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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2010年第 11期
靶向钠钾 ATP酶 1亚单位 shRNA质粒
表达载体的构建与筛选
周蔚 1, 2 徐忠伟1, 2 王凤梅 3 陈小义 1, 2 呼文亮 2 徐瑞成2
( 1中国人民武装警察部队医学院细胞生物学与遗传学教研室,天津 300162; 2中国人民武装警察部队医学院 天津市
职业与环境危害生物标志物重点实验室,天津 300162; 3天津市第三中心医院肝内科,天津 300171 )
摘 要: 构建编码人钠钾 ATP酶 ( Na+ /K+ ATPase) 1 mRNA的短发夹 RNA ( shRNA)质粒表达载体 shRNAATP1A1
( ATP1A11、ATP1A12和 ATP1A13), 并筛选出基因沉默效果最明显的 shRNA质粒表达载体。设计、合成靶向 ATP1A1的 3对
DNA序列, 分别插入 Pgenesil3中构建 3个 shRNA表达载体, 经限制性内切酶酶切和 DNA测序鉴定确认。筛选并确定最佳细
胞接种量及重组质粒转染量,半定量逆转录聚合酶链反应 ( RTPCR )和免疫细胞荧光检测 N a+ /K + ATPase 1表达变化; MTT
法和流式细胞术检测沉默效果最明显的 ATP1A13对 H epG2增殖活性和细胞周期的影响。构建的质粒表达载体酶切鉴定均
可扩增出预期条带, 测序符合设计要求, 构建成功。ATP1A12和 ATP1A13对所转染的 H epG2细胞中 Na+ /K+ ATPase 1 mR
NA和蛋白质表达均有抑制作用,其中 ATP1A13最为明显 (P < 005)。ATP1A13可抑制 H epG2细胞的增殖;转染 48和 60 h,
H epG2细胞细胞周期呈现 S期阻滞; 实时定量 PCR检测 ATP1A13敲低 H epG2N a+ /K + ATPase 1mRNA呈时间依赖性, 72 h
后表达降低约 90%。试验成功构建靶向钠钾 ATP酶 1亚单位的 shRNA质粒表达载体, 其中 shRNAATP1A13可显著抑制
H epG2细胞增殖引起细胞周期 S期阻滞。
关键词: 钠钾 ATP酶 RNA干扰 H epG2细胞 细胞周期
收稿日期: 20100524
基金项目:国家自然科学基金 ( 0840010 )
作者简介:周蔚,男,硕士,研究方向:钠钾 ATP酶功能活性和信号途径的研究; Em ai:l 1987715212@ 163. com
通讯作者:徐瑞成,男,教授,硕士生导师,研究方向:钠钾 ATP酶功能活性和信号途径的研究; Ema i:l xu _rc@ sohu. com
Construction and Screening of P lasm id Expression Vectors Encoding
the Short Hairpin RNA Targeting Na
+
/K
+ ATPase 1 Subunit
ZhouW ei
1, 2
Xu Zhongwe i
1, 2 W ang F engm ei3 Chen X iaoyi1, 2 HuW enliang2 Xu Ruicheng2
(
1
D epartment of Cy tobiology and G enetics,M edical College of the Chinese Peop les A rm ed Forces, T ianj in 300162;
2
T ianj in K ey Laboratory forB iomarkers of O ccupational and Environm entalH azard, M edical College of the Chinese
Peop les A rm ed Forces, T ianj in 300162; 3L iverD epartm ent of T ianjin 3 th C entralH osp ital, T ianj in 300171)
