全 文 ：福建农林大学学报(自然科学版) 第 36卷 第 4期
JournalofFujianAgricultureandForestryUniversity(NaturalScienceEdition) 2007年 7月
收稿日期:2006-09-19　　修回日期:2007-04-03
基金项目:国家自然科学基金资助项目(30370968和 30671463).
作者简介:洪鹏翔(1980-),男.研究方向:植物病害生物防治.
＊通讯作者:胡方平 ,男 ,博士生导师.研究方向:细菌分类和鉴定 ,植物病害生物防治.Email:Huf@fjau.edu.cn.
4种茄科作物内生细菌的分离及拮抗菌的筛选
洪鹏翔 1 , 邱思鑫 1, 2 , 陈　航 1 , 赵秀丹 1 , 胡方平1＊
(1.福建农林大学生物农药与化学生物学教育部重点实验室 , 福建 福州 350002;
2.福建省农科院蔬菜研究中心 ,福建 福州 350013)
摘要:番茄 、茄子 、烟草和辣椒健康植株内生细菌的分离及拮抗菌的筛选结果表明 , 植物的不同种 、品种及植物的不同部位 ,
内生细菌数量有所不同.不同作物每克鲜重平均内生细菌数量为 1180-11160 cfu;各作物植株不同部位均以果中内生细菌
的数量最少 , 根和茎中的内生菌数量较多.拮抗测定表明 ,各植物体内均存在对番茄青枯病菌和黄瓜枯萎病菌具有拮抗作
用的内生细菌 , 对番茄青枯病菌具有拮抗作用的植物内生细菌占总数的 16.21%, 而对黄瓜枯萎病菌具有拮抗作用的内生
细菌占总数的 28.53%.从拮抗菌株中筛选出 3株对多种植物病原真菌有较好拮抗作用的菌株 ,对黄瓜枯萎病有 20.83%-
79.17%的防病效果 , 此 3菌株对水稻白叶枯病菌和番茄青枯病菌也有一定拮抗作用 ,内生性测定表明 , 3菌株均能进入宿
主植物番茄和茄子体内 ,经初步鉴定 3菌株均为芽孢杆菌(Bacilussp.).
关键词:内生细菌;拮抗细菌;分离;筛选
中图分类号:Q935;S476 文献标识码:A 文章编号:1671-5470(2007)04-0347-05
IsolationandscreeningofendophyticantagonisticbacteriafromfourspeciesofSolanaceae
HONGPeng-xiang1 , QIUSi-xin1, 2 , CHENHang1 , ZHAOXiu-dan1 , HUFang-ping1
(1.KeyLaboratoryofBiopesticideandChemicalBiology, MinistryofEducation, FujianAgricultureandForestryUniversity, Fuzhou,
Fujian350002, China;2.VegetableCentre, FujianAcademyofAgriculturalSciences, Fuzhou, Fujian350013, China)
Abstract:Theresultsofbacterialisolationshowedthattheendophyticbacteriacouldbeisolatedfromtheinsideofroots, stems,
leaves, andfruitsoftomato, tobacco, eggplantandcapsicumplants.Butthenumbersofendophyticbacteriaisolatedfromtheplants
weredifferentaccordingtothepartsoftheplants.Theaverageamountoftheendophyticbacteriaindifferentpartsoftheplantswere
1180-11160 cfu· g-1(freshweight).Thereweremoreendophyticbacteriaintherootsandstemsthantheleavesandfruits.Of
523bacterialisolates, 16.21% and28.53% hadinhibitoryactivitytoRalstoniasolanacearumandFusariumoxysporumf.sp.cu-
cumberinumrespectivelyinvitro.Amongtheantagonisticbacteria, therewerethreestrainsgiving20.83%-79.17% controleffica-
ciestocucumberfusariumwilt30 daysafterinoculatingthepathogen.Furthertestsshowedthethreestrainscouldliveinsidethe
plantsoftomatoandeggplant.TheywereidentifiedasBacilussp.
