全 文 ：生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN·研究报告· 2008年第3期
收稿日期:2007-11-26
基金项目:国家微生物菌种资源平台项目(2005DKA21204-10)
作者简介:杨迪(1983-),女,河南洛阳人,硕士研究生,研究方向:微生物制药,E-mail:yangdicat@163.com
通讯作者:路福平,E-mail:lfp@tust.edu.cn,Tel:022-60601667;Fax:86-022-60602298
脯氨酸蛋白内肽酶(prolinespecificendoprotease,简称 PEP)[E.C3.4.21.26]是一种能特异性水解多肽中
脯氨酸羧基端肽键的丝氨酸蛋白酶[1],由 Walter等人于 1971年在人体子宫组织中发现[2]。PEP在生物体内
能有效降解含有脯氨酸的生物活性肽,如神经降压素、促甲状腺激素释放素、P物质和抗利尿激素等[3]。因
此体内 PEP活性的异常变化可能会导致与这些活性肽相关的生理功能的异常,甚至疾病的发生 1,如临床
上发现精神分裂症患者血浆[4]、吗啡戒断症患者下丘脑[5]和老年性痴呆症患者脑组织中[6]的 PEP活性均发
生异常。
脯氨酸蛋白内肽酶是一种丝氨酸蛋白酶,催化三联体的排列为 Ser、Asp和 His,与已知的 3个丝氨酸
蛋白酶家族(胰蛋白酶家族、枯草杆菌蛋白酶家族和羧肽酶 Y家族)不同,催化三联体的第 3位上为 His。
脯氨酸蛋白内肽酶含有 G-X-S-X-G/A丝氨酸蛋白酶家族典型的高度保守序列,被 DFP完全抑制,但
在一级结构上与已知的丝氨酸蛋白酶同源性不高[7],而且不受 PMSF、PLCK、TPCK、胰蛋白酶抑制剂等已知
丝氨酸蛋白酶药物的抑制。因此,Rawlings等[8]认为这类蛋白酶是丝氨酸蛋白酶的新家族,称作脯氨酸蛋白
内肽酶家族。
黑曲霉脯氨酸蛋白内肽酶基因的克隆与序列分析
杨迪 1 高艳玲 1 路福平 1 周丽娜 2
(1天津市工业微生物重点实验室 天津科技大学生物工程学院,天津 300457;2齐齐哈尔大学生命科学与工程学院,齐齐哈尔 161006)
摘 要: 以黑曲霉(A.niger)TCCC41013的总RNA作为模板,通过 RT-PCR扩增出含自身信号肽的脯氨酸蛋白
内肽酶基因,将其插入pUCm-T载体上,经PCR和酶切鉴定后进行测序并分析。所克隆的PEP基因全长为1581bp,编
码526个氨基酸残基,成熟肽为504个氨基酸残基。与GeneBank中已报道的A.nigerCBS513.88的PEP序列同源性最高,
达到99.75%。脯氨酸蛋白内肽酶是一种新型的丝氨酸蛋白酶,黑曲霉PEP与已克隆的其他菌种的PEP同源性不高。
关键词: 脯氨酸蛋白内肽酶 黑曲霉 克隆 序列分析
CloningandSequenceAnalysisofA.nigerProlineSpecific
EndoproteaseGene
YangDi1 GaoYanling1 LuFuping1 ZhouLina2
(1TianjinKeyLabofIndustrialMicrobiology,ColegeofBiotechnology,TianjinUniversityofScience&Technology,Tianjin
300457;2LifeScienceandEngineeringColege,QiqiharUniversity,Qiqihar161006)
Abstract: ThetotalRNA from Aspergilusnigerwasextractedandtheprolinespecificendoproteasegene
containingitssignalsequencewasamplifiedbyRT-PCR,andtheninsertedintopUCm-T vector.Therecombinant
plasmidwasidentifiedbyPCR andrestrictionenzymedigestionandthenthePEPgenewassequencedandanalysed.
DNAsequenceresultsindicatedthatthePEPgenewas1581bp,andencoedeaproteinof526aminoacidresiduesand
504aminoacidresiduesasmaturepeptidechain.SequenceanalysisshowedthatthePEPandA.nigerCBS513.88PEP
reportedonGenBanksharedthehighesthomologyupto99.75%.Prolinespecificendoproteaseisanewkindofserine
protease,theaminoacidsequenceofPEPhaslowhomologoustothoseofotherPEPcloned.