Abstrac:t It w as to construct the short ha irp in RNA ( shRNA ) express ing vector shRNAATP1A1 ( ATP1A11, ATP1A12,
ATP1A13) targeting hum an N a+ /K + ATPase1 mRNA. The hepatoce llular carc inom aH epG2 ce ll linew ere trasfected w ith vector shR
NAATP1A1 for 24 h. The Na+ /K+ ATPase 1 subun it expression leve l of H epG2 were detected by RTPCR and imm unocytochem is
try. The shRNAATP1A13 cou ld sign ificantly knock dow n the Na+ /K+ ATPase 1 subunit expression o fH epG2 cells com pared to the
ATP1A11 and ATP1A12 g roup (P < 005). The pro lifera tion activ ity o fH epG2 trea ted w ith shRNAATP1A13 w as de term ined byMTT
assay, cell cyc lew as m easu red by flow cytom etry and N a+ /K + ATPase
1
mRNA leve lw ere de term ined by Rea ltim e PCR. W e found
tha t shRNAATP1A13 cou ld inhib itH epG2 ce ll pro liferation in tim e dependentm anner. Cell cyc le show ed S phase arresting after trans
fecting fo r 48 and 60 h. Rea ltim e PCR result showed that the knockdow n e ffect of Na+ /K+ ATPase1 mRNA expression levelw ere in
tim e dependen tm anne rs, and it decreased about 90% after 72 hours. The p lasm id expression vectors cod ing for shRNA ta rgeting Na+ /
K + ATPase
1
mRNA have been constructed successfully, and shRNAATP1A13 could inh ib itH epG2 ce ll pro life ration and induce cell
cyc le S phase a rresting.
Key words: Na+ /K+ ATPase RNA interfe rence H epG2 ce ll C ell cyc le
2010年第 11期 周蔚等:靶向钠钾 ATP酶 1亚单位 shRNA质粒表达载体的构建与筛选
钠钾 ATP酶是哺乳类细胞膜进行离子转运的
跨膜载体蛋白, 由 2 - 4个 、亚单位组成。 亚
单位有 1 - 4四个亚型,分子量为 110- 113 kD, 跨膜
10次,是催化亚单位; 亚单位有 1- 3三个亚型,分
子量为 36- 38 kD,跨膜 1次,调节 亚单位的催化
活性。钠钾 ATP酶在细胞的能量代谢、离子平衡、
信号传递和细胞粘附中发挥着重要作用 [ 1, 2]。研究
显示, 钠钾 ATP酶在正常组织和肿瘤组织中呈现出
差异化表达, 人前列腺癌 PC3、DU145细胞系, 非
小细胞肺癌 A549细胞系,神经胶质瘤 H s683、U373
MG、U 87MG和 T98G细胞系中钠钾 ATP酶 1亚
