全 文 ：广 西 植 物 Guihaia 30(6)：869— 875 201o年 11月
广西岩溶区烟草黑胫病拮抗细菌
的筛选鉴定及其抗病机理
黄宁珍，区 婵，何金祥 ，赵志国，王新桂，
郭伦发，周 浩，龚庆芳
( 籍 毳广西植物研究所，广西桂林541006)
摘 要 ：从广西岩溶区靖西县优质烟叶生产区分离烟草黑胫病病原及土壤细菌 ，通过拮抗试验 、离体及田间抗
病能力测试等方法筛选拮抗细菌 ；利用形态观察、生理生化测试和 16S rDNA序列分析三种方法相结合，对抗病
效果 良好的菌株进行分类鉴定 ；并对拮抗菌抗黑胫病机理进行初步研究 。结果表明：从 8份土壤样品中，共分离
出土壤细菌 340株，获得抗黑胫病效果良好的拮抗细菌 3株，编号为 8—23、6—7O和 l3，它们分别属芽孢杆菌属、溶
菌杆属和假单胞杆菌属细菌；三个拮抗细菌的抗黑胫病机理是通过胞外分泌一些可溶解病原菌细胞壁的酶或其
它化学物质，破坏菌丝的细胞壁和细胞膜等生理结构，使细胞质渗漏、凝集，从而导致病原死亡；其中，菌株 8—23
和 13的抗病活性物质主要为蛋白质类化合物；而菌株 6 7o除蛋白质外 ，还有其它一些非蛋白因子起作用。
关键词 ：黑胫病 ；拮抗细菌；筛选鉴定 ；抗病机理
中 图分 类号 ：Q9 ．5 文献标 识码 ；A 文章 编号 ：1000 3142(201O)06 0869 07
Isolation and identification of antagonistic bacteria
and their mechanisms against Phytophthora
parasitica var．ntcoUanae in Karst area oI~uankrxl ● ● ● ● ● l n ●
HUANG Ning-Zhen，oU Chan，HE J in-Xiang ，ZHAO Zhi-Guo，
WANG Xin-Gui，GUo Lun-Fa，ZHOU Hao，GoNG Qing-Fang
(Guangxi Institute of Botany，Guangxi Zhuang Autonomous Region and the Chinese Academy of Sciences，Guilin 541006，China)
Abstract：Phytophthora parasitica var．nicotianae and soil bacteria were isolated from Jingxi county，a karst
area in southwest of Guangxi province where produced high grade tabacco．Antagonistic bacteria to P．para—
sitica var．nicotianae were screened out according to their antagonistic action and anti—disease in vitro and field
experiment．The well antagonistic effect strains were identified by corabining the results of morphological ob—
servation，physiological and biochemical characteristics analyse，and 1 6S rDNA sequence test．And pilot study
of the mechanism of anti—disease of P．parasitica var．nicotianae was carried out at the same time． Results
showed that a total of 340 strains of bacteria were isolated from 8 samples of soil．And three strians with well
