全 文 ：园 　艺 　学 　报 　2008, 35 (11) : 1647 - 1652
Acta Horticulturae Sinica
收稿日期 : 2008 - 05 - 12; 修回日期 : 2008 - 07 - 21
基金项目 : 引进国际先进林业科学技术创新项目 (2006242C08) ; 国家 ‘十一五’科技支撑计划项目 (2006BAD01A18)3 通讯作者 Author for correspondence ( E2mail: zhu2222@1261com)
大花惠兰根腐病拮抗细菌 ZL725菌株的筛选与鉴定
李潞滨 1 , 李术娜 2 , 李　佳 2 , 王　倩 2 , 朱宝成 23 , 彭镇华 13
(1 中国林业科学研究院林业研究所 , 国家林业局林木培育重点实验室 , 北京 100091; 2 河北农业大学生命科学学院 ,
河北保定 071001)
摘 　要 : 从各地大花惠兰种植地采集的土样中共分离到细菌 519株 , 初筛出对大花惠兰根腐病病原菌
尖孢镰刀菌 ( Fusarium oxysporium ) 具有拮抗活性的细菌菌株 26株 , 经过复筛 , 选出 1株具有较高拮抗活
性的菌株 ZL725。通过 16S rDNA序列相似性分析 , 菌株 ZL725与解淀粉芽孢杆菌标准菌株 (NBRC 15535)
的 16S rDNA序列相似度达 100% , 通过比较菌株 ZL725和模式菌株的形态特征和生理生化特性 , 最终将菌
株 ZL725鉴定为解淀粉芽孢杆菌 (B acillus am yloliquefaciens)。
关键词 : 大花惠兰 ; 根腐病 ; 尖孢镰刀菌 ; 拮抗细菌 ; 筛选 ; 鉴定 ; 解淀粉芽孢杆菌
中图分类号 : S 682131　　文献标识码 : A　　文章编号 : 05132353X (2008) 1121647206
Isola tion and Iden tif ica tion of the An tagon istic Bacter ia l Stra in ZL725
Aga in st Root Rot D isea se of C ym bidiu m hybrid iu m
L ILu2bin1 , L I Shu2na2 , L I J ia2 , WANG Q ian2 , ZHU Bao2cheng23 , and PENG Zhen2hua13
(1 Research Institu te of Forestry, Chinese A cadem y of Forestry, Key Laboratory of Tree B reeding and Cultiva tion, S ta te Forestry A d2
m inistra tion, B eijing 100091, Ch ina; 2 College of L ife Sciences, A gricu ltura l U niversity of Hebei, B aod ing, Hebei 071001, China)
Abstract: In order to obtain antagonistic strain which has the potential app lication possibility on biocon2
trol of root rot disease of Cym bid ium hybrid ium , five hundreds and nineteen bacterial strains were isolated from
the soil samp les and there were twenty2six bacterial strains showed antagonistic activity to Fusarium oxyspori2
um. A strain with the highest antagonistic activity, ZL725, was obtained during the secondary screening. 16S
rDNA sequences analysis of strain ZL725 revealed that it had 100% sim ilarity to that of B acillus am y loliquefa2
ciens NBRC 15535. After the morphological, physiological and biochem ical characteristics of this strain were
further studied and compared with that of the type strain B acillus am y loliquefaciens NBRC 15535, strain ZL725
was finally identified as B acillus am yloliquefaciens.
