全 文 ：研究报告
生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2010年第 9期
向日葵菌核病根际拮抗菌的筛选与鉴定及其
拮抗机理的初步研究
侯启会 1 丁延芹 1 杜秉海 1, 2 靳奉理1, 2 路晓萌 1
孙臻鑫1 周瑞军 3 姚良同 1
( 1山东农业大学生命科学学院,泰安 271018; 2山东农业大学农业微生物重点实验室,泰安 271018;
3栖霞市农业局,烟台 265300)
摘 要: 利用梯度稀释和对峙试验的方法, 从向日葵根际土壤筛选到 18株对向日葵菌核病病原菌 核盘菌 ( Sclerotinia
sclerotiorum )有拮抗效果的细菌, 其中 1株具有较强的拮抗效果, 命名为 XRK4。经过形态观察及 16S rDNA序列分析,将 XRK4
鉴定为地衣芽孢杆菌 (B acillu s licheniform is)。研究表明 XRK4具有 1, 31, 4葡聚糖酶活性。设计引物以 XRK4的基因组
DNA为模板扩增得到长度为 732 bp的 1, 31, 4葡聚糖酶的完整基因, 其开放阅读框架编码 243个氨基酸。XRK4可能因产
生葡聚糖酶, 降解病原菌细胞壁而具有拮抗活性。
关键词: 向日葵根际 拮抗细菌 核盘菌 1, 31, 4葡聚糖酶
Screening and Identification of Antagonistic Bacteria from
Sunflower Rhizosphere and Prelim inary Study on
the AntagonisticM echanism
H ou Q ihu i
1
D ing Yanqin
1
Du B ingha i
1, 2
J in Fengli
1, 2 Lu X iaom eng 1
Sun Zhenxin
1
Zhou Ruijun
3
Yao L iangtong
1
(
1
College of L ife Science, Shandong Agricultural University, Tai!an 271018; 2Key Laboratory for AgricultureM icrob io logy,
Shandong Agricultural University, T ai!an 271018; 3Agricultural Bureau of Q ix ia, Yantai 265300)
Abstrac:t E igh teen an tagon istic bacte ria w ere screened from sunflow er rh izosphe re, w hich is resistant to Sclero tinia sclerotio
rum. One of the iso lated strains nam ed as XRK4 w as identified as Bacillus licheniform is based on them orpho log ic characte ristics and
phy logene tic ana lys is of 16S rDNA. The resu lts show ed that XRK4 has1, 31, 4g lucanase activ ity. The open read ing fram e o f1,
31, 4g lucanase gene is 732 bp encod ing 243 am ino ac ids. XRK4 m ight have antagonistic activ ity based on its1, 31, 4g lucanase
gene.
Key words: Sunflow er rh izo sphere Antagon istic bacteria S clerotinia sclerotiorum 1, 31, 4g lucanase
收稿日期: 20100322