antagonistic effect which marked as 8-23，6-70，and 13 were screened out．They were the bacteria belonged to
Bacillus，Lysobacter，and Pseudomonas respectively．The mechanism of the three strains against P．parasitica
收稿 日期 ：201o o7 21 修 回 日期 ：2OlO一11 12
基金项 目：rp圈科学院知识创新工程重要方向项 目(KSCXZ-YW-N一48一O5)[Supported by Key Project of Knowledge Innovation Program of the Chinese
Academy of sc1ence(Kscx Yw—N一48一o5)]
作者简介：黄宁珍(1 968一)，女，广西大化人，副研究员，主要从事植物生理及生物防治研究工作，(E-mail)hnzhen68@yahoo．eom．cn。
通讯作者(Author for correspondence，E mail：hejinxiang@gxib．en)
87O 广 西 植 物 3O卷
var．nicotianae was to excrete some protein enzymes or other substance which could dissolve the cell wall or
membrane of pathogeny and kiled them finally．The active substance of strain 8 23 and 13 were mainly pro—
tein．But for the strain 6-70，there were SOI1]e other factors tO work besides the protein compounds．
Key words：P．parasitica tar．nicotianae；antagonistic bacteria；isolation and identification；anti—pathogeny
mechanism
广西是我国烟草栽培基地之一，种植 区主要分
布在桂西岩溶区。由于烟草栽培面积的不断扩大和
长期在同一地区种植等原因，使这些地 区病虫危害
日益严重 ，特别是 由烟草疫霉(P ￡fJ 矗 0rn para—
sitica vat．nicotianae)引起 的烟草黑胫病(Tobacco
black shank)，已成为影响当地 烟草种植业持续发
展的主要病害(陈瑞泰等，1997)。化学农药在烟草
黑胫病防治上虽可发挥重要作用 ，但大量和持续性
施用不仅严重污染生态环境 ，而且造成病原菌耐药
和抗药性，使病害的发生频率、危害程度和防治难度
加大。而生物防治具有无污染、无公 害和长效性等
优点 ，在烟草黑胫病的防治中将发挥重要作用。
筛选和鉴定高效拮抗微生物是生物防治的重要
组成部分。生防微生物包括细菌、真菌和放线菌三
大类。一些细菌生防菌，由于能形成芽孢 ，可以耐受
高温、高酸碱度和厌氧等逆境 ，与真菌和放线菌生防
菌剂相比，更受人们的关注。目前 以细菌作为烟草
黑胫病生防菌的研究 ，国内外 已有相应报道 。早期
的研究发现，芽孢杆菌(BacH[us)和假单胞杆菌
(Pseudomonas)可通过产生抗菌素使烟草黑胫病菌
丝溶解 ，从而达到抗病效果 (Broadbent，1971)；近年
来，我国云南、浙江、湖北等地 的研究人员也先后从
土壤中筛选获得一系列烟草黑胫病拮抗细菌，田问
小试对烟草黑胫病具有一定的防治效果(方敦煌等，
200l；王远山等，2002；张慧丽 ，2005；杨树军，2009)。
然而，这些工作大多还处在实验室和小试阶段，离大
规模生产和推广应用还有相 当大的距离，相关技术
有待于进一步完善和提高 。另一方面 ，由于烟草黑
胫病病原有地域特异性 ，不同地区的病原属 于不同
的生理小种，由此可能导致某一生防菌剂在不同发
病地区防治效果不同；加上农药施用和环境压力可