Key words: Cym bid ium hybrid ium ; root rot; Fusarium oxysporium ; antagonistic bacteria; screening;
identification; B acillus am y loliquefaciens
大花蕙兰 (Cym bid ium hybrid ium ) 是经杂交改良的一类大型兰花 , 花大而奇特 , 花色艳丽多变 ,
花期久 , 市场份额和潜力越来越大 (谭文澄和戴策刚 , 1991; 吴应祥 , 2001; 殷丽青 等 , 2006)。大
花蕙兰根腐病 ( root rot) 是大花蕙兰毁灭性病害之一 , 整个生育期都容易感染 , 给栽培造成极大困
难 (吴连星 , 2001)。李艳梅等 (2007) 对唐山地区采集的 50种大花蕙兰病株进行了分离纯化与鉴
定 , 确定其根腐病的主要致病菌为镰孢菌属 ( Fusa rium ) 和枝顶孢菌属 (A crochaetium ) 真菌 , 优势
菌群为镰孢菌属 ; 分离物经致病性测定和复合接种试验发现 , 茄病镰刀菌 ( Fusarium solan i) 和尖孢
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镰刀菌 ( Fusarium oxysporium ) 致病性最强 ; 同时证实大花蕙兰根腐病是以茄病镰刀菌和尖孢镰刀菌
为主要病原菌 , 由木贼镰刀菌、串珠镰孢中间变种和枝顶孢霉复合侵染导致的一种病害。
大花蕙兰根腐病主要引起植株根部腐烂 , 导致根部死亡 , 一般采用喷淋施药的方法 , 但对该病的
防效欠佳 , 而药物灌根法又对土壤环境污染严重。多年研究表明 , 利用活体生防菌可以有效地防治植
物根部病害 , 有很多优良的菌株已经应用于生产实践 , 例如由美国 Gustafson公司和 M icrobioL td公司
开发的 GBO3和 MB I600菌株 , 根部施用或拌种可防治 Fusarium、A sperg illus、A lternaria和 R hizocton ia
引起的豆类、麦类、棉花和花生根部病害 , 同时生防菌的施用亦对环境无害 , 因而日益受到关注
(于淑池 , 2007)。本实验室筛选得到了多株对大花惠兰根腐病病原菌尖孢镰刀菌具有较强拮抗作用
的细菌 , 并对其中活性相对较高的菌株 ZL725进行了菌种鉴定 , 为今后有效利用该菌防治大花惠兰根
腐病奠定了基础。
1　材料与方法
111　试验菌株及其培养基
病原菌为分离自大花惠兰根部的尖孢镰刀菌 ( Fusarium oxysporium ) , 由本实验室保存。
NA、NB、LB和 PDA培养基的配制详见 《微生物学实验技术 》 (程丽娟和薛泉宏 , 2000)。生理
生化鉴定培养基见 《常见细菌系统鉴定手册 》 (东秀珠和蔡妙英 , 2001)。
112　菌株分离和筛选
11211　菌株的分离 　
用接种铲取盆栽大花惠兰盆土和地栽大花惠兰 10～15 cm深处土样。共采集了四川、北京、河北
等地区的 12份土样。风干后保存于纸袋中。记录采样时间、地点等信息。
称取 1 g土样放入装有 10 mL无菌水的试管中 , 混匀后于 80 ℃水浴 20 m in, 取 1 mL至另一只试
管中 , 依次稀释得到各浓度的土壤稀释液。分别取 10 - 4和 10 - 5的稀释液 011 mL涂布 NA培养基平板 ,
然后倒置于 30 ℃培养箱中培养 24 h。挑取不同形态的单菌落转接至 NA培养基斜面上 , 30 ℃恒温培
养 24 h, 置于 4 ℃冰箱保存备用 (程丽娟和薛泉宏 , 2000)。所挑取的菌落同时在 NA培养基平板上
划线检查纯度。
将尖孢镰刀菌接种于 PDA斜面 , 25 ℃培养 7～10 d, 加入灭菌无离子水 , 轻轻刮下孢子 , 充分
振荡混匀 , 用无菌脱脂棉过滤 , 稀释制成约含 1 ×107个 ·mL - 1孢子的悬浮液。取 5 mL孢子悬液加入
100 mL 45 ℃左右的 PDA培养基中 , 摇匀 , 倒入培养皿中 , 制成含尖孢镰刀菌的琼脂平板。
11212　尖孢镰刀菌拮抗细菌的初筛和复筛 　
采用管碟法 , 把分离到的细菌点接到含尖孢镰刀菌的平板上 , 24 ℃培养 48 h后观察结果。
将初筛所得的菌株转接 NA斜面 , 活化 24 h, 接种于装有 50 mL NB培养液的 250 mL三角瓶中 ,
30 ℃、180 r·m in - 1培养 48 h。培养液离心 (10 000 r·m in - 1 , 4 ℃) , 上清液用 012μm微孔滤膜过
滤。在含尖孢镰刀菌的 PDA平板上用直径 3 mm的打孔器选择合适的间距打孔 , 并取 80μL已过滤除
菌的拮抗菌株发酵液注入小孔内 , 静置 30 m in后 , 于 25 ℃恒温箱培养 3 d, 测量抑菌圈直径并记录
试验结果。