Keywords:endophyticbacteria;antagonisticbacteria;isolation;screening
自 1926年 Peroti提出植物组织内存在非致病细菌的理论至今已有近 80年的历史 ,但直到近 20多年
来由于发现植物内生细菌具有促生 、防病 、内生固氮等有益生物学作用后 ,人们才真正开始重视[ 1-3] .近年
来的研究表明 ,植物内生细菌也是良好的外源基因受体菌 ,为抗病 、杀虫及固氮等植物外源基因在植物体
内的表达与发挥功能作用提供了一种新的途径 [ 2-4] .另外 ,植物内生细菌在植株体内 ,不易受外界环境的
影响 ,可以在植株体内繁殖 、传导 ,能较长期地发挥生物学作用.因而 ,植物内生细菌具有广泛的研究和应
用开发价值 ,现已成为植物病虫害生物防治的研究热点.现今许多研究已证明 ,健康植物体内存在大量的
内生菌 ,棉花 、马铃薯 、水稻 、玉米 、辣椒等多种作物体内都已分离筛选到具有防病或诱导抗病作用的内生
细菌[ 1-5] ,它们是植物病害生物防治的潜在资源菌.本文针对目前生产上的主要植物病原菌 ,拟从茄科植
物体内分离筛选内生防病细菌.
1　材料与方法
1.1　供试作物与病原菌
茄子 、番茄和辣椒采自福州郊区建新蔬菜基地 ,烟草采自罗源烟区 ,以上植物均为健康植株.番茄青枯
DOI :10.13323/j.cnki.j.fafu(nat.sci.).2007.04.009
病菌(Ralstoniasolanacearum)、水稻白叶枯病菌 (Xanthomonasoryzaepv.oryzae)和黄瓜枯萎病菌
(Fusariumoxysporumf.sp.cucumberinum)菌株由本实验室保存.
1.2　培养基
细菌分离用 TSA培养基 ,斜面和平板培养用 NA培养基 ,液体培养用 NB培养基;真菌培养及拮抗测
定用 PDA培养基 ,其中含有 5 g·L-1蛋白胨.
1.3　内生细菌分离
茄子 、番茄 、辣椒 、烟草先用水冲洗干净 ,然后随机称取根 、茎 、叶 、果各 5 g,先用体积分数为 70%酒精
表面消毒 5min并用无菌水冲洗 3次 ,之后用 1 g·L-1升汞表面消毒 5-10 min(叶片 5min,根 、茎 、果 10
min)并用无菌水冲洗 3次 ,样品晾干后转入无菌研钵中加 10mL无菌水研磨成浆 ,静置 15min后 ,各取 50
μL涂平板 ,每处理重复 3次 , 27 ℃黑暗培养 48-72 h,计算菌落数.根据菌落形态 、颜色等分别挑取不同
类别单菌落 ,按常规方法纯化后保存 ,供测试鉴定.分离时若消毒后组织表面在分离培养基上印迹培养 48
h不长菌或将组织消毒后最后一次冲洗的无菌水涂于分离培养基上培养 48 h不长菌 ,均确定为表面消毒
完全.
1.4　室内拮抗病原菌测定
1.4.1　对细菌的拮抗测定　在 100 mL熔解后冷却至 45 ℃的 NA培养基中加入 1 mL病原细菌菌液(108
cfu· mL-1),混匀后制成含菌平板 ,然后在每个平板上均匀接种 5个分离菌株进行拮抗细菌的测定.
1.4.2　对真菌的拮抗测定　在 PDA平板中央接入直径为 5mm的枯萎病菌菌块 ,用对峙法每平板接种 3
个分离菌株进行拮抗菌的筛选 , 26 ℃下培养 48 h,观察有无抑菌带.或在 PDA平板中央接入拮抗细菌 ,然
后在平板边缘接入 6个直径为 5 mm的病菌菌块 , 26 ℃下培养 5 d后测量其抑菌圈大小.
1.5　对黄瓜枯萎病的防治
将黄瓜种子用拮抗菌株液(菌量为 108 cfu· mL-1)浸种 24 h后播于 160 mm×220 mm花盆中 (泥土
消毒),每盆播种 10-15粒种子 ,设清水和培养基浸种为对照(CK1 、CK2).每处理播种 12盆 ,待出苗长至
2片子叶展平后 ,每处理取 6盆 ,每盆再浇相应菌液 50 mL(菌量为 108 cfu· mL-1).待第 2片真叶出来后 ,
每盆留苗 5株 ,用伤根法接种病原菌 ,接种量为每株 2 mL孢子悬浮液 ,孢子悬浮液为 108 cfu· mL-1.分别
在接种病原菌后 20、30 d调查发病情况.