能导致黑胫病病原不断发生变异 ，从而使现有的化
学农药和生防菌剂失效。因此 ，对烟草黑胫病拮抗
细菌不断地进行筛选鉴定及其抗病机理研究 ，有较
大的理论和实际意义。本研究从广西岩溶区优质烟
叶生产区靖西县采集烟草黑胫病发病植株和健康株
根际土壤，分离黑胫病病原及土壤细菌 ，通过拮抗试
验、离体和盆栽抗病能力测试筛选拮抗菌株 ，并对抗
病效果较好 的拈抗菌进行菌种鉴定 和抗病机理研
究 ，为广西岩溶 区烟草黑胫病生防菌剂的研制和开
发利用提供理论和技术基础 。
1 材料与方法
1．1样品采集
黑胫病病株：从广西靖西县烟草种植地采集，用
以分离当地的黑胫病病原。土壤样品：从广西靖西
县烟草种植区高发病地块烟草健株的根际采集，共
采集 8份，用以分离土壤细菌。
1．2培养基配制、烟草黑胫病病原及土壤细菌的分
离及纯化
燕麦培养基 (OA)、牛肉膏蛋 白胨培养基(NA)
和马铃薯麦芽糖培养基(PM)三种培养基的配制，以
及烟草黑胫病病原及土壤细菌的分离及纯化均参照
区婵(2010)的方法。通过形态观察和 ITS序列分
析鉴定烟草黑胫病病原，并选用云烟 85为供试品
种 ，采用王跃强 (2006)的方法验证病原菌的致病力；
病原确认后保存于冰箱中备用。土壤细菌采用平板
稀释法在 NA培养基上进行分离和纯化培养，根据
培养物菌落形态 差异 ，标记并收集不同的菌株，在
NA培养基中保存备用。
1．3烟草黑胫病拮抗细菌的筛选及其对黑胫病的防
治效果
(1)拮抗细菌筛选 ：分别 以 0A 和 NA为培养
基、采用纸片法和生长速率法(区婵，2010)将土壤细
菌与烟草黑胫病进行对抗试验，根据抑菌圈和抑菌
率的大小进行初筛和复筛，对拮抗效果较好的菌株，
在 NA培养基上培养备用。(2)拮抗菌防病效果 ：黑
胫病及拮抗菌悬浮液的制备分别参照刘廷利(2007)
和区婵(2010)的方法。准备苗龄 5O d、4片真叶以
上健壮一致 的烟草苗。每株根施拮抗菌悬浮液 5O
mI ／7 d，共施 2次 ；之后 ，再根施黑胫病菌悬浮液 5
mI ／株。共设 3个不同处理：①拮抗菌处理 ：根施拮
抗菌悬浮液 2次之后，再接种黑胫病病原；②感病对
照：仅接种黑胫病病原 ；③农药对照：根施烟草黑胫
病病原后 ，再用 20 mE甲霜灵锰锌 600倍液浇根；
6期 黄宁珍等：广西岩溶区烟草黑胫病拮抗细菌的筛选鉴定及其抗病机理 871
每个处理 6～1O株 。接种病原后 ，每隔天观测记录
各处理的发病情况，黑胫病病情按照“中国烟草行业
标准(YC／T 39—1996)”进行分级 ，计算病情指数。
1．4烟草黑胫病拮抗细菌的鉴定
综合平板拮抗实验 与盆栽防效结果 ，对拮抗 和
防病效果较好的拮抗细菌 ，通过形态观察 、生理生化
测试和 16S rDNA序列分析对菌株进行种属鉴定 ：
(1)re态观测 ：包括菌落形态、革兰氏染色、有无芽孢
和鞭毛数量等(陈金春，2005；赵斌，2005)。(2)生理
生化特性测试 ：包括糖(醇)发酵、柠檬酸盐利用、丙二
酸盐利用、过氧化氢酶反应 、明胶液化 、淀粉水解、甲
基红反应(M．R试验)、伏一普试验(V．P．试验)和耐
盐生长等(方 中达，1998；陈金春，2005)。(3)分子鉴
定：拮抗菌基因组 DNA用微波炉法(张颖等，2004)提
取；16S rDNA引物扩增产物测序由上海生工生物工
程有限公 司完成；测序结果用 DNAMAN 和 BioEdit
软件进行校对、剪切和拼接后，通过 Blast搜索在 NC—
BI(http：／／www．ncbi．nlm．nih．gov)的 GenBank中进
行 ITS序列比对，并用 Clusta1)(2．0和 MEGA4xl软
件进行 UPGMA分析生成 系统发育树，确定 菌株 的
分类地位。
1．5烟草黑胫病拮抗细菌的抗病机理初步研究
将拈抗细菌在 PM 培养液 中培养 ，获得 的培养
物经离心和无菌过滤后 ，得到拮抗 细菌培养滤液 。
将培养了 5 d的烟草黑胫病菌丝接种到拮抗 细菌培
养滤液中，以无菌水为对照，30℃培养，每隔 12 h
镜检观察黑胫病菌丝形态。另取上述拮抗细菌培养
滤液 500 L，加入 5 L、1 的蛋白酶K溶液，37℃水
