全 文 ：·研究报告·
生物技术通报
B IO TECHNOLOGY　BULL ETIN 2009年第 7期
蒙古冰草 Actin基因片段的克隆及序列分析
赵彦 1, 2 　云锦凤 1 　石凤敏 1 　刘亚玲 1
(1 内蒙古农业大学生态环境学院 ,呼和浩特 010018; 2 内蒙古农牧业科学院 ,呼和浩特 010031)
　　摘 　要 : 　旨在利用同源序列法分离蒙古冰草 (A gropyron m ongolicum Keng) A ctin基因同源片段 ,为研究其他基因在蒙古
冰草中的表达和调控提供内标参照。根据禾本科植物小麦 A ctin基因 (AB181991)的保守序列设计 2对引物 A4和 A5,采用
RT2PCR扩增蒙古冰草的 A ctin基因片段 ,分别得到 656 bp和 848 bp的片段 ,使用 DNAman和 DNAuser等分子生物学软件进行
序列分析 ,将 2个片段的重复序列合并后获得一段长度为 962 bp的基因片段 ,编码 237个氨基酸 ,将克隆的 A ctin基因片段命
名为 MwACT。该序列与其它植物 A ctin基因核苷酸序列的同源性均在 80%以上 ,其中与小麦、大麦的同源性达到 94% ;与氨
基酸序列的同源性均在 90%以上。
关键词 : 　蒙古冰草 　A ctin基因 　克隆 　序列分析
Isolation and Character ization of Actin Gene Fragment from
Agropyron m ongolicum Keng
Zhao Yan1, 2 　Yun J infeng1 　Shi Fengm in1 　L iu Yaling1
(1 College of Environm ent, InnerM ongolia Agricultural University, Huhhot 010018;
2 InnerM ongolia Academ y of Agriculture and Anim al Husbandry Sciences, Huhhot 010031)
　　Abs trac t: 　 In this study, A ctin gene homology fragment from Mongo1 ian wheatgrass(A gropyron m ongolicum Keng) was isolated u2
sing homology2based method, so that it can be used as internal standard when study other genes’exp ression and regulation in Mon2
go1 ian wheatgrass1Two pairs of p rimers A4 and A5 was designed according to the am ino acid conserved regions of the cloned actin gene
of Gram ineae p lant wheat, and two partials gene sequences were obtained by reverse transcrip tion polymerase chain reaction ( RT2
PCR) , the p roduct of which was named asMwACT1The sequences was 962 bp after merging two partials gene repeat sequences, which
encoded 237 am ino acids1 Homology comparison with A ctin gene sequences in other p lants was over 79% , which was 94% identical to
wheat and barley1Over 90% am ino acid sequence homology was showed with other p lants1
Key wo rds: 　A gropyron m ongolicum Keng　A ctin gene　Clone　Sequence analysis
收稿日期 : 2009201219
基金项目 :“973”项目子课题 (2007CB10890121) ,国家自然科学基金项目 (30760159)
作者简介 :赵彦 (19772) ,女 ,内蒙古通辽市人 ,助理研究员 ,在读博士 ,主要从事植物分子遗传学研究