单位都呈现出高表达状态 [ 3- 5] , 前期课题组研究发
现,人肝癌组织和肝癌细胞 H epG2、SMMC7721和
Be l7402细胞系中钠钾 ATP酶 1亚单位也呈现出
高表达 [ 6, 7]。研究证实, M ija tov ic等 [ 4, 5 ]利用 RNA
干扰技术降低非小细胞性肺癌 A549细胞和神经胶
质瘤 U372MG细胞中钠钾 ATP酶 1亚单位的表
达,可抑制肿瘤细胞的增殖。因此, 钠钾 ATP酶可
能是一个潜在抗癌作用靶标。本试验将构建钠钾
ATP酶 1亚单位 shRNA 表达载体, 观察其对
HepG2细胞生长和细胞周期的影响, 为探讨钠钾
ATP酶的功能活性和信号途径奠定基础, 为肝细胞
癌的治疗提供新思路。
1 材料与方法
11 质粒与细胞
质粒 Pgenesil3购自武汉晶赛生物工程技术公
司;人肝癌细胞 HepG2购自中国医学科学院基础医
学研究所,由本室传代培养。
12 主要试剂
T4DNA连接酶、BamH I、H ind III、Sal I( NEB公
司 ) ;质粒小提试剂盒 (中鼎公司 ); Fugene HD转
染试剂 ( Roche公司 ) ; OPTIMEM I培养基 ( G ibco公
司 ); dsDNA片段 (武汉晶赛生物技术公司化学合
成 );荧光实时定量 PCR试剂盒 ( AB I公司 ); RTPCR
试剂盒 ( TaK aRa公司 ) ; 引物由鼎国合成; HDMEM
培养基 ( G ibco公司 ); 噻唑蓝 (MTT )、二甲基亚砜
( DM SO)为 S igma公司产品; T rizo l为 Inv itriongen试
剂;羊抗人钠钾 ATP酶 1一抗和 FITC标记的兔抗
羊二抗为 Santa C ruz公司产品。其它化学试剂均为
国产分析纯。
13 质粒的构建
131 钠钾 ATP酶 1亚单位 ATP1A11、ATP1A12
和 ATP1A13的设计 根据 GenBank提供的钠钾 ATP
酶 1基因 mRNA序列 ( GeneID: 476)针对其外显子
区域,设计挑选 3条长各为 19个碱基的特异性寡核
苷酸序列, ATP1A11: AGACAGGGACATGGATGAA;
ATP1A12: GACTTGAGCCGGGGATTAA; ATP1A13:
CCATCCAATCACAGCTAAA。在 5端和 3端引入
BamH I和 H ind III酶切位点, 按 BamH I+ Sense+
Loop+ Antsense+终止信号 + Sal I+ H in d III结构合
成发卡状钠钾 ATP酶 1的 shRNA寡核苷酸单链,同
时合成互补链 (表 1)。
表 1 钠钾 ATP酶 1亚单位干扰寡核苷酸序列
序列编号 序列 ( 5- 3)
ATP1A 111 GATCCagacagggacatggatgaaTTCAA
GACG ttcatccatgtccctgtctTTTTTTGTCGACA
ATP1A 112 AGCTT GTCGACAAAAAAagacagggacat
ggatgaaCGTCTTGAA ttcatccatgtccctgtctG
ATP1A 121 GATCCgacttgagccggggattaaTTCAA
GACG ttaatccccggctcaagtcTTTTTTGTCGACA
ATP1A 122 AGCTT GTCGACAAAAAAgacttgagc
cggggattaaCGTCTTGAA ttaatccccggctcaagtcG
ATP1A 131 GATCCgccatccaatcacagctaaaT
TCAAGACGtttagctgattggatggTTTTTTGTCGACA
ATP1A 132 AGCTT GTCGACAAAAAAccatccaatca
cagctaaaCGTCTTGAA tttagctgtgattggatggcG
132 shRNAATP1A 1质粒表达载体的构建 用
50 L溶解缓冲液溶解单链目的片段。取 4 L( 2
L ATP1A 11+ 2 L ATP1A12) + 16 L退火缓冲