浴 3 h后，取 i00 L均匀涂抹于 OA平板培养基表
面，以不经蛋 白酶 K 处理 的培养滤液为参照 ，在平
板中心接种烟草黑胫病菌丝块(直径 5 ram)，以无
菌水水为对照，28℃培养 。重复 3次 ，检测抑菌率。
1．6数据收集和计算
抑菌率和病情指数的计算均参照区蝉(2010)的
方法
2 结果与分析
2．1烟草黑胫病病原菌分离、纯化及鉴定
通过分离和纯化 ，获得烟草黑胫 病靖西 菌株。
观察其菌落、菌丝、孢子囊 ，并进行致病性和 ITS序
列分析测定。结果表明 ，在燕麦 (OA)培养基上，其
菌落边缘 明显，菌丝 白色 、纤细。显微镜下观察，菌
丝无隔，分枝少 ；孢 子囊 顶生，形状多为椭圆形、梨
形、少数 圆形 ，孢子囊大小 15～5O,um×12~51／zm，
顶端常有 1个 明显的半球形乳突，少数可观测到 2
个乳突；孢子囊不易脱 落(图 1)。分子鉴定结果显
示 ，其 ITS序列与烟 草疫霉 (P．parasitica var．nic—
otianae)有 99 的同源性 。
图 1 显微镜下烟草黑胫病原形态(600倍)
Fig．1 Shape of P．parasitica var．nicotianae
observed through microscope(×600)
A．菌丝 mycelia；B．孢子囊 sporangia。
离体烟叶接种黑胫病病原后，第一天形成棕色
病斑，第三天蔓延至整叶的2／3以上，平均病情指数
为 75．OO。将病菌悬浮液注入烟草植株内，在高温、
高湿条件下 ，接种第二天，针孔周 围出现明显黑斑 ，
七天后烟苗茎部的 3／4以上变黑 ，叶干枯 ，所有接种
病原的烟草均表现出典型的烟草黑胫病症状，平均
病情指数 83．33。根据朱贤朝(2002)对烟草黑胫病
病原形态特征 、致病性的描述 ，结合分子鉴定结果，
确定所分离到菌株为寄生疫霉烟草变种。
2．2烟草黑胫病拮抗茵的筛选
对 8个土壤样 品进行微生物分离 ，共收集到细
菌 340株。采用平板对峙培养法进行初筛，依据病
原的生长情况、抑菌囤大小等，初步筛选出对烟草黑
胫病病原菌具有拮抗效果的细菌 82株，占总数的
24．12 ；抑菌圈半径>5 inm有 16株。
对在初筛 中抑菌圈半径大于>5 mm 的 16株
土壤拮抗细菌 ，采用生长速率法进行复筛。结果表
明，在供试的 16个土壤拮抗细菌中，对烟草黑胫病
病原生长抑制率在 65 以上 的拮抗细菌有 8株 ，综
合菌株的抑菌率及培养难易程度等参数，以菌株 6—
70、13、8—23的整体效果较好 ，因此选择这三个菌株
872 广 西 植 物 3O卷
进行进一步实验。
2．3三株拮抗细菌对烟草黑胫病的防治效果
根据上述初筛和复筛结果，选择对烟草黑胫病
病原拮抗效果较好的的菌株 8-23、6-70和 13，通过
盆栽试验，测试其对烟草黑胫病 的防治效果。结果
发现 ，拮抗细菌 8—23、6—7O和 13对盆栽烟草黑胫病
的防治效果分别为 81．25 、81．25％和 85．94 ，高
于或等于甲霜灵 600倍液的防效(表 1)。
表 1 三株拮抗细菌对盆栽烟草黑胫病的防治情况
Table 1 Effect of prevention tobacco black shank in
pot experiment by three strains of antagonistic batcteria
2．4三株拮抗细菌的鉴定
2．4．1三株拮抗细菌的形态及生理生化特征 对拮
抗细菌的菌落和细胞形态 、芽孢和鞭毛、以及革兰氏
染色等进行观测，结果 显示 ：(1)菌株 8—23：为革 兰
氏阳性细菌；菌落扁平 ，表面黏液状 ，呈土黄色不透
明状，边缘不明显 ，生长物黏稠 ；细胞杆状 ，有芽孢 ，
周生鞭毛，游动性强。(2)菌株 6—7O：为革兰氏阴性
细菌；菌落扁平 ，表面光滑 ，呈黄色不透明状 ，边缘明
显 ，生长物黏稠 ；细胞杆状 ，无芽孢，一端生 1～3根
鞭毛，游动性差。(3)菌株 13：为革兰 氏阴性细菌；
菌落露滴状，表面有皱纹 ，呈乳 白色不透明状 ，边缘
明显 ，生长物黏稠；细胞杆状 ，元芽孢 ，一端生 1～3