1.6　菌株的内生性测定
用逐步筛选法 ,筛选出在含 300×10-6 μg·mL-1 Rif.的 NA培养基平板上能稳定生长的菌株;用含有
相同浓度的 Rif.NB培养基培养 24 h后 ,采用浸种或真叶出来后浇灌土壤的方法接种 ,以清水处理为对
照.分别于不同时间取样分离 ,定量组织经 70%酒精和 1 g· L-1升汞表面消毒后 ,无菌水冲洗 3次 ,晾干
后转入无菌研钵中 ,加定量无菌水研磨成浆 ,静置 15 min,吸取适量液体涂于含 300×10-6 μg· mL-1 Rif.
的 NA平板 ,每处理重复 3次 , 28℃黑暗培养 48 h,计算菌落数 ,测定其定殖情况.分离时各处理组织经表
面消毒清洗后 ,于分离平板上进行表面印迹培养 , 48h长菌的相应分离处理为无效试验.
1.7　细菌鉴定
革兰氏染色 、芽孢染色 、鞭毛染色 、接触酶 、厌氧性等 ,参见东秀珠等 [ 6]的方法.
2　结果与分析
2.1　不同植物体内细菌的数量
从表 1可见 ,番茄 、茄子 、辣椒和烟草植株不同部位(根 、茎 、叶 、果)均存在大量的内生细菌 ,作物间每
克鲜重内生细菌的数量变化为 1180-11160 cfu.不同植物种类及品种体内的细菌数量存在差异 ,在所分
离的 4种作物的 7个品种中 ,以紫长茄体内细菌数量最大 ,厚皮番茄体内细菌数量最少;番茄 2个品种及
茄子 3个品种之间内生细菌数量均差异显著 ,其中大红番茄的内生细菌数量是厚皮番茄的 4.1倍 ,紫长茄
的内生细菌数量是圆茄的 2.0倍.从植株的不同部位来看 ,均以果中内生细菌数量最少 ,根和茎中内生细
菌数量相对较多.由此可见 ,内生细菌数量与不同植物及品种密切相关 ,植物不同部位其内生细菌数量也
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不同.多数植物根中分离的内生细菌数量较多 ,与前人研究[ 5]认为内生细菌主要从植物根部进入植物体
内相符.但大田作物受土壤 、水分以及施肥 、施药等农艺管理措施诸多因素的影响 ,其内生细菌数量也会有
所不同 ,因而其具体的数量关系有待进一步研究.
表 1　不同植物内生细菌的数量 1)
Table1　Populationofendophyticbacteriaindifferentplants ×103 cfu　
部位 番茄大红番茄 厚皮番茄
茄子
罗源长茄 圆茄 紫长茄 烟草
辣椒
(青皮尖椒)
根　 5.900 2.28 9.30 8.54 13.20 13.80 17.80
茎　 11.680 1.52 18.24 7.48 19.60 8.93 8.80
叶　 1.200 0.70 2.05 5.98 11.00 7.56 5.40
果　 0.520 0.20 0.12 0.10 0.92 / 0.24
平均 4.825 1.17 7.43 5.53 11.16 10.10 8.06
　　1)表中数据均以每克鲜重计.