通讯作者 :云锦凤 (19412) ,女 ,内蒙古呼和浩特市人 ,教授 ,博士生导师 ,主要从事牧草遗传育种研究 ; E2mail: csgrass@vip11631com　　肌动蛋白 ( actin)是真核生物中普遍存在的一种重要的蛋白质 ,是构成细胞骨架和肌肉肌小节的主要成分 , 执行着重要的生理功能 ,如细胞分裂、细胞运动、细胞形状变化、内吞作用、胞吐作用以及多种细胞运动 ,如顶端生长、细胞器运动、胞质环流、花粉管生长等 [ 1, 2 ]。高等动植物中 ,肌动蛋白都是由多基因编码 [ 3 ]。不同生物肌动蛋白具有高度保守性 ,这些基因高度相似 ,通过多轮复制由一个基因祖先进化而来 [ 4 ]。 A ctin基因在各种组织中恒定表达 ,是一种广泛参与真核细胞生理过程的管家基因 , 因而常被作为研究其它基因的表达模式及调控机制的分子内标。迄今为止 ,已在许多高等植物 , 如水稻、玉米、小麦、大麦、谷子 [ 5 ]、玉兰 [ 6 ]、花生 [ 7 ]、马铃薯、胡萝卜、大豆、拟南芥、菟丝子、烟草和向日葵等中克隆到了 A c2tin基因 [ 8 ]。然而 ,有关蒙古冰草 A ctin基因的研究尚未见报道。蒙古冰草 (A gropyron m ongolicum Keng)是一种
2009年第 7期 赵彦等 :蒙古冰草 A ctin基因片段的克隆及序列分析
极耐旱、抗风沙及严寒的二倍体 (2n = 14)丛生禾草
是旱生 -沙生草原种 ,常见于干草原和荒漠草原的
典型沙质环境中 [ 9 ]。该物种兼具饲用、生态和遗传
育种研究三重价值 ,是国家二级珍稀濒危植物和急
需保护的农作物野生近缘种 [ 10 ]。有关蒙古冰草的
抗逆性研究正相继开展 ,以蒙古冰草为材料 ,用 RT2
PCR方法克隆蒙古冰草 A ctin基因片段 ,以此基因为
内标参照 ,为研究其他基因在蒙古冰草中的表达和
调控奠定基础。
1　材料和方法
111　材料
蒙古冰草由内蒙古农业大学牧草试验站提供种
子 ,在生态环境学院智能型温室播种 ,在苗期取整株
进行总 RNA提取。
112　方法
11211　引物的设计及合成 　从 GenBank中查找禾
本科植物小麦 (AB181991)已知的 A ctin基因序列 ,
运用 DNAman软件辅助分析设计 2对特异引物 A4
和 A5,送至上海生工生物技术公司合成。A4上游
引物 : 5′2CCGTTCTGTCCTTGTATGCCA23′,下游引物
5′2CCACATCTGCTGGAAAGTGC23′; A5 上游引物 :
5′2TTCGTTTGGACCTTGCTGGC23′,下游引物 : 5′2TG
CCTAAGCGACATTGTGTG23′。
11212　蒙古冰草总 RNA的提取 　采用天为时代公
司的总 RNA提取试剂 TRNzol (目录号 : DP405) ,具
体操作步骤参照说明书。
11213　RT2PCR扩增 A ctin基因片段 　使用 Quant
Reverse Transcrip tase试剂盒合成第一链 cDNA。以
蒙古冰草总 RNA为模板进行 RT2PCR扩增。25μl
反应体系包括 : Prem ix Taq1215μl, cDNA模板 lμl
(约 30 ng) ,左、右引物各 2μl,灭菌超纯水补齐体
积。反应程序为 95℃预变性 2 m in; 95℃变性 30 s,
57℃退火 1 m in, 72℃延伸 1 m in, 30个循环 , 72℃
10 m in; 4℃保存。
11214　RT2PCR产物的回收及克隆 　PCR产物经
115%的琼脂糖凝胶电泳分离 ,将目的 DNA片段用
天为时代公司 UN IQ210 柱式琼脂糖凝胶回收试剂
盒回收纯化 ,取 5μl回收产物与 pGM 2T载体 16℃
连接过夜 ,连接产物转化大肠杆菌感受态细胞 , LB
培养基筛选 ,挑取白斑 ,提取质粒 , PCR 验证插入
片段。
11215　测序与序列比较 　样品送至上海生工测序。
同源性检索和序列分析采用 BLAST ( www1ncbi1
nlm1nih1gov/BLAST)和 DNAman等软件进行分析。
2　结果与分析
211　蒙古冰草 A ctin基因片段的分离
经 RT2PCR扩增 ,两对引物各获得 1条约 700
bp和 800 bp的片段 (图 1)。分别回收这 2条带 ,经
连接、转化和检测 ,将鉴定为阳性的单克隆 (图 2) ,
送至上海生工进行测序。
M1100 bp Marker; 11引物为 A4的 PCR扩增结果 ; 21引物为 A5的
PCR扩增结果
图 1　RT2PCR扩增片段电泳
M1100 bp Marker; 1～41引物为 A4的阳性克隆 PCR扩增结果 ; 5～
81引物为 A5的阳性克隆 PCR扩增结果
图 2　阳性克隆的 PCR检测结果
212　A ctin基因的序列分析
测序结果表明 ,引物 A4扩增获得的片段长度为
656 bp,引物 A5扩增获得的片段长度为 848 bp。利
用 NCB I中 BLAST和 DNAman软件进行序列分析 ,将
2个核苷酸序列中的重复部分合并后得到 1条长度
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生物技术通报 B iotechnology　B u lle tin 2009年第 7期
为 962 bp的 cDNA序列 ,推测这个基因序列编码 237
个氨基酸 (图 3)。将该基因片段命名为 MwACT,并
在 GenBank中登记注册 ,登录号为 FJ557240。