液混匀。 94 水浴退火自然冷却至室温, 各取 1 L
退火产物 + 99 L H2O做 100倍稀释。稀释退火片
段与线性化 Pgenesil3质粒表达载体连接。取 5 L
过夜连接产物转化感受态细胞 DH5, 分别涂布于
含 Kanar抗性 (终浓度为 30 g /mL )的 LB平板上,
37 恒温箱培养过夜。每个培养皿上各挑取 3个单
克隆菌落接种于 3 mL含 Kanar抗性 (终浓度为 30
g /mL)的 LB培养液中, 37 恒温摇床 ( 250 r /m in)
培养过夜。小提试剂盒质粒小提,用 Sal I做酶切鉴
定。酶切鉴定正确的转化菌液 ATP1A11、ATP1A12
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和 ATP1A13测序。
14 细胞的培养和转染
HepG2细胞于含 10% 胎牛血清的 HDMEM
中, 37 、5% CO2混合气体培养箱中培养。细胞生
长密度达 85%融合度时, 将质粒与转染试剂按照
25比例混合于 100 L OPTIMEM I培养基 37 孵
育 20m in,与 2 mL H DMEM培养基混匀,加入培养
瓶转染细胞。
15 荧光显微镜检测质粒转染效率
Pgenesil3质粒包含一个 DsRed2红色荧光蛋白
区域, DsR ed2红色荧光蛋白激发波长为 535 nm,发
射波长为 617 nm。将乱序阴性质粒 ( negative control
shRNA )转染 H epG2细胞 24 h后, 荧光显微镜下观
察红色荧光蛋白表达, ImagePro Plus 60 softw are软
件计算表达红色荧光的细胞比例, 从而得出转染
效率。
16 成功获得显著抑制钠钾 ATP酶 1基因表达
的质粒载体 shRNAATP1A13
161 倒置显微镜观察 试验设正常对照组, 阴性
质粒对照组, 转染试剂组, 表达载体 ATP1A11组、
ATP1A12组、ATP1A13组。H epG2细胞于对数生长
期常规消化传代,调整细胞密度为 5 105 /mL, 接种
于 50mL培养瓶内,待细胞密度达到 85%时, 转染
细胞, 24 h后在倒置光学显微镜下观察细胞的形态
变化。
162 RTPCR检测 3种 shRNAATP1A1质粒表
达载体对 H epG2细胞 N a+ /K + ATPase 1 mRNA表
达 试验分组同上,转染 24 h后, T rizo l法提取细胞
总 RNA,步骤按大连 TaKaRaRTPCR二步法试剂操
作手册进行。引物序列:钠钾 ATP酶 1亚单位,上
游: 5CTGG TGACGGTGTGAATGAC3, 下游: 5
TGCTCAATAGGTCCACTGCTG3, 长度 586 bp;
actin作为内参基因, 上游: 5TGTTTGAGACCT
TCAACACCC3, 下游: 5AGCACTGT GTGTTGGCG
TACAG3,长度 540 bp。 PCR程序: 预变性 94 3
m in,变性 94 1 m in, 退火 58 30 s, 延伸 72 1
m in。30个循环, 72 延伸 10m in。产物经 2%琼脂
糖凝胶电泳, 凝胶自动成像 2000系统扫描结果,
以钠钾 ATP酶 1亚单位与 act in基因条带灰度
值的比值分析结果, 以 3次独立试验结果的均值做
统计学分析。
163 激光共聚焦显微镜检测 3种 shRNA
ATP1A1质粒表达载体对 HepG2细胞钠钾 ATP酶
1蛋白表达的影响 试验分组同上, 转染 24 h后,
经固定液 (甲醇 丙酮 = 11)固定 15m in, 003%过
氧化氢 -甲醇溶液孵育消除内源性过氧化物酶的活
性, 兔血清封闭 30m in,羊抗人钠钾 ATP酶 1抗体
4 孵育过夜, F ITC标记的兔抗羊二抗 37 孵育 30
m in, TBST洗脱 3次,每次 15m in, 共聚焦显微镜下观
察荧光表达, 激发波长为 490 nm, 发射波长为 520
nm, ImagePro Plus 60 so ftw are软件分析荧光强度。