根鞭毛，游动性差(表 2)。
对拮抗细菌进行生理生化测试 ，结果显示 ：菌株
8—23能利用阿拉伯糖、木糖、葡萄糖、麦芽糖、D一果
糖、山梨醇、甘露醇和丙二酸盐 ，产生淀粉水解酶和
过氧化氢酶，耐盐，能液化明胶 ；不能利用肌醇和柠
檬酸盐，不产生酸性、非酸性或中性末端产物。菌株
6—7O能利用麦芽糖和 D～果糖 ，产生淀粉水解酶和过
氧化氢酶，能液化明胶 ；不能利用阿拉伯糖、木糖、葡
萄糖 、肌醇 、山梨醇、甘露醇、柠檬酸盐和丙二酸盐，
不耐盐 ，不产生酸性 、非酸性或中性末端产物。菌株
13能利用阿拉伯糖 、木糖 、葡萄糖 、麦芽糖 、D一果糖、
山梨醇、甘露醇、柠檬酸盐和丙二酸盐，产过氧化氢
酶，能液化明胶 ；不能利用肌醇，无淀粉水解酶，不耐
盐 ，不产生酸性、非酸性或中性末端产物(表 2)。
综合上述形态及生理生化特性 ，依据《伯杰氏细
菌鉴定手册》(1984)初步确定菌株 8—23与芽孢杆菌
属细菌相近。而菌株 6—70和 13两个菌株的分类地
位还需要通过 16S rDNA序列分析才能确定 。
表 2 三株拮抗细菌的形态特征和生理生化特性
Table 2 Morphologica1．physiological and biochemical
characteristics of three strains of antagonistic batcteria
形态特征
鞭毛
运动性
细胞
芽孢
革兰氏染色
菌落外形
菌落表面
菌落边缘
菌落颜色
菌落质地
生理生化特性
阿拉伯糖
木糖
葡萄糖
麦芽糖
果糖
肌醇
山梨醇
甘露醇
柠檬酸盐
丙二酸盐
淀粉水解酶
过氧 化氢酶
耐盐 性
M．R反应
V-P反应
明胶液化
周生
杆状
旃平
黏液状
不明显
土黄色
黏 稠 ，不 透明
+
一 端 1根 一端 1～3根
杆状 杆状
扁平 露滴状
光滑 皱纹
明显 明显
黄色 乳白色
黏稠，不透明 黏稠，不透明
+ +
+ +
注：表中“+”表示阳性 、能利用或有 ；“一”表示J弱性 、不能利用或元
2．4．2三株拮抗细菌的分子鉴定 以菌株 8-23、13、
6—7O粗 提 DNA 为模 板，用 l6S rDNA 引物进行
PCR扩增，将扩增产物回收、测序，并对测序结果进
行校对、剪切 和拼 接后 获得 相应序 列；将 序列与
OenBank中相关数据进行相似性分析，并建立系统
发育树 。
拮抗菌 8-23获得全长 l 408 bp序列 ，将该序列
与 GenBank中相关数据进行 相似性分析，结果表
明，在 GenBank中与之关系相近的前 100个序列都
是 Bacillus细菌，同源性在 98 以上。以同源性为
+ + + 十 一+ 一 一 一 +
一 一 一 一 + + 一 一 一 +
6期 黄宁珍等：广西岩溶区烟草黑胫病拮抗细菌的筛选鉴定及其抗病机理 873
基础 ，在前 5o个序列中选取关系接近的 5个不同种
的 16S rDNA序列 ，建立系统发育树 (图 2)，结果发
现 ，在 同源 性 较 高 的 细 菌 中 ，8—23与 枯 草 杆 菌 Ba—
citIus subtiIis(AF0907)处 于 同 一 分 支 ，同 源 率
99 。说明该菌应属芽孢杆菌属细菌 ，且与枯草杆
菌的亲缘关系最接近。
-23
AF0907 洲“ “6棚 )
SK-2(Bacilus sp．)
KIBGE4B1(Bacilus licheniformis)
NJ-25佃0c f cP 6dcfP，mm1
AI-l(Bacilus velezensis)
图 2 菌株 8—23的 16S rDNA系统发育树图
Fig．2 Phylogenetic tree based on 16S rDNA
sequence of strain 8-23
6·
DQ462462 sobacterniastensis)
GPU899 56(G lm proteobacterium 1
AB429529( D6 c 印)
DQI 911 78(Ly o6Ⅱc rd P鲫P 1
AB434259fU c f!“rPd6dc rⅢm 1