图 3　蒙古冰草肌动蛋白基因的核苷酸序列以及推导的氨基酸序列
213　A ctin基因序列同源性比较与聚类分析
将蒙古冰草 Actin基因的核苷酸序列与 GenBank
中其它生物的肌动蛋白基因序列进行核苷酸同源性
比较 ,发现其同源性均在 79%以上。在禾本科内 ,
MwACT与小麦 (AB181991)和大麦 (AK248710)的核
苷酸序列相似性为 94% ,多年生黑麦草 (AY014279)
的核苷酸序列相似性为 93% ,与水稻的相似性为
90% ,与玉米的相似性为 84% ,与双子叶植物拟南芥
的相似性为 80%。与其它生物肌动蛋白的氨基酸序
列的同源性达 90%以上 ,由此可见 ,肌动蛋白在氨基
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2009年第 7期 赵彦等 :蒙古冰草 A ctin基因片段的克隆及序列分析
酸组成上是高度保守的。
利用 NCB I中的 BLAST软件和 DNAman软件 ,
对该片段与已知的 12个植物 A ctin基因在氨基酸水
平上进行聚类分析并绘制系统进化树 (图 4)。由图
4可见 ,高等植物肌动蛋白进化树至少可分为 3个
分化群。其中 ,蒙古冰草肌动蛋白与小麦、大麦肌动
蛋白的亲缘关系最为密切 ,其次是黑麦草、水稻和玉
图 4　蒙古冰草肌动蛋白与其它 12种
植物肌动蛋白的分子进化树
米 ,且与拟南芥肌动蛋白以及玉兰肌动蛋白形成一
个分化群。这一结果补充了蒙古冰草作为农作物近
缘种的理论依据。由此还可以看出 ,单子叶植物与
双子叶植物的肌动蛋白在进化中相互交叉 ,表明被
子植物肌动蛋白基因家族起源于一个远早于单、双
子叶植物分化前的共同祖先。
3　讨论
肌动蛋白最初是 1941年在脊椎动物骨骼细胞
中发现并命名的 , 1952年 , Loewy从粘菌中提取到肌
动球蛋白 ,这是从非肌细胞中分离到的第一种球蛋
白。1963年 ,我国阎隆飞等首次报道了高等植物中
存在肌动蛋白 [ 11 ]。
植物肌动蛋白是单一多肽链的球状蛋白 ,由
375～377个氨基酸组成 ,分子量为 42 kD [ 11 ]。研究
表明 , Actin基因在核苷酸和氨基酸水平上都具有高
度的保守性和同源性 ,一般认为 ,肌动蛋白在各种生
物中通过复制和变异而被保留下来 ,植物肌动蛋白
起源于一个共同的祖先 ,其核苷酸替换率约为每亿
年 1% ,这种高度的保守性是由于在生物进化过程
中功能蛋白受到更大的选择压力的结果。本研究克
隆得到的蒙古冰草 WmACT基因与其它植物 Actin
基因的核苷酸序列同源性均在 79%以上 ,氨基酸序
列同源性均在 90%以上 ,再次证明了 Actin基因具
有高度的保守性和同源性。
分子进化研究通常都是利用这些具有保守性且
进化速率恒定的蛋白质或其 DNA序列 ,这就需要大
量的分子资料和信息。肌动蛋白及其基因研究的进
一步深入和资料的进一步积累会有利于了解肌动蛋
白的保守性和变异性与生命起源和进化的关系。目
前 ,基于植物肌动蛋白基因的分子树已经有人绘制 ,
本研究所克隆的蒙古冰草肌动蛋白基因是冰草属中
最具代表性的二倍体植物的肌动蛋白基因 ,本研究
结果不仅填补了蒙古冰草肌动蛋白研究领域的空
白 ,同时丰富了肌动蛋白研究的资料库。
随着越来越多的肌动蛋白基因的克隆和序列测
定 ,对基因本身结构、功能和表达的分析越来越精
确 ,从而促进了肌动蛋白基因在作物改良上的应用
研究。此外 , A ctin作为一种广泛参与真核细胞生理
过程的管家基因 ,在基因表达调控研究时被广泛用
作分子内标。
参 考 文 献
1　 Sheterline P, Sharrow JC, Actin1 In: Protein Profile1 New York:
Academ ic Press, 19941
2　 Staiger CJ, Schliwa M1 Protop lasma, 1987, 141: 1～121
3　 Firtel R1Cell, 1981, 24: 6～71
4　 Mange A, Prudhomme JC1 Mol B iol Evol, 1999, 16 (2) : 165～1721
5　李园莉 ,江元清 ,赵武玲 ,等 1植物学通报 , 2002, 19 ( 3 ) : 310
～3161
6　周海飞 ,赵武玲 ,阎隆飞 1农业生物技术学报 , 2001, 9 ( 3) : 274
～2781
7　杨丽霞 ,李玲 1花生学报 , 2006, 35 (4) : 6～91
8　伍国强 ,席杰军 ,包爱科 ,等 1生物技术通报 , 2008, ( 2 ) : 101
～1041
9　云锦凤 ,米福贵 1中国草地 , 1989, (3) : 14～171
10　郑殿升 ,中国农业生物多样性保护与可持续利用现状调研报告.
北京 :气象出版社 , 20001
11　陈颖 ,王刚 ,赵俊霞 1生物学报 , 2003, 38 (1) : 13～151
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