基金项目:山东省优秀中青年科研奖励基金 ( 2006BS06012 )
作者简介:侯启会,男,土家族,硕士,研究方向:微生物分子生物学; Em ai:l houq ihu i190@ 163. com
通讯作者:姚良同, Em ai:l ltyao@ sdau. edu. cn
菌核病是一种世界性普遍发生的真菌病害,也
是向日葵最重要的病害之一。据统计, 该病能危害
的寄主植物已达 450余种 [ 1 ] ,仅我国 20世纪 80年
代以来报道的新增寄主至少有 16种 [ 2 - 3 ]。向日葵
菌核病在我国东北三省、山西、内蒙古等地均有发
生 [ 4] ,引起向日葵菌核病的病原菌为核盘菌 ( Sclero
tinia sclero tiorum ) ,属子囊菌亚门核盘菌属。菌核病
当前主要用化学方法进行防治, 但此方法防治成本
高、易造成环境污染。A dams和 A yers认为,影响土
壤中核盘菌菌核存活的最重要因素是土壤微生物因
素, 利用某些生物因子防治菌核病值得深入研
2010年第 9期 侯启会等:向日葵菌核病根际拮抗菌的筛选与鉴定及其拮抗机理的初步研究
究 [ 5]。以植物根际促生菌 ( plant grow thpromot ing
rh izobacteria, PGPR )为主导的生物防治措施是一种
有效的方法。
PGPR指自由生活在土壤或附生于植物根际的
一类可直接或间接促进植物生长、增强植物对逆境
胁迫抵抗力的微生物 [ 6]。 PGPR对植物的生防作用
主要表现在防病和促进生长两个方面, 对病害的防
治机制包括拮抗、寄生、竞争、捕食等多种方式。其
中,促生菌产生的拮抗物质主要有抗生素、细胞壁降
解酶类、细菌素和其它抗菌蛋白及挥发性抗菌
物质 [ 7]。
已有的报道表明, 木霉 ( Trichoderma spp. ) [ 8 ]、
粘帚霉 ( G lioclaclium ssp. ) [ 9]等是具有一定应用潜
力的菌核寄生菌。利用重寄生的菌核寄生菌盾霉菌
(Coniothyrium m initans)
[ 3]、枯草芽孢杆菌 ( Bacillus
subtilis)
[ 10 ]在目前的室内和小区试验中研究较多,
其它关于向日葵菌核病的生物防治报道较少。本研
究从向日葵根际土壤筛选到 1株对向日葵菌核病有
较强抑菌活性的细菌 XRK4。根据菌株 XRK4的培
养特征以及其 16S rDNA序列, 将其鉴定为 Bacillus
licheniform is, 并对其抗性机理进行了初步研究。
1 材料与方法
11 菌株和载体
试验所用的宿主菌 E scherichia coli DH5由本
实验室保存,测序载体 pMD18T Vector( Ampr )购买
于 TaKaR a公司。供试病原菌: 向日葵菌核病病原
菌 核盘菌 ( S clerotinia sclerotiorum )由本实验室
保存。土壤样品:从内蒙古采集的 6个菌核病向日
葵根际土样。
12 培养基及主要试剂
培养基:对峙试验用 PDA培养基, 细菌培养用
LB培养基。
试剂: 分子生物学试剂和 3S柱离心式琼脂糖
DNA小量快速纯化试剂盒 ( 3S Sp in A garose Gel
DNA purification k it)购于上海申能博彩生物科技有
限公司。
13 拮抗菌的分离与筛选
分离物的获得: 采用梯度稀释法进行拮抗菌的
分离。采用平板对峙法筛选拮抗菌。将 PDA培养
基倒平板,用接种锄将活化好的病原真菌切成边长
为 1 cm的正方形状, 置于平板中央, 于 28∀ 培养
2- 3 d,待病原真菌长到直径为 2 cm 时, 用接种环
挑取分离物,从靠近病原真菌的一侧沿与其生长方
向相交的方向划线接种,每个培养皿接种 6- 8个试
验菌,于 28∀ 培养 24- 48 h, 根据有无抑菌带及抑
菌带的大小判断其拮抗效果。
14 XRK4的鉴定
形态特征参阅文献 [ 11]。
15 引物
本试验扩增 16S rDNA序列用引物 27F ( 5!
GAGAGTTTGATCCTGGCTCAG3!)和 1495R ( 5!