113　拮抗细菌的鉴定
11311　DNA提取和 16S rDNA基因扩增 　
提取细菌总 DNA的方法见参考文献 (W ilson, 1987; Kirkpatrick et al. , 1998)。取对数生长期的
发酵液 115 mL, 8 000 r·m in - 1离心取菌体 , 重复 2～3次。重新溶于 400μL TE缓冲液 ( Tris2HCl 10
mmol·L - 1 , pH 810; EDTA 1 mmol·L - 1 , pH 810) , 加入 50 mg·mL - 1的溶菌酶溶液 20μL, 37 ℃
温育过夜。加入 400μL SDS提取缓冲液 ( Tris2HCl 100 mmol·L - 1 , pH 810; EDTA 20 mmol·L - 1 ,
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　11期 李潞滨等 : 大花惠兰根腐病拮抗细菌 ZL725菌株的筛选与鉴定 　
SDS 10% , NaCl 114 mol·L - 1 ) , 65 ℃温育 45 m in。冷却至室温 , 加入 400μL的 Tris饱和酚 ∶氯仿
(25∶24) , 混匀后 12 000 r·m in - 1离心 10 m in。上清液用 1倍体积的氯仿抽提 , 混匀后 12 000 r·
m in - 1离心 10 m in, 上清液用 1倍体积冰冷的异丙醇沉淀 DNA , - 20 ℃静置 30 m in, 室温干燥后溶于
200μL TE缓冲液 , 加入 20μL RNAase (1 mg·mL - 1 ) , 37 ℃温育 30 m in。抽提纯化 , 室温干燥后溶
于 30μL TE缓冲液 , 1%琼脂糖电泳检测 DNA质量。根据 OD260测定 DNA纯度。
引物为通用引物 (Lane, 1991)。正向引物为 27F: 5′2AGAGTTTGATCCTGGCTCAG23′, 反向引物
为 1495R: 5′2CTACGGCTACCTTGTTACGA23′。分别位于 16S rDNA的 8～27和 1 495～1 514位的碱基
片段 (以 Escherich ia coli的 16S rDNA碱基位置为准 )。
PCR反应体系 : DNA (70 ng·μL - 1 ) 模板 2μL, dNTP M ixture (215 mmol·L - 1 ) 215μL, 27F
(20μmol·L - 1 ) 115 μL, 1495R ( 20 μmol·L - 1 ) 115 μL, 10 ×ExTaq Buffer (含 Mg2 + ) 5 μL,
ExTaq DNA聚合酶 012μL, 补足 ddH2 O到 50μL。
PCR条件 : 94 ℃预变性 3 m in; 然后 94 ℃变性 1 m in, 55 ℃退火 1 m in, 72 ℃延伸 3 m in, 共 30
个循环 ; 最后 72 ℃延伸 5 m in。PCR产物经试剂盒纯化后 , 送上海生工生物工程技术服务有限公司测
序。
将所测得的 16S rDNA序列用 BLAST软件与 GenBank数据库进行相似性分析 , 并与 GenBank中的
相近序列在 Clustal X (118) 程序包中进行多重序列匹配排列 (Multip le alignments) 分析 , 最后形成
一个多重序列匹配排列阵 , 其中形成的缺口用横杠 “ - ”填补 , 用 Neighbor2Joining法构建系统发育
树 ( Saitou & Nei, 1987)。
11312　形态鉴定及生理生化鉴定 　
细菌菌落形态观察 : 挑取少量 NA斜面上 37 ℃培养 24 h的菌株 ZL725于装有 10 mL无菌水的试
管中 , 充分混匀后取 1 mL到装有 9 mL的试管中 , 依次稀释得到各种浓度的稀释液。分别取 10 - 4和
10 - 5两个稀释梯度的稀释液 011 mL涂布 NA培养基平板 , 然后倒置于 30 ℃培养箱中培养 24 h观察菌
落形态特性。
菌体形态观察 : 挑取 NA斜面上 37 ℃培养 24 h的菌株 ZL725, 参照 《常见细菌系统鉴定手册 》
(东秀珠和蔡妙英 , 2001) 的方法进行革兰氏染色 , 显微镜下观察其菌体形态。
对菌株 ZL725分别进行厌氧生长、pH 517肉汤、V1P1测定、淀粉水解、硝酸盐还原、三糖铁、
柠檬酸盐、明胶液化、甲基红、牛奶石蕊、纤维素分解、酪氨酸水解、酪素水解、吲哚试验、苯丙氨
酸脱氨酶、丙二酸盐、耐盐性、糖、醇类发酵、生长温度、硫化氢产生等生理生化试验。
2　结果与分析
211　土样中拮抗细菌的分离筛选
挑取不同特征的单菌落 , 经纯化后共得到 519个菌株 , 其形态特征大都为灰白色 , 少数为黄色不
透明菌落 , 大小不等 , 扁平状 , 表面干燥有皱折 , 呈火山口状、放射状或不规则状 , 菌落边缘整齐。