Keywords: Prolinespecificendoprotease Aspergilusniger Cloning Sequenceanlysis
生物技术通报Biotechnology Buletin 2008年第3期
PEP广泛分布于哺乳动物的组织中,同时也存在于几种真菌、细菌和古细菌中,但其含量很低,分离纯
化困难,限制了对其生理功能和性质的研究。国外 Yoshimoto等已经从脑膜炎脓毒黄杆菌、嗜水气单胞菌、
耐热古细菌、人淋巴细胞和猪脑 cDNA库中克隆了 PEP基因,国内仅只李民等克隆出点状产气单胞菌的
PEP基因[9]。黑曲霉是美国食品药品管理机构认定的生物安全菌,从黑曲霉中提取脯氨酸蛋白内肽酶应用
于食品药品行业安全可靠,黑曲霉中 PEP基因的克隆国内尚未有研究报道。本研究的目的在于对生物安全
菌黑曲霉的 PEP基因进行克隆与序列分析,进而使 PEP基因在真菌中实现高效表达,以便进一步研究和
利用。
1 材料
1.1 菌株与质粒
黑曲霉(Aspergilusniger)TCCC41013,大肠杆菌(E.coli)DH5α。pUCm-T载体购自上海生物工程有限公司。
1.2 工具酶及试剂
实验所用的限制性内切酶 EcoRI、BglI,DNALigationKitVer2.0和 TaqDNA聚合酶均购自 TaKaRa
公司;DNA片段快速回收试剂盒购自博大泰克生物基因技术有限公司;DNAMarker为 Fermentas公司产
品,超绝 UNIQ-10柱 RNA抽提试剂盒购自上海生物工程有限公司。
2 方法
2.1 黑曲霉总 RNA的提取
将 A.nigerTCCC41013在 PDA培养基上划线,28℃培养 3d,活化菌种,用无菌水制成孢子悬液接种于
发酵培养基中 30℃培养 48h,抽滤收集菌丝体,将菌丝体在液氮中研磨成粉末状,按照超绝 UNIQ-10柱总
RNA试剂盒说明书提取其总 RNA。
2.2 RT-PCR扩增目的基因
2.2.1 引物设计与合成 根据 GenBank和 EMBL中所报道的黑曲霉脯氨酸蛋白内肽酶基因序列,综合设
计 2条 PCR上游引物 U1、U2和 1条下游引物 D如下,由 TAKARA公司合成。
U1:5′-ATGCGTTCCTTCTCCGTTGTCG-3′
U2:5′-ATGCGTGCCTTCTCCGCTGT-3′
D:5′-TCAGGCATAATACTCCTCCACCCAC-3′
2.2.2 RT-PCR扩增 以黑曲霉总 RNA为模板,参照 BioRT逆转录扩增(RT-PCR)试剂盒(两步法)操作说
明,合成 cDNA第一链。PCR扩增体系为:PCRBufer2μl,dNTPMixture1.6μl,反转录产物 2μl,上下游引物
各 1μl,TaqDNA聚合酶 0.2μl,重蒸水 12.2μl,共 20μl。PCR反应参数为:94℃预热 5min,94℃变性 1min、60℃
退火 1min、72℃延伸 2min,进行 30个循环,最后 72℃延伸 10min。PCR反应在 PTC-200型 PCR仪上进行。
2.3 黑曲霉脯氨酸蛋白内肽酶基因的克隆
用 PCR片段胶回收试剂盒将切胶回收的 PCR产物纯化后与 pUCm-T载体连接。连接产物电转化 E.
coliDH5α,将转化菌液均匀涂在含 IPTG、X-gal、Amp的 LB平板上,37℃培养过夜,利用 α互补作用筛选阳
性克隆。随机挑取 10个白色单菌落,37℃摇床培养过夜,碱裂解法快速小量提取质粒 DNA,对重组子进行
PCR鉴定,得到阳性转化子。
2.4 序列测定
经 PCR法和酶切法双重鉴定正确的转化子质粒送 TAKARA公司进行测序,将测序结果在 GenBank上
进行比对。综合利用生物学软件 DNAMAN对 PEP序列进行同源性分析。
3 结果
3.1 黑曲霉总 RNA的提取
黑曲霉总 RNA的琼脂糖凝胶电泳检测结果(图 1)。可以看出,总 RNA样品的 28SrRNA和 18SrRNA
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条带明亮、清晰、锐利(条带的边缘整齐),并且 28SrRNA的亮度明显高于 18SrRNA,表明所提取的 RNA
样品质量较好,产物没有被 RNase降解。且 1.8
3.2 RT-PCR扩增目的基因
以所提取的黑曲霉总 RNA为模板,采用 BioRT逆转录扩增(RT-PCR)试剂盒(两步法)进行 RT-PCR扩
增反应,产物进行琼脂糖凝胶电泳,结果见图 2。以 U1和 D扩增出 1条在 1500bp和 2000bp之间的特异
性条带,其大小与预期产物(1581bp)吻合,而以 U2和 D未扩增出目的条带。
3.3 PCR产物的克隆及阳性转化子的筛选与鉴定
将以 U1和 D为引物扩增出来的 PCR产物与 pUCm-T载体连接,电转化 E.coliDH5α,随机挑取白色菌
落,用 PCR法进行快速初步鉴定,在 1500bp和 2000bp之间有 1条明显的扩增条带。用 EcoRI对重组质粒
pUCm-T-PEP进行单酶切,切出大小约为 4500bp的条带,用 EcoRI和 BglI对重组质粒 pUCm-T-PEP进行
双酶切,切下的小片段为 1580bp左右,与目的基因一致,大片段约为 2.8kb,与空质粒大小相符。说明目的
基因 PEP与质粒 pUCm-T连接成功,结果见图 3。将 PCR验证和酶切验证结果正确的阳性转化子送
TAKARA公司测序。
图 1 黑曲霉总 RNA电泳图谱 图 2 黑曲霉 PEP基因 PCR电泳图 图 3 重组质粒 pUCm-T-PEP的酶切图谱
M:1kbDNAladder 1:PCRproduct 2:pUCm-
T-PEP/EcoRI 3:pUCm-T-PEP/EcoRI+BglI
M:1kbDNAladder 1:PCR产物 1(U1和 D
为引物) 2:PCR产物 2(U2和 D为引物)
3.4 序列测定
从测序结果可知,PEP基因全长 1581bp,其中 1~1578位编码 526个氨基酸残基,1578~1581为终止
密码子(TGA),GC比例为 56.61%。1~66位碱基编码信号肽(22个氨基酸),67~1578位编码成熟肽(504个
氨基酸)。经 EXPASY数据库分析,黑曲霉 PEP成熟肽的等电点为 4.43,相对分子质量为 56.486kD,结构中
富含甘氨酸和丙氨酸,甲硫氨酸含量很少。
将获得的黑曲霉 PEP的序列与 NCBI和 EMBL报道的黑曲霉 PEP氨基酸序列进行比对,结果见图 4。
将黑曲霉 PEP氨基酸一级结构与其它来源的 PEP的一级结构进行比较,发现与已克隆的 A.