CTACGGCTACCTTGTTACGA3!)。扩 增 1, 3
1, 4葡聚糖酶基因用 2对引物为 PJTM 3( 5!CCG
GATTATGGCAAAAAGC3!) , PJTM 4 ( 5!GAGC
CAGTCATCGACACCT3!) 和 PJTM 5 ( 5!CCAT
GTCTTACCGTGTAAAACGAGTG3!), PJTM 6 ( 5!GGCT
TATCTTTTTGTGTAAAACGAGTG3!)。
16 PCR扩增 16S rDNA
以细菌总 DNA为模板, 27F和 1495R作引物扩
增 16S rDNA 序列。 PCR 反应程序: 95∀ 5 m in,
94∀ 1 m in, 56∀ 1 m in, 72∀ 15 m in, 30个循环,
72∀ 延伸 10 m in。
用 3S柱离心式琼脂糖 DNA小量快速纯化试剂
盒 ( 3S Sp in Agarose Gel DNA purif ication k it )纯化
PCR产物。
17 1, 31, 4葡聚糖酶基因的克隆
用 DNAMAN软件分析已报道的注册号分别
为 AY 225317, AY 365256, AF546871, X57279,
AY 383603, AY160109的 1, 31, 4葡聚糖酶基
因 [ 12 ] , 根据该基因保守区域设计引物 PJTM 3和
PJTM 4, PCR扩增 XRK4 1, 31, 4葡聚糖酶基
因保守区域。分析所得序列, 设计特异引物
PJTM 5和 PJTM 6, PCR扩增 XRK4的 1, 31, 4
葡聚糖酶基因完整开放阅读框架。
18 序列测定
181 DNA序列测定 将经纯化的 PCR产物与
pMD18T载体连接,转化 E. coli DH5感受态细胞,
采用蓝白斑筛选法和菌落 PCR的方法筛选重组子,
选取阳性重组子送上海生工生物工程技术服务有限
公司进行测序。
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生物技术通报 B iotechnology Bulletin 2010年第 9期
182 基因序列初步分析 本试验所得 16S rDNA
的 GenBank注册号为 GQ463619, 1, 31, 4葡聚糖
酶的 GenBank注册号为 GQ901889。对所得序列用
BLAST在线分析, 用 MEGA 4. 0软件的 N eighbor
jioning算法构建系统发育进化树。
19 1, 31, 4葡聚糖酶活性检测
将 XRK4点种在含有 02%地衣多糖的 LB平
板上, 于 37∀ 培养 24 h后,用 01%刚果红液染色 5
m in,倒去染色液并用清水冲洗,观察是否出现透明
水解圈。
2 结果与分析
21 拮抗菌的筛选
从 6个向日葵根际土样中得到 640个细菌分离
物,经过初筛、复筛, 获得 1株具有较好拮抗效果的
细菌菌株, 命名为 XRK4, 其抑菌圈直径约为 10
mm, 经多次试验验证其抑菌效果较为稳定 (图 1)。
本试验中正常生长的病原菌菌丝细长、表面光滑、可
见清晰的分支结构 (图 2)。拮抗菌对病原菌菌丝的
作用表现为细胞壁溶解、菌丝畸形、断裂、呈无规则
结构 (图 3)。
图 1 XRK4对核盘菌的拮抗作用
22 拮抗菌的鉴定
221 形态特征 XRK4的菌体大小为 ( 08 -
09) m # ( 18- 35) m, G+ ,细胞形态呈杆状,在
LB培养基上培养 24 h后的菌落为扁平、边缘不整
齐、白色、表面粗糙皱褶。
222 16S rDNA序列分析 用引物 27F和 1495R
PCR扩增 XRK4的 16S rDNA序列, PCR产物经 1%
琼脂糖凝胶电泳,凝胶成像如图 5所示。B last分析
表明, XRK4 16S rDNA与已报道的 B. licheniform is
C ICC10335( GQ375244)的 16S rDNA相似性最高,
达到了 98%。将 XRK4的 16S rDNA与芽孢杆菌属
的多个不同种构建系统发育树 (图 4) , 分析表明,
XRK 4与 B . licheniform is CICC10335处于最小的分
支。结合其形态特征, 将 XRK4鉴定为 B. lichenifor
m is。
图 2 正常核盘菌菌丝
图 3 XRK4作用后核盘菌菌丝
23 1, 31, 4葡聚糖酶活性检测
将 XRK4点种在含有地衣多糖的 LB平板上,
培养 24 h后用刚果红溶液染色、清水冲洗。因刚果
红能与地衣多糖反应呈现红色, 如果 XRK4能产生
1, 31, 4葡聚糖酶,则能分解其周围的地衣多糖,
出现透明水解圈,而背景被染成红色。试验显示,刚
果红染色、冲洗后菌株周围均能出现透明水解圈,结
果见图 6,说明 XRK4能产生 1, 31, 4葡聚糖酶而
分解地衣多糖。