将分离到的细菌菌株分别与尖孢镰刀菌进行生长对峙试验 , 从 519个菌株中初步筛选到具有拮抗
作用的菌株 26株。
对初筛的 26株菌株中活性较高的 10株进行复筛 , 其中抑菌圈直径大于 16 mm的 4株 , 10～16
mm的 2株 , 另外 4株没有表现活性 , 原因可能是发酵液浓度过低不能显示拮抗活性。其中 ZL725菌
株抑菌圈直径为 17 mm, 对尖孢镰刀菌的生长具有很强的抑制作用。
212　拮抗细菌 ZL725菌株的鉴定
21211　16S rDNA全序列分析 　
将拮抗细菌 ZL725菌株的 16S rDNA序列与数据库中已注册的 16S rDNA序列用 B last程序进行序
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列相似性比较分析。菌株 ZL725及与之同源性最高的 4株标准菌株的原序列列于图 1。取 GenBank中
与 ZL725菌株相似性较高的 9株标准菌株及一株外源菌株构建系统发育树 , 结果如表 1和图 2所示。
图 1　拮抗细菌 ZL725菌株与 4株标准菌株的 16S rD NA原序列比对
F ig. 1　16S rD NA sequences a lignm en t of an tagon istic stra in ZL725 and four rela ted type stra in s
表 1　拮抗细菌 ZL725菌株与几种标准菌株的相似性比较
Table 1　Com par ison of sim ilar ity between an tagon istic stra in ZL725 and severa l norm stra in s
序列号
Sequence No.
种名
Species name
菌种号
Strain No.
相似性 /%
Sim ilarity
AY603658 B acillus velezensis3 CR2502 99164
AB255669 解淀粉芽孢杆菌 B acillus am yloliquefaciens NBRC 15535 100
AB021198 花域芽孢杆菌 B acillus va llism ortis DSM 11031 99164
DQ993671 B acillus axarquiensis3 LMG 22476 99128
DQ993673 B acillus m alacitensis3 LMG 22477 99128
AB363735 漠海威芽胞杆菌 B acillus m ojavensis NBRC 15718 99135
AB271744 枯草芽胞杆菌 B acillus subtilis NBRC 13719 99164
AB363731 萎缩芽孢杆菌 B acillus atrophaeus NBRC 15539 99135
CP000002 地衣芽胞杆菌 B acillus licheniform is ATCC 14580 96182
AB267380 A lkalibacillus silvisoli3 HN 2 93170
　　注 : “3 ”所标的 4株菌株为 2005年新发现的种 , 其中文菌种名尚未在文献中出现过。
Note: Four bacterial strains marked with“3 ”were new species which found in 2005 and the Chinese names didnpit appear in literatures.
图 2　拮抗细菌 ZL725菌株的 16S rD NA序列系统发育树
F ig. 2　Phylogenetic tree of 16S rD NA sequence of an tagon istic stra in ZL725 and rela ted stra in s
0561
　11期 李潞滨等 : 大花惠兰根腐病拮抗细菌 ZL725菌株的筛选与鉴定 　
供试菌株 ZL725的 16S rDNA序列与构建系统发育树的芽孢杆菌属标准菌株同源相似度大部分在
99%以上 , 初步将此菌株归为芽胞杆菌属 , 同时其与解淀粉芽孢杆菌 (B acillus am yloliquefaciens) 标
准菌株 NBRC 15535的 16S rDNA序列同源相似性最高 , 达 100%。
21212　菌落及菌体形态 　
菌株 ZL725在 NA培养基平板上培养 24 h后的菌落形态呈近圆形 , 边缘不整齐且粘稠湿润 , 表面
不光滑 , 有皱褶 , 中间有火山口状隆起 , 白色不透明 , 不产生色素。
对菌株 ZL725的菌体进行革兰氏染色 , 在油镜下观察呈革兰氏阳性 , 菌体大小为 016～018μm ×
117～213μm, 长杆状 , 芽孢呈椭圆形中生 , 胞内基质染色均匀。
21213　生理生化试验结果　
拮抗细菌 ZL270菌株的生理生化特性见表 2。
