表达苏氨酸操纵子 hom-
thrB基因以及转运基因 thrE等,为进一步育种提供
良好的基础。
162
2011年第 1期 吕扬勇等:谷氨酸棒杆菌 m etX、dapA基因敲除对苏氨酸合成的影响
a. 2, 4-二硝基氟苯; b.苏氨酸
图 7 标准品 (A)及 R102m etXdapA发酵液 (B )HPLC分析图谱
参 考 文 献
[ 1] 冯美卿, 瞿超进. L-苏氨酸制备方法评述. 河北工业科技,
1999, 16 ( 4) : 15-18.
[ 2] Debabov VG. The threon ine story. Advances in B iochem ical Eng-i
neering and B iotechno logy, 2003, 79: 113-136.
[ 3] L eeMH, Lee HW, Park JH, et a.l Im proved L-Threon ine produ c-
tion ofE scherich ia coli m utan t by opt im izat ion of culture cond itions.
Jou rnal of B ioscience andB ioeng ineering, 2006, 101 ( 2) : 127-130.
[ 4] A rcher JAC, Solow-Cordero DE, S in skey A J. A C-term inal delet ion
in Coryn ebacterium g lu tum icum hom oserin e dehyd rogenase abolishes
allosteric inh ib it ion by L-th reon in e. Gene, 1991, 107: 53-59.
[ 5] 解晓鹏,张力,杨晓志,等. L-苏氨酸产生菌的选育. 安徽农业科
学, 2009, 37( 22 ): 10417-10419.
[ 6] Kal inow sk i J, B athe B, B artels D, et a.l The com p leteC orynebac te-
rium g lutam icum ATCC 13032 genom e sequ ence and its imp act on
the produ ct ion on ofL-aspartate-derived am ino acid s and vitam ins. J
B iotechno,l 2003, 104: 5-25.
[ 7] K irchner O, T auch A. Tools for gen et ic eng ineering in the am ino
acid-p roducing bacterium C orynebac terium g lu tam icum. J B iotechn-
o,l 2003, 104: 287-299.
[ 8] S chafer A, Tauch A, JagerW, et a.l Sm allm ob ilizable m ult-i pur-
pose clon ing vectors derived from theE sch erichia coli p lasm ids pK18
and pK19: selection of defin ed deletions in the chrom osom e of
C orynebac terium glu tum icum. Gene, 1994, 145: 69-73.
[ 9] E ikm ann s B J, M etzger M, Rein-sch eid D, et a.l Amp lificat ion of
three Th reon in e b iosyn th es is genes in Coryn ebacterium g lu tam icum
and its in fluence on carbon flux in d ifferent strain s. App lM icrob io l
B iot, 1991, 34: 617-622.
163
生物技术通报 B iotechnology Bulletin 2011年第 1期
[ 10 ] Eggeling L, Oberle S, S ahm H. Imp roved L-lys ine y ield w ith
Coryneba cterium g lu tam icum: u se of dapA resu lting in increased
f lux comb in edw ith grow th lim itation. ApplM icrob iol B iot, 1998,
49: 24-30.
[ 11 ] S im ic P, Sahm H, E ggeling L. L-Threon ine Export: U se of p ep-
t ides to id ent ify a new tran slocator from C orynebac terium g lu tam i-
cum. J Bacterio,l 2001, 183: 5317-5324.
[ 12 ] F igge RM. M eth ion ine B iosyn thesis inE scherich ia coli and Coryne-
ba cterium g lu tam icum. M icrob iolMonogr, 2007, 5: 163-193.
[ 13 ] Lee H S, Hw ang B J. M eth ion ine b iosyn thesis and its regu lat ion in
Coryneba cterium g lu tam icum: p ara llel pathw ays of transsu lfurat ion
and d irect su lfhydrylation. App l M icrob iol B iot, 2003, 62:
459-467.
[ 14 ] Fol lett ieMT, Sh inHK, S in skeyA J. Organ izat ion and regu lat ion of
the Coryn eba cterium g lu tam icum hom-th rB and th rC loc.i MolM -i
crob io,l 1988, 2( 1) : 53-62.
[ 15 ] Peop les OP, L ieb lW, Bod isM, et a.l Nucleotide sequence and
f ine structu ral analys is of th e Coryneba cterium g lu tam icum hom-
thrB operon. M olM icrob io,l 1988, 2( 1) : 63-72.
[ 16 ] 阮红, E ikm ann sB.谷氨酸棒杆菌基因缺失菌株的定点构建.微
生物学报, 2002, 42: 458-464.
[ 17] Jang KH, B ritzML. Im proved electrotransform at ion frequen cies of
C orynebacterium g lutam icum us ing cel-l su rface m u tan ts. B iotech-
nology Letters, 2000, 22: 539-545.
[ 18] van der RestME, Lange C, M olenaar D. A heat shock follow ing
electroporat ion induces h igh ly eff icient trans form ation of C oryne-
bacterium g lu tam icum w ith xenogeneic p lasm id DNA. App lM icro-
b iol B iot, 1999, 52: 541-45.
[ 19] 陈君,吕扬勇,李智涛,等. O tsAB途径对谷氨酸棒杆菌 ATCC
13032胞内海藻糖含量及细胞耐受性的影响.河南工业大学学
报:自然科学版, 2009, 30 ( 6) : 64-70.
[ 20] 张雪,闫继爱,于雷,等. 含苏氨酸操纵子重组质粒的构建及其
对大肠杆菌 L-苏氨酸积累的影响.微生物学报, 2009, 49 ( 5 ):
591-596.
[ 21] D iesveld R, T ietze N, Frs t O, et a.l A ct ivity of Exporters of
E scherich ia coli in C oryneba cterium g lu tam icum, and the ir use to
in crease L-Threon ine p roduction. J M ol M icrob iol B iotechn o,l
2009, 16( 34 ) : 198-207.
(责任编辑 李楠 )
164