hydrophlia、F.meningosepticum和 A.punctata中 PEP的氨基酸同源性分别为 31.2%、30.4%和 35.3%。
4 讨论
以黑曲霉 A.nigerTCCC41013为材料提取其总 RNA,通过 RT-PCR扩增出大小为 1581bp的 PEP基因。
所得到的黑曲霉 PEP序列(PEPS)与 NCBI(序列号 XM001392530,PEPNS)和 EMBL(AX458699,PEPES)
所报道的序列比对结果表明,PEPS与 PEPNS的同源性为 99.75%,PEPS与 PEPES的同源性为 92.85%。
PEPS与 PEPNS相比,发生 4个碱基的突变,其中第 900位 T突变为 G,第 942位 C突变为 T,第 1578位 T
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突变为 C,此 3个碱基的突变为同义突变,氨基酸并未发生改变。而第 524位 T突变为 C,其所在的第 175
位氨基酸苏氨酸(Thr)突变为色氨酸(Trp)。虽然发生一个氨基酸的突变,但此突变并未发生在酶的活性中
心 Ser上。PEPS与 PEPES氨基酸一级结构有 20个左右氨基酸的不同,但是在组成催化三联体的 Ser(S)179、
Asp(D)458、His(H)491附近具有高度保守的氨基酸序列,活性中心 Ser附近也具有 Gly-X-Ser-Y-X-Gly这一
PEP家族的保守结构。因为氨基酸突变的位点都没有发生在活性中心附近,所以认为这些突变理论上并不
影响酶的结构和生物学活性。可见,虽然 PEP基因的获得是来自不同的黑曲霉种类,但是它们的保守性很
高,理论上对酶活不会造成影响。
黑曲霉 PEP与其它来源的 PEP氨基酸同源性比较结果分析得出,不同菌种 PEP基因的整体同源性较
低(大约为 30%~50%),但是含有活性中心的 C末端的同源性却高于 N端,组成催化三联体的 Ser(S)、Asp
(D)、His(H)附近具有保守的氨基酸序列,且活性中心 Ser附近也具有 Gly-X-Ser-Y-X-Gly这一 PEP家族的
保守结构。可以判断,在进化中 PEP基因虽然不断发生变异,但由于活性中心的保守性,保证了它们具有
图 4 A.nigerTCCC41013PEP氨基酸序列(PEP1)、A.nigerCBS513.88氨基酸序列(PEPN)和
A.nigerCBS109712氨基酸序列(PEPE)的比对
图中划线部分为信号肽序列,成熟肽的开始用箭头表示,阴影部分为活性中心
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有重要的意义。
与传统抗生素相比,昆虫抗菌肽仍然存在产量低、成本较高、活力有限、生物稳定性较低等需解决的问
题。现代基因工程技术成为有效的解决途径。由于目前对家蝇抗菌肽基因的捕获几乎都是基于同源克隆的
策略,使得已克隆得到的昆虫抗菌肽基因数量显得相对有限,尚有大量无同源性的抗菌肽基因有待发现和
克隆。此外,家蝇幼虫可能含有能用阴离子交换层析分离的阴离子肽[11,12]。阳离子抗菌肽氨基酸序列中由
于含有多个碱性氨基酸而容易被丝氨酸蛋白酶水解,从而限制了抗菌肽作为抗感染药物的体内使用,阴离
子抗菌肽或许可避免这个问题。因此,家蝇阴离子抗菌肽是进一步研究的内容。
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(上接第109页)
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相同催化性质的分子基础。因此,通过同源性比较,证实分离得到的是一种新来源的 PEP基因。
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