表 2　拮抗细菌 ZL725菌株的生理生化特征
Table 2　Physiolog ica l and b iochem ica l character istics of an tagon istic stra in ZL725
试验
Experiment
结果
Result
试验
Experiment
结果
Result
过氧化氢产气试验 Catalase reaction 阳性 Masc 纤维素分解试验 Cellulose hydrolysis test 阴性 Negative
硝酸盐还原试验 N itrate reduction test 阳性 Masc 3 -酮基乳糖试验 32alkone ketone lactose test 阴性 Negative
淀粉水解试验 Starch hydrolysis test 阳性 Masc 脲酶试验 U rease test 阳性 Masc
2%耐盐试验 Test of 2% salt resistance 阳性 Masc 吲哚试验 Indole test 阴性 Negative
pH 517肉汤试验 pH 517 nutrient broth test 阳性 Masc 苯丙氨酸脱氢酶试验 Phenylalanine dehydrogenase test 阳性 Masc
酪素水解试验 Casein hydrolysis test 阳性 Masc 明胶液化试验 Gelatin liquefaction test 阳性 Masc
酪氨酸水解试验 Lysine hydrolysis test 阳性 Masc H2 S产气试验 H2 S gas p roduction test 阴性 Negative
碳水化合物产酸试验 阳性 Masc 三糖铁试验 Trip le sugar iron test 阳性 Mas
Test of acid p roduction using arbohydrate 甲基红试验 Methyl red test 阴性 Negative
V. P. 试验 V. P. test 阳性 Masc 氨基酸脱羧酶试验 Am ino acid decarboxylase test 阴性 Negative
柠檬酸盐试验 Citrate solution test 阳性 Masc 丙二酸盐试验 Malonate utilize test 阴性 Negative
综合以上拮抗细菌 ZL725菌株的形态特征和生理生化特性鉴定的结果 , 对照 《伯杰氏细菌鉴定手
册 》 (Buchanan & Gibbons, 1988) 和 《常见细菌系统鉴定手册 》 (东秀珠和蔡妙英 , 2001) , 结合分
子鉴定结果 , 将 ZL725菌株鉴定为解淀粉芽孢杆菌 (B acillus am yloliquefaciens)。
3　讨论
芽孢杆菌由于抗逆性强 , 抗菌谱广泛 , 近年来被认为是理想的植物病害生防细菌来源之一 , 引起
研究者的广泛关注。目前 , 生防研究所涉及的芽孢杆菌种类主要集中在枯草芽孢杆菌 (B acillus subti2
lis)、多粘芽孢杆菌 (B. polym yxa)、短小芽孢杆菌 (B. pum ilus)、解淀粉芽孢杆菌 (B. am ylolique2
faciens)、蜡状芽孢杆菌 (B. cereus) 和地衣芽孢杆菌 (B. lichen iform is) 等几个种。解淀粉芽孢杆菌
是 Fukumoto于 1943年发现的 , 后续研究表明解淀粉芽孢杆菌具有降解除草剂丁草胺的能力 , 同时还
发现解淀粉芽孢杆菌可以利用魔芋飞粉和魔芋精粉生产β -甘露聚糖酶。近年来发现 , 解淀粉芽孢杆
菌可抑制油菜核盘菌菌核的形成 , 对番茄青枯病菌也有抑制效果 ( Soad et al. , 2004; 陈士云 等 ,
2005; 谭文捷 等 , 2005; 熊郃和干信 , 2005)。但对于解淀粉芽孢杆菌用于兰花病害的防治研究未见
报道。另外 , 除了从自然界分离筛选具有高效生防活性的野生菌株之外 , 利用基因工程技术构建具有
高效生防活性的拮抗细菌也是目前研究热点之一。刘限等 (2006) 曾从构建的木霉菌转化体中筛选
相比于野生株防效明显提高的生防菌株 , 而且该菌株多代繁殖后仍具有稳定的生防特性。菌株 ZL725
是从自然界分离纯化的具有较高生防活性的野生菌株 , 这为今后构建高效生防工程菌株提供了优良的
基础基因资源和材料资源。
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由于大花惠兰根腐病存在包括尖孢镰刀菌在内的多种致病菌 , 因此 , 应用菌株 ZL725作为生防菌
株来防治大花惠兰根腐病 , 还需检测该菌株对其它致病菌的拮抗活性以及该菌株在实际防治中的作用
和效果。
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