2.2　不同作物来源菌株对黄瓜枯萎病菌和番茄青枯病菌的拮抗性
表 2　不同作物来源菌株对植物病原菌的拮抗菌株率
Table2　Thepercentageofinhibitoryendophyticbacteriatoplantpathogens
菌株
来源
测定菌
株数 病原菌
拮抗
菌数 拮抗菌株率 /%
番茄 271 黄瓜枯萎病菌 74 27.31
番茄青枯病菌 46 16.97
茄子 142 黄瓜枯萎病菌 43 30.28
番茄青枯病菌 22 15.49
烟草 59 黄瓜枯萎病菌 16 27.12
番茄青枯病菌 11 18.64
辣椒 51 黄瓜枯萎病菌 15 29.41
番茄青枯病菌 8 13.73
表 3　不同菌株对植物病原菌的拮抗作用 1)
Table3　Inhibitionactivityofendophyticbacteriatoplantpathogens
菌株
编号
抑菌圈直径 /mm
黄瓜枯萎病菌 水稻白叶枯病菌 番茄青枯病菌
ER17 25.0 23.0 -
TF1 22.5 8.0 -
TBS2 23.5 ＊ -
TBL4 23.2 ＊ -
CS30 24.5 ＊ 10.0
CS3 23.5 ＊ -
TL1 26.5 - -
EPL8 23.3 27.0 -
TS6 21.5 12.5 -
TL6 26.2 25.0 14.0
ER13 23.0 19.0 10.5
EL7 25.0 - -
EL1 25.5 13.3 -
TS10 23.0 8.5 15.5
ES4 24.3 25.2 13.7
EF1 25.0 19.0 -
ER40 26.0 25.5 14.0
EF9 24.0 26.5 14.2
　　1)“ -”表示无拮抗作用;“＊”表示未进行测定.
　　从表 2可见 ,各植物体内均存在对植物病原
真菌和细菌具有拮抗作用的内生细菌.作物内生
细菌对番茄青枯病菌具有拮抗作用的比例较低 ,
只有 13.73% -18.64%,平均为 16.21%;而对黄
瓜枯萎病菌具有拮抗作用的比例较高 , 在
27.12%-30.28%之间 ,平均为 28.53%.
2.3　内生细菌对植物病原菌的拮抗作用
从 532株分离自植物体内的细菌中筛选出
18株对黄瓜枯萎病菌有较好抑制作用的菌株(表
3),其中有 6株对植物病原细菌(番茄青枯与水
稻白叶枯病菌)和真菌(黄瓜枯萎病菌)均有拮抗
作用.从表 3可知 ,这些菌株对黄瓜枯萎病菌均有
较强的抑制作用 ,抑菌圈直径在 20 mm以上;待
测菌株中有 12株对水稻白叶枯病菌也有较好的
抑制作用 ,但不同菌株之间差异较大 ,抑菌圈直径
在 8.0-26.5 mm之间;有 7株对番茄青枯病菌也
有一定的抑制作用 ,但其抑制效果均较低 ,抑菌圈
直径为 10.0-15.5mm.
2.4　拮抗菌对黄瓜枯萎病的防治作用
选择对植物病原菌具有稳定拮抗作用的 3株
植物内生细菌进行黄瓜枯萎病的防治试验 ,结果
表明(表 4),在接种病原菌后第 20天 ,各处理均
不同程度地发病 ,生防菌菌液浸种及浸种加浇灌
处理都显示出一定的防病效果 , 防治效果为
25.00%-75.00%,其中浸种后在子叶期再浇灌
相应菌液一次的效果明显优于单独浸种处理.生
防菌处理对病害扩展具有抑制作用 ,至接种病菌
后第 30天 , TL6浸种 、TL6浸种加浇灌以及 ES4
浸种加浇灌共 3个处理的防病效果均达 70%以
上 ,而 EF9的 2个处理防病效果较差 ,不到 50%.
349　第 4期 洪鹏翔等:4种茄科作物内生细菌的分离及拮抗菌的筛选
表 4　不同拮抗菌株对黄瓜枯萎病的防治效果 1)
Table4　Controlresultofendophyticbacteriatofusariumwiltofcucumber
菌株 20d发病率 /% 防治效果 /%
30d
发病率 /% 防治效果 /%
TL6浸种 20.00 25.00 20.00 75.00
TL6浸种 +浇灌 10.00 62.50 16.67 79.17
EF9浸种 16.67 37.50 63.33 20.83
EF9浸种 +浇灌 13.33 50.00 43.33 45.83
ES4浸种 16.67 37.50 30.00 62.50
ES4浸种 +浇灌 6.67 75.00 16.67 79.17
CK2 30.00 / 83.33 /
CK1 26.67 / 80.00 /
　　1)CK1为清水对照 , CK2 为培养基对照.