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2010年第 9期 侯启会等:向日葵菌核病根际拮抗菌的筛选与鉴定及其拮抗机理的初步研究
图 4 基于 16S rDNA序列的系统发育树
M. DL2000 Maker; 1. XRK4 16S rDNA
图 5 16S rDNA电泳结果
图 6 XRK4的 1, 31, 4葡聚糖酶活性检测
24 葡聚糖酶基因的克隆
241 保守区域的克隆 以基因组 DNA为模板进
行 PCR扩增, PCR产物经 1%琼脂糖凝胶电泳检测
显示, 在约 580 bp处有目的条带,如图 7A所示。
242 完整 ORF 的克隆 以设计的特异引物
PJTM 5和 PJTM 6进行 PCR扩增, PCR产物 1%琼脂
糖凝胶电泳检测显示,最终结果与预期的大小一致,
PCR产物 1%琼脂糖凝胶电泳如图 7B所示。
A. XRK4 1, 31, 4葡聚糖酶保守基因; B. XRK4 1, 3
1, 4葡聚糖酶基因开放阅读框; M. DL2000m arker
图 7 XRK4 1, 31, 4葡聚糖酶基因电泳结果
25 葡聚糖酶基因的分析
251 基因序列的初步分析 从 XRK4中克隆到
基因的开放阅读框架长为 732 bp, 编码 243个氨基
酸。 B last分析表明,此基因与已报道的多个 1, 3
1, 4葡聚糖酶基因具有较高的相似性, 其中与 1,
31, 4葡聚糖酶 bg lA ( AY365256)基因的相似性最
高, 达到了 99%。
252 基因的活性位点分析 将从 XRK4中克隆
到的 1, 31, 4葡聚糖酶基因的氨基酸序列与已知
的芽孢杆菌不同种的 1, 31, 4葡聚糖酶基因的氨
基酸序列在 NCB I中进行 conserved domains分析,所
得葡聚糖酶基因具有高度保守的 1, 31, 4g lu
canase的色氨酸, 谷氨酸, 天冬氨酸, 谷氨酰胺活性
位点,如图 8所示。
141
生物技术通报 B iotechnology Bulletin 2010年第 9期
A. B acil lus lich en iform is; B. Isolate XRK4; C. Bac illu s ma ceran s; D. S inorhizobium m eliloti; E. C lostrid ium therm ocellum;
F. Rum inococcus f lav efa cien s
图 8 1, 31, 4葡聚糖酶基因活性位点分析
3 讨论
本试验从向日葵根际土壤筛选到 B. lichenifor
m is XRK4, 其对向日葵菌核病具有较强拮抗作用。
该菌株能够产生 1, 31, 4葡聚糖酶, 具有 1, 3
1, 4葡聚糖酶 bg lA基因,目前尚未发现 B. lichenifor
m is对向日葵菌核病的防治作用的相关报道。本试
验中拮抗菌对病原菌菌丝的作用表现为细胞壁溶
解,菌丝畸形、断裂, 呈无规则结构, 与姚乌兰等 [ 13]
报道的 Paenibacillus polymyxaWY110产生的 1, 3
1, 4葡聚糖酶具有抗稻瘟病菌活性相似。 1, 31,
4葡聚糖酶基因的序列分析表明, 该基因与已报道
的 Bacillus lichen iform is的 1, 31, 4葡聚糖酶 bg lA
(AY365256)基因的相似性最高, 达到了 99%。且
氨基酸序列分析表明, 在该基因的保守区域内具有
必须的活性位点,因此,推测 XRK4产生的 1, 31,
4葡聚糖酶在其抗真菌活性中起重要作用。
由于生防菌的使用效果易受环境的影响, 在实
际生产中生防效果往往不够理想。而抗菌蛋白能够
在体外杀死或抑制病原菌, 如果能分离出抗菌蛋白
及其编码基因,用基因工程的方法进行作物抗病育
种、抗病性转基因动植物研究以及新型生物农药的
开发将具有深远的意义。
参 考 文 献
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(下转第 153页 )
142
2010年第 9期 帖卫芳等:甘草内生真菌的分离及鉴定
可以得出结论: 甘草内生白色真菌属于 Fusarium
属;甘草褐色真菌属于 G ibberella属。内生菌和寄主
之间存在着代谢相关的基因信号交流, 这对于植物
的生长与发育关系十分密切 [ 5, 9 ] , 我们将在现有工
作的基础上做进一步研究。且内生真菌资源的有效
利用对于植物资源的保护有重要的意义, 需要我们
更加深入的研究。
致谢: 本研究在获得甘草材料的过程中得到了新疆农科
院微生物研究所杨新平先生的帮助,在此表示诚挚的感谢。
参 考 文 献
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