17 shRNAATP1A 13质粒转染 H epG2细胞
171 实时定量逆转录聚合酶链反应 ( R ea ltime
PCR)检测 N a+ /K + ATPase 1 mRNA表达 试验分
组同上, GAPDH作为内参,引物序列为钠钾 ATP酶
1亚单位: 上游: 5GACGTGATAA GTATGAGC
CCTG3, 下游: 5AATCCCCGGCTCAAGTCTGT3;
GAPDH: 上游: 5AATGTCACCGTTGTCCAGTTG3,
下游: 5GTGGCTGGGGCTCTACTTC3。循环温度
条件: 94 预变性 2 m in, 40个循环 ( 95 变性 5 s,
60 退火 30 s) , 72 延伸 15 s。采用 AB I 7300软
件分析数据, 每组 C t= C tGene - CtGAPDH, C t=
C ttreated - C tcontrol, 通过相对定量法 ( 2- Ct ) , 计
算各组细胞 Na+ /K + ATPase 1mRNA表达水平。
172 MTT检测细胞增殖活性 H epG2细胞制成
5 104 /mL细胞悬液,接种于 96孔板,每孔 100 L,
设立正常对照组、阴性质粒对照组、转染试剂对照组
和质粒载体 ATP1A13组。在 24、48和 72 h每孔加
入 MTT试剂 10 L, 4 h离心弃上清, 每孔加入 DM
SO 150 L, 震荡混匀, 酶标仪测定 A 490吸光度值。
计算细胞生长抑制率。抑制率 = ( A对照 - A试验 ) /
(A对照 - A空白 ) 100%,以增殖抑制率对时间作图绘
制生长抑制曲线。
173 细胞周期分析 质粒载体 ATP1A13转染
H epG2细胞,于转染 24、36、48、60和 72 h后收集 1
106个细胞,经预冷 PBS洗 2次,冰冻 70%体积分
数的乙醇固定,上机前弃去乙醇, PBS洗 1遍, 加入
100 mg /L RNase,加入 50 mg /L碘化丙啶 ( P I)避光
染色 30m in,流式细胞仪检测细胞周期。
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18 统计学分析
所有数据以 x s表示, SPSS130软件处理。
两样本均数的比较采用 t检验; 多组比较用单因素
方差分析。P < 005认为有统计学意义。
2 结果
21 酶切鉴定结果
质粒 Pgenesil3多克隆位点 (M CS)如下: H in
dIIIshRNABamH IU6 Promo torE coR ISal IX ba I
D ra III。在插入的目的基因片段里,分别设计了一
个 Sal I的酶切位点, 插入在质粒 Pgenesil3的
BamH I和H ind III之间,如若插入正确,以 1%琼脂
糖凝胶电泳, 质粒能被 Sal I酶切出一条约 400 bp
的 DNA小带。经酶切鉴定分析, 质粒 ATP1A11、
ATP1A12和 ATP1A13均符合设计要求 (图 1)。
1. ATP1A11Sa l I; 2. ATP1A12Sa l I; 3. ATP1A13Sal I;
4. ATP1A13Sa l I; 5. con shRNASal I; 6. DNA m ark er
图 1 构建 shRNAN a+ /K+ ATPase 1
酶切鉴定电泳图
22 测序结果
送转化菌液 ATP1A11、ATP1A12和 ATP1A13
测序,经测序: 结果完全符合设计要求,可进行后续
试验 (图 2)。
A. ATP1A11转化菌液; B. ATP1A12转化菌液; C. ATP1A13转化菌液
图 2 构建 shRNANa+ /K+ ATPase1测序验证图
23 质粒转染 H epG2细胞转染效率的检测
转染 H epG2细胞 24 h后, 荧光显微镜下观察,
可见大量的红色荧光蛋白表达, Im agePro P lus 60
softw are分析可得转染效率达 715% (图 3)。
24 倒置显微镜观察细胞形态结果
倒置显微镜下, 对照组 H epG2细胞贴壁生长,
胞质透光性好,细胞生长呈融合状态,边界清楚。转