2.5　不同菌株的内生定殖测定结果
表 5　茄子和番茄植株内生标记细菌分离结果 1)
Table5　ThenumberofRif.resistantendophyticbacteriaisolated
fromeggplantandtomato ×102 cfu· g-1　
处理
(菌株编号)
茄子
浸种 浇灌土壤
番茄
浸种 浇灌土壤
TL6 0.55 4.15 0.89 9.16
EF9 0.42 2.53 0.30 1.16
ES4 0.64 2.81 0.52 2.53
CK1 0.00 0.00 0.00 0.00
　　1)CK1 为清水对照;表中数据为浸种后 10d和浇灌土壤后 5d植物体
内的细菌数量.
　　用不同方法接种利福平拮抗菌株后 ,利用高
含量的利福平板进行组织分离.结果表明 ,对照组
织中未分离到细菌 ,接种组织内可分离到大量出
发菌.这证明接种的 TL6、EF9、ES4这 3个菌株均
能进入辣椒和番茄体内 ,但各菌株在植物体内的
定殖数量(能力)有差异 ,以菌株 TL6的定殖能力
较强 ,在茄子和番茄上都有较强的内生定殖能力
(表 5),而从茄子体内分离的 EF9菌株不论在茄
子和番茄上的内生定殖能力都较弱.
2.6　拮抗内生细菌的鉴定
形态观察和常规染色表明 ,上述具有拮抗和防病作用的 3株内生细菌菌体均为杆状.菌落乳白色 、圆
形 、中央隆起;格兰氏染色阳性 ,周生鞭毛;在菌体中央形成芽孢 ,芽孢椭圆形 ,兼性厌氧 ,接触酶阳性等.参
照东秀珠等 [ 6]描述 ,初步确定均为芽孢杆菌(Bacilussp.);TL6菌株进一步用 16SrDNA序列比较分析表
明是枯草芽孢杆菌(B.subtilis)的近缘种(另文发表).
3　讨论
在测定一种植物体内的微生物种类时 ,由于分离培养基 、宿主植物生长环境以及植物组织处理方式的
不同 ,得出的结果可能不同 ,这一点与植物根际菌的种群测定结果一样[ 7] .目前在植物内生细菌的分离上
尚无统一的定量分析方法 [ 8] .分离物表面消毒主要采用次氯酸钠 、漂白粉 、乙醇 、H2O2、HgCl2、氯胺 T等 ,
或综合应用其中的几种共同处理.任何一种表面消毒的方法都不可能把表生菌 100%杀死 ,否则有可能把
组织内的菌杀死 ,因此表面消毒的方法直接关系到菌量分离统计结果.本研究为了保证分离出的细菌是植
物组织内的细菌 ,采用酒精和升汞对表面严格消毒 ,碾碎植物组织 ,取其汁液在 TSA培养基上涂平板 ,对 4
种茄科植物根 、茎 、叶和果内的内生细菌进行了初步定量分离 ,其结果也许不能准确反应植物组织内生细
菌的实际种群 ,但与大多数前人 [ 9]报道的植物内生细菌数量(一般在 103 -105 cfu·g-1之间)基本吻合.说
明该方法在了解植物各部位内生细菌数量趋势方面有一定的价值 ,但准确的定量分析方法尚有待进一步
研究.
植物病害生物防治研究已有很长的历史 ,利用拮抗微生物防治植物病害也有一些成功的例子 ,如
1926年 Sanford报道土壤中某些拮抗性微生物对于土传病原菌具有抑制性[ 10] ,但分离自土壤和根际土壤
的拮抗微生物由于受到环境条件的影响 ,防病效果往往不够稳定.植物内生细菌由于可在植物体内定殖 ,
处于一个相对稳定的生态环境中 ,受到外部环境条件的影响相对较小 ,因而可能会比外部环境中的微生物
350 福建农林大学学报(自然科学版) 第 36卷　
具有更好的防病效果.目前已从不同植物中分离到许多对植物病害具有防病效果的内生细菌.本研究也从
4种茄科植物体内分离到多株对黄瓜枯萎病菌 、番茄青枯病菌及水稻白叶枯病菌具有拮抗作用的细菌 ,其
中分离自番茄的 TL6菌株及分离自茄子的 EF9和 ES4在室内对黄瓜枯萎病具有一定防治效果.但目前关
于植物内生细菌的防病试验主要还集中在室内 ,能否应用于生产实践有效地控制植物病害 ,还有待于进一
步研究.
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(责任编辑:陈幼玉)　　
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