EU43011 8(Lysobacter enzymogenes)
HVU1 5111{Hydrothermal venl eubacterium)
AB016762(Xanthomonas sp )
图 3 菌株 6—7O的 16S rDNA系统发育树图
Fig．3 Phylogenetic tree based on 16S
rDNA sequence of strain 6-70
拮抗菌 6—70获得全长 1 396 hp的序列 ，将该序
列与 GenBank中相关数据进行相似性分析 ，结果表
明，在关 系相 近 的前 100个 序 列 中，46个 是 L ～
sobacter菌株，同源性在 97 以上。以 16S rDNA
同源性为基础，在前 50个序列中选取亲缘关系接近
的 8个不同种 的 16S rDNA 序列 ，建立 系统发育树
(图 3)，结果发现 ，在同源性 较高的细菌中，6—70与
Lysobacter niastensis处 于 同 一 分 支 ，同 源 性 为
97 。说 明该菌属溶杆菌属的细菌 ，且与 Lysobact—
ur niastensis亲缘关系较接近。
拮抗菌 13获得全长 1 397 bp的序列 。将序列
与GenBank中的相关数据进行相似性分析，结果表
明，在关系相近的前 100个序列中，54个是 Pseudo
?TlOTl61S、44个 是 Uncultured Pseudomonas菌株 ，同
源性均在 98 以上。以 16S rDNA 同源性为基础 ，
在前 54个 同属序列 中，选取其 中亲缘关 系接近的
l2个不同种 的 16S rDNA序列 ，构建拮抗菌 13的
系统发育树(图 4)，结果发现，在同源性较高的菌株
中，菌 株 13 与 假 单 胞 杆 菌 Pseudomonas sp．
(EU221415)处于同一分支 ，同源率 99 ，说明两者
之间亲缘关系最接近 。
图 4 菌株 13的 16S rDNA系统发育树图
Fig．4 Phylogenetie tree based on 16S
rDNA sequence of strain 1 3
2．5三株拮抗细菌抗烟草黑胫病机理
分别将拮抗细菌 8—23、6—7o和 13的培养滤液
处理烟草黑胫病菌丝，48 h后观察发现，经三株拮
抗细菌处理过 的黑胫病菌丝都出现了形态异常，如
菌丝局部膨 大、扭 曲，细胞 壁溶解，细胞 质渗漏、凝
集 、分布不均匀等；其 中，以菌株 6—7O和 13的效果
尤为明显 ；而对照菌丝形态正常 ，细胞壁完整，细胞
质 、壁边界清晰，区域和组织轮廓明显。说明三个菌
株的抗烟草黑胫病机理可能是通过产生某些溶解病
原细胞壁的酶来完成的(图 5)。
用蛋 白酶 K处理拮抗菌培养滤液后 ，其对烟草
黑胫病原 的抑制能力明显低 于与不经蛋 白酶 K处
理的阳性参照。各菌株抗病能力降低的幅度分别
为：菌株 l3降低 100 ，菌株 8—23降低 68．58 ，6—
70降低 34．90 (表 3)。这一结果说 明，菌株 8—23
和 13的抗黑胫病活性 物质可能主要为蛋 白质类化
合物；菌株 6—7O抗病活性物质除了蛋白质外，还有
其它一些非蛋 白因子起作用 。
3 讨论
烟草黑胫病是一种土传病害，是世界烟草生产
中最具毁灭性的病害之一 。生物防治以其高效、低
毒和长效性等特点 ，一直 以来是人们研究 的热点。
而拈抗微生物的筛选、鉴定和抗病机理研究是生物
防治研究的中心和重点。
～一～一一一～～唧

6期 黄宁珍等：广西岩溶区烟草黑胫病拮抗细菌的筛选鉴定及其抗病机理 875
土壤微生物是筛选生防菌的重要资源 ，本研究
分离到三个烟草黑胫病拮抗细菌均有比较好的抗病
效果，其 中菌株 8—23和 6—7O两个菌株的分类特征、
胞外抗菌活性物质和抗病机理与 目前 已报道的相关
生防菌株有相似之处 ，但又有所不同 。因此 ，本研究
结果丰富了同领域 的研究内容，为同类研究提供重
要参考和补充 ，同时 ，也为广西岩溶 区烟草黑胫病生
防菌剂的研制提供理论和技术基础 。
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