染 24 h后, ATP1A 11组、阴性质粒转染组、空转染试
剂组中 HepG2细胞形态与对照组相比无明显改变,
ATP1A12组和 ATP1A13组 H epG2细胞出现体积增
大, 细胞膜崩解,染色质凝集等细胞死亡现象。
A.荧光显微镜下阴性对照 shRNA转染
24 hH epG2细胞; B.同一视野下光镜图
图 3 荧光显微镜观察质粒转染效率 ( 100)
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1.正常对照组; 2. ATP1A11组; 3. ATP1A12组; 4. ATP1A13组; 5.阴性质粒对照组; 6.转染试剂组
图 4 三种 shRNAATP1A1质粒表达载体对 HepG2细胞 Na+ /K + ATPase
1
mRNA的影响
25 RTPCR和细胞免疫荧光检测钠钾 ATP酶 1
基因的表达
由图 4可见, ATP1A12和 ATP1A 13组均可降低
HepG2细胞 N a+ /K + ATPase 1 mRNA的表达, 以
ATP1A13组降低最为显著 ( P < 005) ; 其它组对钠
钾 ATP酶 1 mRNA无影响。图 5显示, H epG2细
胞膜呈绿色荧光,正常对照组、阴性质粒转染组和转
染试剂组的荧光强度要明显高于 ATP1A13转染组
(P < 005) , ATP1A13转染 HepG2细胞后钠钾 ATP
酶 1表达降低。结果显示 ATP1A13有显著抑制钠
钾 ATP 酶 1 mRNA 和蛋白表达的作用。确定
ATP1A13质粒表达载体为后续敲低 HepG2细胞
N a
+
/K
+ ATPase 1 mRNA的试验干涉因素。
A.正常对照组; B.阴性质粒转染组; C. 转染试剂组; D.转染
ATP1A11组; E.转染 ATP1A12组; F.转染 ATP1A13组
图 5 激光共聚焦观察 HepG2细胞
N a+ /K+ ATPase1的表达 ( 200)
26 Realtime PCR检测 ATP1A13转染 H epG2细
胞后 N a+ /K + ATPase 1mRNA表达变化
图 6显示, ATP1A13能有效敲低 H epG2细胞钠
钾 ATP酶 1亚单位 mRNA,呈时间依赖性, 正常对
照、转染 24、36、48、60和 72 h各组的标化钠钾 ATP
酶 1 mRNA水平分别为 1000、07950 00205、
06062 00075、04033 00009、03009 00035、
01019 00002。结果证实 ATP1A13转染细胞 72 h
后钠钾 ATP酶 1mRNA表达降低约 90%。
* P < 005, vs.正常对照组; * * P < 001, vs.正常对照组
图 6 Realtim e PCR检测 shRNAATP1A13对 H epG2
细胞 N a+ /K+ ATPase 1 mRNA的影响
27 MTT检测 ATP1A13对 HepG2细胞生长的影响
图 7显示, ATP1A13质粒表达载体对 H epG2细
胞生长抑制作用呈时间依赖性, 随着作用时间的延
长, 对 HepG2细胞增殖的抑制作用越显著 ( P <
001) ;阴性质粒对照组和转染试剂组在 24 h时对
细胞生长无影响。
* P < 001, vs. ATP1A13
图 7 质粒载体 ATP1A13对 HepG2细胞增殖活性的影响
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28 流式细胞术检测 ATP1A13对 H epG2细胞周
期的影响
图 8显示, H epG2细胞转染后细胞周期显示
ATP1A13可引起 HepG2细胞发生 S期阻滞。正常
对照组和转染 24、36、48、60 h组 S期细胞比例分别
为 ( 2760 198)%、( 209 211)%、( 2211
187)%、( 394 204)%和 ( 502 195)%。转
染 48 h和 60 h组 S期细胞比例明显高于正常对照
组,差异有统计学意义 (P < 005)。转染 72 h,肿瘤
细胞产生过多碎片,未呈现细胞周期图。
A.正常对照组; B.质粒转染 24 h组; C.质粒转染 36 h组; D.质粒转染 48 h组; E.质粒转染 60 h组
图 8 ATP1A13转染细胞后不同时间细胞周期的分析
3 讨论
钠钾 ATP酶是由催化 亚基和调节 亚基组
成的一个低聚体, 亚基分为 1- 4亚型,跨膜 10次,
氨基端和羧基端位于细胞膜胞质面, 参与 ATP催
化,抑制因子的结合位点位于细胞膜胞外表面; 亚
基是高度糖基化质膜蛋白, 亚基分为 1- 3亚型, 1
次跨膜,参与帮助 亚基正确的折叠并从内质网转
运到质膜,在质膜上稳定 亚基蛋白构型和调节
亚基的活性。钠钾 ATP酶在细胞的能量代谢、离子
平衡、信号传递和细胞粘附中发挥着重要作用。研
究显示,在前列腺癌、非小细胞肺癌、神经胶质瘤和
乳腺癌细胞株中, 钠钾 ATP酶呈现高表达 [ 3- 5, 8]。
M ijatov ic等 [ 4, 5 ]利用 RNA干扰技术敲低非小细胞性
肺癌 A549细胞和神经胶质瘤 U372MG细胞中钠钾
ATP酶 1亚单位的表达, 可抑制细胞增殖活性。
这些研究表明,钠钾 ATP酶可能将成为一类潜在的
抗癌靶点。
目前最有效地诱导目的基因沉默, 高效、特异地
靶向封闭目的基因的方法是 RNA ,i RNA i是由 21 -
23对核苷酸组成的双链 RNA,即小干扰 RNA ( siR
NA )介导的序列特异性转录后基因沉默现象, 是生
物进化过程中一种保守的抵御转基因或外来病毒侵
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犯的防御机制 [ 9]。RNA i介导的转录后基因沉默是
通过降解特异性 mRNA,有效抑制 mRNA翻译为蛋
白质或多肽,从而产生相应的功能表型缺失,而不影
响非同源 mRNA的稳定性,是从 mRNA水平上令特
定基因沉默的一种细胞通路。近年来, 运用 RNA i
技术在哺乳动物细胞中已展开了深入研究 [ 10, 11] ,用
其特异性、高效阻断目的基因表达将大大提高肿瘤
基因治疗领域的研究步伐 [ 12]。 shRNA是 siRNA的
一种产生形式,由质粒或病毒载体介导,在细胞内经
剪切加工形成双链小 RNA发挥干扰作用。与 siR
NA相比, shRNA在细胞内作用维持时间较长, 因而
可以观察基因被下调后的长期作用。尽管病毒感染
细胞的效率远远高于任何转染试剂, 但使用质粒载
体,可以避免病毒的细胞毒性和机体的免疫应答,以
及插入突变的风险。实时定量 PCR检测 shRNA
ATP1A13质粒表达载体能有效敲低 HepG2细胞钠
钾 ATP酶 1亚单位 mRNA的表达, 且呈时间依赖
性,在 72 h后其表达降低可达 90%, 表明质粒表达
载体构建有效。
研究发现的细胞增殖抑制和死亡现象, 与钠泵
活性改变破坏细胞内离子稳态密切相关。本试验构
建的质粒载体 shRNAATP1A 13能显著抑制钠钾
ATP酶 1亚单位的表达,钠钾 ATP酶数量减少,功
能活性降低。前期的研究发现 [ 7] , 应用钠泵抑制因
子作用肝癌 H epG2细胞后可引起细胞发生凋亡和
细胞周期 S期阻滞现象, 这与钠泵抑制后引起细胞
内游离 Ca2+浓度升高、细胞周期复合体 ( Cyclin A 1/
CDK 2 /PCNA Complex)的生成减少和 p21C IP1的表达
上调密切相关。ATP1A13转染 H epG2细胞,同样可
以抑制细胞生长,引起细胞周期 S期阻滞;这可能与
沉默钠钾 ATP酶 1亚单位后引发细胞内离子稳
态改变, 继发性地导致细胞内游离 Ca2+升高密切
相关。
综上所述, 试验成功构建并筛选了有效沉默钠
钾 ATP酶 1亚单位的 shRNAATP1A1表达质粒载
体,转染 H epG2细胞, 可以抑制细胞的增殖, 引发细
胞周期 S期阻滞。为进一步研究通过敲低钠钾 ATP
酶表达和抑制其活性治疗肝细胞癌提供试验依据和
理论支持。
参 考 文 献
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